多重实时PCR检测沙门菌、志贺菌和致泻性大肠埃希菌

华预防医学杂志2007年11月第41卷第6期 ChinJPrevMed.November2007.Vol41，No.6 。论 著 · 多重实时PCR检测沙门菌、志贺菌和 致泻性大肠埃希菌 于新芬 潘劲草 孟冬梅 汪皓秋 张蔚 郑伟 [摘要】 目的 建立多重实时荧光PCR检测沙门菌侵袭蛋白A基因(in准夕A)、肠产毒性大肠埃希 菌(ErrEC)不耐热肠毒素基因(elt)、志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌侵袭力基因(勿aH)的方法。方法 优化多重实时荧光PCR的反应条件，检测系列10倍稀释的阳性菌DNA提取物。90份腹泻患者粪便 样品经缓冲蛋白脉水(buB毛redp即tonewater，BP)增菌6h后进行多重实时荧光PCR检测，并对阳性 标本进行菌株分离和鉴定。结果 多重实时PCR方法最低可以检测到10CFU/闪的福氏Za”01 株、1护CFu/闪的鼠伤寒沙门菌和ETEc44815株。检测腹泻患者粪便样品，。It基因阳性率为14.4% (13/90)，切aH 基因阳性率为5.6%(5/90);并从阳性样品中分离到3株。It基因阳性大肠埃希菌和 4株iPaH基因阳性大肠埃希菌。整个检测过程可在10h内完成，其中包括BP增菌6h。结论 建立了同时检测1刀次川、elt、切aH毒力基因的多重实时荧光PCR方法，具有高度的特异性，可用于沙门 菌、肠产毒性大肠埃希菌、志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌菌株的毒力基因鉴定及临床腹泻粪便标本 的快速筛检。 【关键词】 聚合酶链反应;基因;沙门氏菌属;志贺氏菌属;大肠杆菌 Mul柱Plexreal一七mePCRdetectingsdb”one撇，Shige如 anddiarrheage川cEsche门必h勿coli YU Xin- fen，PANJin一cao，对E刀‘Dong一mei，环明NC月乞。一娜u，Zhang供1，Zheng 矶云Han邵houcenterfo:Diseas。 尸r郡e耐如nand Control，Han邵hou刀0006，China CorresPol记ingautho;:PANJin一cao，E一Inail:jil嘴c口ppan@51、 com [Abstract] objec柱* Todevelopamutiplexreal一timepCRforthedetectionofsalmonellainvasion proteinA罗ne(in笼JA)，enterotoxi罗nicEscheriCh记coli(ETEC)heat一labilelenterotoxin罗ne(elt)，and Sh妙llaorenteroinvasiveE. coli(EIEC)invasiveplasmidantigenHgene(iPaH).Methods Underthe oPtimizedreactionconditionsOfthemultiplexreal一timePCR，1刀理洲，elt，andiPaHweredeterminedinlo一fold seriesofdilutionOfDNAextractedfroInSo1onella ente成aserovarTyplllmurium，E犯C44815s腼nand Sh妙llaF’30lstrain.Thethreegeneswereexaminedin90focalsamPlesfromdiarrheapatientsusingthe multiPlexreal一timePCR.WhenPCR一positivesampleswerefound，thetargetstrainswereisolatedand identified.Results Thedetectableconcentrationforthismultiplexreal一timepCRwasl0CFU/林lfor sh卿ua称olstrain，loZcF价林lfo:5.entericaserovar肠phimu‘umandErrEC科slsst面n， resPectively.0utof90fecalsamplesfrOmd1arrI1eapatients，thirteenwerefound卯sitiveforelt罗ne (14.4%)，andfivewerefoundpositiveforiPaH gene(5.6%).ThreeE.colistrainspositiveforelt罗ne andfourE. colistrainspositiveforiPaH 罗newereisolatedsuccessfullyfromthePCR一positivesamples mentionedabove.Thedetectionofi刀甩J月，eltandiPaHgeneswascomPletedinloh，whichincludedan enrichmentperiodof6h.Conc】usion Themultiplexreal一timePCRass叮 candetectin次洲，elt，娜H simultaneouslyinasinglereaction，moreover，itcandetectforvirulencegenesinstrainsofSalmonella， ErFEC，andShlgella orEIECandscreenthesePathogensinfecalspecimensI沈mpatientswithdiarrheawith ahighspecificity. [Keywords]polymerasechainreaction;Genes;salmOnella;从igella;&che二hiacoli 沙门菌是引起食源性疾病和伤寒的主要病原 菌，常通过污染的食品和水源传播。沙门菌毒力岛 基金项目:杭州市科技发展 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 资助课 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 (2003133B35) 作者单位:31以X)6杭州市疾病预防控制中心微生物检验科 通讯作者:潘劲草，Email:jingcaopan@sin‘com sPI一l(又称1二一sPa位点)在沙门菌中普遍存在，编 码沙门菌对宿主细胞的侵袭力所需的蛋白川，其中 跨膜蛋白InvA基因(inl)A)常用作沙门菌分子鉴定 的靶基因[2“〕。志贺菌引起的细菌性痢疾是发展中 国家的主要的肠道传染病之一，志贺菌分四群且血 清型众多。志贺菌和肠侵袭性大肠埃希菌 ·462· 中华预防医学杂志2007年11月第41卷第6期 ChinJPrevMed，NovelnberZo07，vol41，No.6 (。nteroinoas动。&che儿chiacoli，EIEC)的侵袭性主要 由毒力质粒所介导，检测侵袭性质粒抗原基因H (iPaH)是鉴定侵袭力的简便、有效方法之一，可用 于鉴定志贺菌和EIEC〔‘石〕。肠产毒性大肠埃希菌 (enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)主要引起婴 幼儿和旅游者腹泻，elt基因编码的不耐热肠毒素 (heat一Iabileenterotoxin，LT)是其重要的致病因子 之一[“]。 目前所使用的沙门菌、志贺菌、EIEC和ETEC 等致病菌的常规分离培养、生化反应、血清学鉴定和 PcR技术等[4巧，7〕检测方法操作烦琐、易污染，且目 前常规培养方法无法在培养基上简便区分ETEC、 EIEc和其他大肠埃希菌。本研究建立了多重实时 荧光PCR(Real一timePCR)方法，在同一PCR反应管 实时检测inZ)A、elt和勿aH基因，可应用于沙门菌、志 贺菌、EIEc和产LT 的ETEC菌株毒力基因的鉴定 及临床标本的快速筛检。 材料与方法 1.菌株来源及样本:参与实验的菌株共有75 株，其中70株为本实验室自主分离鉴定或保存，包 括19株沙门菌、39株志贺菌、11株大肠埃希菌菌株 (包含有ETEC和EIEC)和1株构椽酸杆菌;另外， 2株大肠埃希菌(菌株号分别为44814，44815)和 1株鼠伤寒沙门菌501巧株购于中国医学细菌保藏 管理中心，1株福氏Za型志贺菌(301株)和1株布 表1 实验菌株及毒力基因 细菌 血清型 菌株数 in里滋 elt 巾aH 沙门菌 斯坦利沙门菌(5.entericaserovarst词ey)(salnzonellaenterica) 阿贡纳沙门菌(5.entericaseovarA即na) 肯塔基沙门菌(5.entericaserovarKentucky) 鼠伤寒沙门菌哥本哈根变种(5.ente瓦caserovar介phimuriumvar.copenh略en) 纽波特沙门菌(5.entocaserovarNewport) 山夫顿堡沙门菌(5.entericaserovarsenftenbe飞) 甲型副伤寒(5。nte二aserovarl、ratyPhiA) 沙门菌11型(salmonellaH) 伦敦沙门菌(5.。时e二 serovarLondon) 圣地亚哥沙门菌(5.。nte成aserovarsandiego) 布伦登卢普沙门菌(柳512)(5.ente八caseovarBraenderup) 伤寒沙门菌(产HZS)(5.ente二aserovarTyphi) 肠炎沙门菌(5.。心e二 serovarEnteritidis) 鸭沙门氏菌(5.e耐e成aserovarAnatum) 火鸡沙门菌(5.。nterzcaserovarMelea，dis) 伤寒沙门菌(5.。ntericaserovarT”〕hi) 鼠伤寒沙门菌(5.e砍瓦caserovarTyphimoum) 明斯特沙门菌(5.e耐ericaserovarMuenster) 猪霍乱沙门菌(5.entericaserovarCholeraesuiS) 婴儿沙门菌(5.。nte而caserovarlnfantis) 弗劳地构椽酸杆菌(Citrobacter介undii) 福氏志贺菌 福氏lb (shlgella刀。ne司 福氏Za 福氏Zb 福氏4a 福氏4c 宋内志贺菌(Sh哪llasonnei) 大肠埃希菌 肠侵袭性大肠埃希菌0164 (&cherichiacoli) 肠侵袭性大肠埃希菌028 肠侵袭性大肠埃希菌0143 肠侵袭性大肠埃希菌0152 肠侵袭性大肠埃希菌血清型未知(03002) 肠产毒性大肠埃希菌078(LT+sT十) 肠产毒性大肠埃希菌06(LT+ST+) 肠产毒性大肠埃希菌06(LT一ST一) 肠产毒性大肠埃希菌Ol48(LT+ST+) 肠产毒性大肠埃希菌血清型未知(LT+ST一) l + ?? ?? l1 l2 6 l 1 l l 1 1 l 4 1 l 中华预防医学杂志2007年n月第41卷第6期 ChinJPrev Med，November20盯，丘1盛1，坦垦堕 伦登卢普沙门菌(H9812株)由中国疾控中心传染 病预防控制所惠赠。菌株血清型及毒力基因见表1。 90份肛拭子样品来源于2006年8月杭州市第一人 民医院和浙江省儿童医院就诊的腹泻病人。45份 食源性疾病标本于2006年由杭州各区县疾控中心 送检，其中病人肛拭子犯份，食物1份，呕吐物 12份。 2.引物和探针:引物及探针见表 2，根据 TaqMan复合荧光探针设计原则设计。引物由上海 生工公司合成，探针由大连TaKaRa生物公司合成。 3.多重实时PCR方法的建立:荧光定量PCR 仪为RotorGene公司产品，型号为RG一3000。用矩 阵法优化引物、探针和MgC12浓度。PCR反应试剂 为TaKaRa生物技术公司的EXTaq酶。反应体积 为25林1，含lx反应缓冲液、MgC123.ommoFL、 dNTPS各0.ZmmoFL、3对引物各0.4林moFL、3条 探针各0.24卜moFL、ExTaq酶25U/nil。反应程序 为:95℃3min变性后，以94℃155、58℃455进 行45个循环。于58 ℃检测FAM、HEX和ROX通 道的荧光信号。 4.多重实时PcR方法的检测限:将过夜培养的 鼠伤寒沙门菌、ETEC44815株和志贺菌福氏Za F301株10倍系列稀释，采用稀释平板法进行定量， 系列浓度分别为lxloo一105cFU/闪，取上述系列 稀释液lml，离心去上清，加人100林1缓冲液「10 mmoFLT五5一HCI，0.lmmoFL乙二胺四乙酸 (EDTA)，pH==8.0〕，100℃煮沸lomin，离心各取 1国上清做 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 ，以多重实时PCR方法检测。同时 进行单重实时PCR检测，即加人1种引物和探针， 其余条件与多重法相同。 5.多重实时PCR的特异性检测:用优化后的多 重实时PCR检测方法对21株沙门菌、8株ETEC、40 株志贺菌、5株EIEC血清型大肠埃希菌和1株拘椽 酸杆菌进行in理月、elt、iPaH毒力基因的检测。 6.多重实时PCR方法直接检测腹泻病人肛拭 子样品和食源性疾病样品:将90份腹泻患者肛拭子 和45份食源性疾病样品分别接种于4ml BP增菌 液，37℃20Or/min增菌6h，煮沸法提取DNA，离 心取上清1闪作为多重实时PCR的模板。同时将 样品分别划线麦康凯平板和55平板上，每平板挑取 4一6个可疑菌落接种三糖铁斜面，进行生化鉴定、 血清凝集和多重实时PCR检测。 多重实时 PCR结果呈阳性的标本进行普通 pCR验证，反应条件为94℃3min，94℃155，54℃ 155，72℃305进行30个循环，72℃延伸Zmin。 扩增elt和iPaH的引物分别参考文献报道[‘习〕，序列 见表2，扩增片断长度分别为322bp和620bp。 结 果 1.多重实时PCR检测限:多重实时PCR检测 系列稀释的菌液:iPaH PCR系统可以检测到10 CFU/林1的福氏ZaF301株，in乞滋和eltpCR系统可 以检测到10，CFu/国的鼠伤寒沙门菌和ETEC 448巧( 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线见图1)。单重实时PCR检测3个 基因均可检测到10CFU/闪的目标菌株。 2.多重实时PCR检测的敏感性和特异性:用优 化后的反应条件对本实验室保存的21株沙门菌、 8株ETEC、40株志贺菌、5株EIEC血清型大肠埃希 菌和1株拘椽酸杆菌进行了实时PCR检测，阳性和 阴性符合率为100%(血清型及毒力基因见表1)。 部分菌株检测曲线见图2。 3.对食源性疾病样品和腹泻病人粪便样品进 表2 引物和探针的核酸序列 引物或探针 in、诱1866 in勺A1970 invA1897P ltl3lF lt24OR lt209P iPaH1382F iPaH1485R iPaH1413P iPaHF iPaHR LT 1 LI】2 序列(5’神3’) TGCTCAACI丁GAGGATRTTATr(:(R=GorA) CTAAT〔;AGATCCATCAAATfAGCG FAM一ATCCGTCAGACCTCTGGCA(;TACC一ECUPSE GGCAlrAATGAGTACI，1，CGATAGAG ACTGGAAACATATCCGTCATCA HEX一AAGCCGGI，rl，Grl，Clrl，CCTCTCGC一ECLllSE TGAAGGAAATGCGTrrCI以TGG CCAGTCCGTAAATrCAll，1，CTCTI， ROX一ACTGACAGCAAATGACCTCCGCA一ECLIPSE C】TCC】，】，GACCGCCTI，1，CCGATACCCI】，C GCCGGTCAGCCACCCTCTGAGAGTAC TCTCTATC」，GCATACG〔洪GC CCATACTCAr叮CCCCCAAT 核酸位置 1866一1888 1970一1947 1897一1920 131一154 240一219 209一187 1382一1403 1485一1463 1413一1435 957一84 1576一1551 886一05 1207一1189 基因库登录号 M90846 M90846 M90846 Af242417 Af242417 Af242417 M76445 M76445 M76445 AY206449 AY206449 560731 欣30731 参考文献 本研究 本研究 本研究 本研究 本研究 本研究 本研究 本研究 本研究 文献仁9] 文献[9」 文献仁8] 文献[8] ·464· 中华预防医学杂志2007年11月第41卷第6期 ChinJPrevMed，November2007，Vol41，No.6 行检测:90份腹泻病人肛拭子经BP增菌6h后煮 沸法提取DNA模板进行多重实时PCR，其中13份 样品为elt基因阳性，阳性率为14.4%，5份样品为 iPaH基因阳性，阳性率为5.6%;8起食源性疾病事 件共有45份粪品，其中1份样品为elt基因阳性， 1份样品为勿aH基因阳性。对实时PCR阳性的样 品进行普通PCR鉴定，符合率为100%。 直接实时PCR阳性的样品，挑取5个菌落经同时进 行血清凝集和实时PCR检测，其中3份样品分离到 elt基因阳性菌株，经API鉴定系统鉴定均为大肠埃 希菌;4份样品分离到iPaH 基因阳性菌株，经API 鉴定系统鉴定均为大肠埃希菌。 FAM 7.0 6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2。5 ? ? ? ? ? ? 循环数 HE X???? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ?? ? ?? ? ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ，? ? ? ? ?? ? ?? ? ?? ? ? ， ? ? ? ?? ?? ??? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? … … ， ? ?? ? ? ， ?， ? ?? ??? ??? ? ? ??? ， ? ，? ， ? ? ?? ? ? ? 循环数 HEX ? ? ? 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 ? ? ? 0.4 0.2 多‘--口----Jwe-— 上一一一口一一一一口— ，J-— 习一一一一一上一一一一 5 10 15 20 25 30 35 40 循环数 ROX ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ?? ? ??? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? … … ? ?? ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ，? ?? ， ? ? ? ? ? 循环数 ? ???? ? ????? ROX ? ? ? ? ? ? 三一--』一一一一口— 上一一一一上一---口一一一一一J一 一一J一一一一J— 5 10 15 20 25 30 35 40 循环数 ?? ?? ? ? ?? ?? ?? ?? ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ???? ? ? ? ? ? ? ? … … ?? ?? ?? ? ? ? ? ?? ， ? ? ? ??? ??? ?? ? ? LO扛‘一-占一一一」一一-于 一一一‘一一山-一 --~ 5 10 15 20 25 30 35 40 循环数 FAM通道检测inZ)A基因信号，曲线循环阐值(Ct值)从 低到高均分别为lxl护一100CFU/闪的鼠伤寒沙门菌 的检测曲线;HEx通道检测elt基因信号，曲线Ct值从 低到高均分别为1/105一loocrtJ/卜1的E化c科515 检测曲线;ROX通道检测IPaH基因信号，曲线Ct值从 低到高均分别为lxl05一10oCrtJ/卜1的福氏2。”01 菌株检测曲线 图1 多重实时PCR方法检测in企讨、elt和，aH基因的 标准曲线图 直接实时PCR阴性的样品，经接种三糖铁斜面 菌株的血清凝集和生化鉴定，目的菌株分离为阴性。 FAM通道检测inl川基因信号，图中产生阳性信号的菌 株均为沙门菌;HEX通道检测。It基因信号，图中产生 阳性信号的菌株为LT+ETEC;ROX通道检测加aH基 因信号，图中产生阳性信号的菌株分别为切aH+EIEc 和志贺菌 图2 多重实时PCR方法检测1刀份1、elt和动aH 基因的 实时检测图 讨 论 沙门菌、志贺菌、ETEC和EIEC均为我国常见 的肠道致病菌。实时PCR敏感性高和特异性强，操 作简便快速。国外已经采用实时PCR检测肠道致 病菌毒力基因，J。山ikumar等仁‘。〕和wang等[川应用 SYBRGreen两重实时PCR从生肉制品中检测了沙 中华预防医学杂志2007年11月第41卷第6期 ChinJPrevMed，November2007，vol41，No.6 门菌的in望)A基因和单增李斯特菌的hlrA 基因; Reischl等仁8]应用两重实时pcR检测了ETEC的LT 基因和耐热肠毒素(sT)基因;vu等〔‘2〕应用单重实 时PCR从病人肛拭子标本中的检测志贺菌动aH 基 因。实时PCR检测细菌的检测限因核酸提取方法、 探针类型和具体操作有所不同也存在一定的差异， Reischl[’]等和Ibekwe[‘，」等报道的检测限约为10 CFU/闪。本研究设计了检测1耐、elt和勿aH3个毒 力基因的引物和探针，进行多重实时PCR检测， iPaH基因多重实时PCR系统可以检测到10CFU/闪 的目标菌株，与单重实时PCR具有相同的检测限。 in汹和elt基因多重实时PCR系统检测到102cFu/ 闪的目标菌株，较其单重实时PCR检测限低，但本 方法可在同一个PCR管内检测3个毒力基因，提高 了检测效率，降低了检测成本，适合用于菌株的鉴定 及大规模样品的筛选。 近来将沙门菌属分为2个种:肠沙门菌(5. enterica)和邦戈沙门菌(5.bongori);肠沙门菌中又 分为6个亚种〔‘4〕。邦戈沙门菌(即先前分类的沙门 菌亚种v)的1耐 序列与肠沙门菌的差异较大〔‘〕。 本研究设计的扩增in笼)A基因的引物和探针未能与 邦戈沙门菌in泛)A序列完全吻合，不能排除部分邦戈 沙门菌不能被检出的情况。但沙门菌属中，肠沙门 菌亚种1通常来自人类和温血动物，而肠沙门菌其 他亚种和邦戈沙门菌主要来自冷血动物和环境。本 研究检测沙门菌ilzvA应当足以满足细菌性食源性 疾病及临床腹泻标本检验所需。本实验中对21株 不同血清型别的沙门菌和其他肠杆菌细菌检测，阳 性和阴性符合率均为100%。 本研究初步将建立的多重实时PCR应用于直 接检测粪便标本。检测90份腹泻病人肛拭子标本 有较高的阳性率，13份标本为elt基因阳性，5份标 本为勿aH基因阳性。从这些阳性标本中，有3份标 本分离到elt基因阳性大肠埃希菌株(3/13)，有4份 标本分离到勿aH基因阳性大肠埃希菌株(4乃)。此 结果进一步说明实时PCR较常规菌落分离鉴定方 法敏感。 使用多重实时PCR方法，在一个PCR管内特 异地检测inZ)A、elt和iPaH毒力基因，可用于沙门菌、 产LT的ETEC、志贺菌和EIEC菌株的鉴定和检测 及食源性疾病和临床腹泻标本的快速筛检，可在 roh(内含BP增菌的6h)内判定标本内有无相关 毒力基因的菌株，且可对致病菌的含量作出评估，为 突发卫生事件中致病菌的分离鉴定和溯源提供强有 力的线索，也可用于食品和水源的卫生监测和流行 病学调查及食品行业从业人员的健康体检等。 参 考 文 献 [1〕B叮dEF，UJ，och二 H，et吐.Comparative罗neticsoftheinv- sPainvasiongene comPlexOfSalmonella enterica- JBacteriol， 1997，179:1985一1991. 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