叶绿素含量测定[最新]
叶绿素含量的测定(分光光度法)
根据朗伯-比尔(Lambert-Beer)定律，某有色溶液的吸光度A值与其中溶质浓度C以及光径L成正比，即A,aCL(a为该物质的吸光系数)。各种有色物质溶液在不同波长下的吸光值可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下的吸光度的总和，这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体色素提取液中叶绿素a、b含量，只需测定该提取液在2 个特定波长下的吸光度度值，并根据叶绿素a与b在该波长下的吸光系数即可求出各自的浓度。在测定叶绿素a、b含量时，为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单色光的波长应选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
已知叶绿素a、b的80 ,丙酮提取液在红光区的最大吸收峰分别为663nm 和645nm，又知在波长663nm下，叶绿素a、b在该溶液中的比吸收系数分别为82.04 和9.27，在波长645nm下分别为16.75和45.60，可根据加和性原则列出以下关系式:
A663=82.04Ca +9.27Cb………………(1)
A645=16.75Ca+45.6Cb………………(2)
式中A663、A664分别为波长663nm和645nm处测定叶绿素溶液的吸光度值;Ca、Cb分别为叶绿素a、b的浓度(g/L)。
解联立方程(1)、(2)可得以下方程:
Ca=0.0127A663-0.00269A645…………(3)
Cb=0.0229A645-0.00468A663…………(4)
如把叶绿素含量单位由g/L改为mg/L，(3)、(4)式则可改写为:
Ca(mg/L)=12.7A663-2.69A645…………(5)
Cb(mg/L)=22.9A645-4.68A663…………(6)
叶绿素总量CT(mg/L)=Ca+Cb=20.2A645+8.02A663……(7)
叶绿素总量也可根据下式求导
A652=34.5×CT
由于652nm为叶绿素a与b在红光区吸收光谱曲线的交叉点(等吸收点)，两者有相同的比吸收系数(均为 34.5 )，因此也可以在此波长下测定一次吸光度(A652)求出叶绿素总量:
CT(g/L)=A652/34.5
CT(mg/L)=A652×1000/34.5………(8)
因此，可利用(5)、(6)式可分别计算叶绿素a与b含量，利用(7)式或(8)式可计算叶绿素总量。
一、仪器、药品与材料
(一)实验材料
不同生境的新鲜植物叶片。
(二)仪器与用品
分光光度计，天平(感量0.01g)， 研钵，漏斗，量筒，滤纸等。 (三)试剂
,(丙酮。
2(80,丙酮:取80 mL纯丙酮加入20 mL蒸馏水混匀即得。
3(石英砂。
4(无水CaCO。 3
二、实验步骤
1(叶绿体色素溶液提取:选取不同生境下生长植物的成熟叶片按照实验七-I中方法用80%丙酮进行提取。
2(测定吸光度值:以80%丙酮作为参比溶液，分别在652nm、663nm和645nm处测定叶绿体色素提取液(浓度大时需稀释)的光吸收值。
3(计算:把测得的光吸收值代入上述5、6、7 和8等公式计算出叶绿素a、b和叶绿素总量。在计算时需要考虑稀释因子。
一、材料、仪器、药品
1(材料:植物绿色叶片。在本实验中利用光合速率测定实验中取回室内的绿色半叶和黄色半叶为试材。
2(仪器:(1) 分光光度计;(2)天平;(3) 研钵;(4) 滤纸;(5) 漏斗;(6) 5ml移液管;(7) 打孔器;(8)滴管;(9)剪刀;(10)25ml容量瓶;(11)毛刷;(12)擦镜纸。
二、方法
1(取样:用毛笔或毛刷清除叶片
表
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面的灰尘，用打孔器从绿叶和黄叶上各-2打取0.25dm的叶圆片，立即称重，剪碎后放入研钵中。(在正规实验中应各重复3次，本实验为减少丙酮向环境中的排放，故不设重复)。注意取样时要避开大的叶脉。如果需要计算叶片干样叶绿素含量，另取一份相同样品置于烘箱中烘干，用于测定干重。
2(研磨提取:向研钵中加入80%丙酮2.5ml，以及少许CaCO (中和酸性，3防止叶绿素酯酶分解叶绿素) 和石英砂，研磨成匀浆，再加入3ml 80%丙酮，继续研磨至组织变白，在暗处静止3,5min后，用一层干滤纸过滤到25ml容量瓶中，用滴管吸取80%丙酮将研钵洗净，清洗液也要过滤到容量瓶中，并用80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素，待滤纸和残渣全部变白后，用80%丙酮定容至刻度。
3(读取吸光度:取厚度为lcm的洁净比色皿，注意不要用手接触比色皿的光面，先用少量色素提取液清洗2,3次，注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分，然后将色素提取液倒入比色皿中，液面高度约为比色皿高度的4/5，将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉(注意不能擦)，再用擦镜纸擦干擦净。将比色皿放入仪器的比色皿架上，注意不要将溶液撒入仪器内。第一个位置放盛有80%丙酮的比色皿，做为空白对照。将仪器波长分别调至663、645、652nm处，
以80%丙酮做为空白对照调透光率100%，分别测定溶液在上述三个波长下的吸光度。每个样品重复测定3次。注意，每次在转换波长时，都要用80%丙酮调透光率100%。
4(结果计算:将645、663、652nm处测得的吸光度代入公式(3)、(4)、(5)、(6)中计算叶绿素a、b浓度和总浓度。再将叶绿素a、b浓度和总浓度代入公式(7)中求出所测材料单位重量或单位面积的叶绿素a、b含量和总含量。
三、实验结果记录
1(实验材料:
植物名称:
种植地点:
发育时期:
试验处理:
植物的生长状况:
取样时间:
取样部位及数量:
2(测定地点:
3(测定时间: 年 月 日 时 分 至 时 分
4(测定条件记录:
5(数据记录及结果记载:
表1 测定数据记录及计算结果
2光密度 叶绿素含量 mg/g FW 或mg/dm
重复 Chla+b Chla+b 645nm 652nm 663nm chla chlb Chla/chlb 公式(5) 公式(6)
1 绿 2
3 叶
平均值
标准差
1 黄 2
3 叶
平均值
标准差
注:本实验中由于数值都来自同一样品，所以平均数和标准差计算只作为练习。
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