酵母双杂交系统的原理及发展_cropped

酵母双杂交系统的原理及发展_cropped ()Vol . 3 No14 第 3 卷 第 4 期 综合版漯河职业技术学院学报 2004 年 12 月 ( )Journal of Luohe Vocational and Technical College Comprehensive Dec12004 酵母双杂交系统的原理及发展 张 胜 ()漯河职业技术学院 ,河南 漯河 462002 摘要 :酵母双杂交系统是研究蛋白质相互作用的一种有效 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 。本文主要介绍酵母双杂交系统的原理和新的发展 , 对其应用及存在的问题也作简要阐述 。 关键词 :酵母双杂交 ;蛋白质 ;相互作用 () 文章编号 :1671 - 7864 200404 - 0006 - 03 中图分类号 : TS26 文献标识码 :A 分子生物学技术的发展和人类基因组 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 的完成 ,使人 GGY - 171 菌株 ,该菌株含有 LacZ 报告基因 ,并已去 成酵母 类对基因的结构和功能的认识日益加深 。但基因的功能最 除相应转录因子基因 。实验结果由于 Snfl 和 Snf4 相互作用 终由其编码的蛋白质来体现 ,蛋白质之间的相互作用是生命 使得 AD 和 BD 在空间上接近 ,激活了报告基因 LacZ 的转录 。 ( ) 现象的基础 ,因而 ,以研究蛋白质功能为目的的蛋白质组计 一般地 ,将 DB - X 的融合蛋白称作诱饵 bait, X 往往是已知 ( ) () 划越来越得到重视 。酵母双杂交 yeast two hybrid技术是利 蛋白 ,AD - Y 称作猎物 prey,能显示诱饵和猎物相互作用的 用酵母遗传学方法分析蛋白质之间的相互作用 ,其可行性 、 基因称报告基因 ,通过对报告基因的检测 ,反过来可判断诱 有效性在验证已知蛋白质之间的相互作用或筛选与靶蛋白 饵和猎物之间是否存在相互作用 。根据这一原理 ,双杂交系 特异作用的候选蛋白的研究中已被证实 ,并被推广到了诸如 统通过简便的酵母遗传分析 ,对报告基因表型进行检测 ,即 细胞周期调控 、信号传导 、肿瘤基因表达等多个研究领域 。 可实现对于蛋白质间相互作用的研究 。 作为一种分析蛋白质与蛋白质之间相互作用的简便而 1 酵母双杂交技术的原理和应用 有效的研究体系 , 酵母双杂交的最大的优点是不需要分离 1 酵母双杂交技术由 Fields 等人于 1989 年提出 ,该技术 纯化蛋白质 ,整个过程只是对核酸进行操作 ; 同时充分利用 利用了酵母转录因子 GAL4 性质 。GAL4 包括两个彼此分离 酵母生长速度快 、易于操作的特点 。它主要应用在以下几个 但功能上必需的结构域 ,一个是位于 N 端 1 - 174 位氨基酸 方面 : ?用于验证通过其他方法发现的蛋白质之间是否有相 () 残基区段的 DNA 结合域 DNA Abinding domain ,DNA - BD,另 互作用 ; ?确定已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构 一个是位于 C 端 768 - 881 位氨基酸残基区段的转录激活域 域 ; ?筛选文库以得到与已知蛋白质存在特异相互作用的候 () Activation domain ,AD。DNA - BD 能够识别 GAL4 效应基因 选蛋白质 。双杂交体系自身所具有的特点使其从 cDNA 文库( ( ) GAL4 —responsive gene的 上 游 激 活 序 列 Upstream activating 和基因文库中直接筛选出蛋白质间相互作用由此而鉴定的 ) (sequence ,UAS,并与之结合 。而 AD 则通过与转录机器 tran2 各种受体 、转录因子 、蛋白激酶 、磷酸化酶 、细胞骨架蛋白以 ) scription machinery中的其他成分之间的作用 ,启动 UAS 下游 及参与细胞周期调控 、肿瘤发生等恶性疾病的蛋白质已不胜 3 - 8的基因进行转录 。DNA - BD 和 AD 单独作用均不能激活转 。 枚举 录反应 ,只有当二者在空间上充分接近并呈现完整的 GAL4 2 双杂交系统的缺陷 转录因子活性时 ,方可激活 UAS 下游启动子 。 尽管酵母双杂交系统已被证实是分析蛋白与蛋白间相 Fields 等人根据 GAL4 的上述性质建立了一个双杂交系1 。该系统中转录激活的条件是蛋白质作为一个整体起 互作用的有效和快速的方法 ,有着多方面的应用 ,但仍存在 统 作用 ,分别经分子克隆技术在 同 一 细 胞 中 表 达 的 BD 和 AD 一定的局限性 。首先 ,它并非对所有蛋白质适用 ,这是由其 多肽不会彼此间发生作用 。但 BD 和 AD 分别可以同其他蛋 原理所决定的 。双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于 白质 X 或 Y 结合形成杂种蛋白 ,如果 X、Y 之间可以形成蛋 核内 ,而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工 ,如糖基 白 —蛋白复合物 ,使 GAL4 两个结构域重新构成 AD 和 BD 成 化 、二硫键形成等 ,这些反应在核内无法进行 。另外 ,有些蛋 为一体 ,启动特异基因序列的转录 。他们利用 Snfl 与 Snf4 的 白的正确折叠和功能有赖于其它非酵母蛋白的辅助 ,这限制 相互作用 ,将 Snfl 与 DB 融合 ,Snf4 与 AD 融合 ,构建在穿梭质 了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究 。虽然目前 粒上 。其中 Snfl 是一种依赖于丝氨酸 、苏氨酸的蛋白激酶 , 已经在表达质粒中插入了核定位序列 ,但也不能排除有些必 Snf4 是它的一个结合蛋白 。研究者将这两种穿梭质粒转化 须在胞质中进行翻译后加工修饰的蛋白 ,尤其是胞外蛋白不 收稿日期 :2003 - 07 - 27 () 作者简介 :张 胜 1962 - ,男 ,河南新蔡县人 ,漯河职业技术学院高级讲师 。 9 原来繁琐的从酵母中提取出单一质粒的工作变得轻松快捷 。 能进入核内 ,有时也会因产生错误构象而影响筛查结果。 ,将融合蛋白置于一些可被诱导的启动子调控之下 ,使 其次 其次 ,是假阳性的发生 。Vidalain 等人将筛库过程中 遇 到 的 10 17 假阳性分为两类:一类是“生物学”上的假阳性 ,即蛋白质 其表达量能根据需要进行调控。再者 , 双杂交中 一 般 将 与蛋白质的相互作用在酵母细胞中发生 ,但是在其生物体细BD 或 AD 与作用蛋白质的 C 端及作用蛋白质的 N 端连接 ,由 胞内并不发生相互作用 。这主要是因为两种蛋白不同时表 于蛋白质的 N 端和其活性也有很大关系 ,对于常规连接找不 18 到作用蛋白的对象 ,也可改用 N 端连接。达或者二者根本不在同一组织中 。这种假阳性 ,我们如果对 所研究的蛋白质的生物学特性没有深入了解的话 ,是很难排 () 4筛选文库的优化 。用于双杂交筛选的文库除了有代表 除的 。另一类是“技术上”的假阳性 ,即由于双杂交技术上的 每一基因的足够丰富的多样性以外 ,由于蛋白质间发生作用的 局限而鉴定出的蛋白质与蛋白质间的相互作用 。这类假阳 位点可能为蛋白质多肽链的任意位置 ,因而对每一基因而言 ,还 11 性包括筛库过程中自发升高的 BD - Y 融合蛋白自我激活导 应当提供尽可能多的与 AD 连接的位点。为了尽量避免非特 致的假阳性 、AD - Y融合蛋白与多个 BD 融合蛋白的表达均异结合所导致的假阳性的增多 ,插入的片段也不宜过大 ,选用更 可激活报告基因转录导致的假阳性 、BD - Y 融合蛋白不存在 适宜的限制性内切酶以构建适用于双杂交体系的文库 ,这是综 合提高双杂交技术的一个重要方面 。的情况下 AD - Y融合蛋白单独激活报告基因导致的假阳性 11 () ( ) 以及酵母中其他蛋白质作用引起的假阳性等。有 时 , 由5逆双杂交系统 reverse two - hybrid system的出现 。在 于在某些酵母菌株中大量表达外源蛋白质 ,常会带来毒性作 实际工作中 ,有时需要通过突变加抑制剂等手段破坏蛋白质 间的相互作用 ,来研究蛋白质的结构功能特点和作用方式 。 用 ,影响菌株生长和报告基因的表达 。而在培养中添加 3 - 19 () Vidal 等人的逆双杂交系统就是适应这一 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 而建立的 。AT3 - Aminotriazole或 6 - Azauracil 可抑制背景表达 ,但这些 添加物对菌株也有一定毒性 ,从而使一些蛋白质间较弱的相 该技术的关键是报道基因 URA3 的引入 ,URA3 编 码 尿 嘧 啶 12 () 合成过程中的一种关键酶 ,此酶可将 5 - 氟乳清酸 5 - FOA互作用可能会因此而被掩盖。应该注意的是 , 虽 然 双 杂 交系统可筛选出大量蛋白质相互作用 ,但其中部分蛋白质在 转化为对细 胞 有 毒 的 物 质 , 因 而 在 系 统 中 起 到 反 选 择 的 作 生理状态下可能不发生相互作用 ,双杂交只是反映蛋白质间 用 。Vidal 等人在 URA3 基因的启动子内引入 Gal4 的结合位 能发生作用 的 可 能 性 , 这 种 可 能 性 还 必 须 经 过 其 他 实 验 验 点 ,改造后的酵母菌株在缺乏尿嘧啶的选择性培养基上 ,只 证 ,尤其要与生理功能研究相结合 ,否则可能会误入歧途 。有当“诱饵”和“猎物”相互作用激活 URA3 基因的表达才能生 长 ;而在含有 5 - FOA 的完全培养基上 “, 诱饵”和“猎物”的相 3 酵母双杂交体系的新发展 互作用会抑制细胞的生长 。如果目的蛋白发生突变或因外 近年来 ,双杂交系统在被广泛应用中不断得到改进 ,其 加药物的干扰不再相互作用 ,URA3 基因不表达 ,细胞则能在灵敏度和特异性得到了显著提高 。这些发展主要体现在以 含有 5 - FOA 的完全培养基上生长 。因此 , 可通过筛选 5 - 下几个方面 。 FOA 抗性克隆从随机突变库中鉴定阻断蛋白相互作用的突 () 1根据酵母的营养缺陷 ,发展了多重筛选机制 。位于 变体 。通过这种方法 ,Vidal 等人筛选到了丧失 DPI 蛋白的结 报告基因上游的启动子是决定报告基因表达灵敏性和特异 性的最重要因素 ,酵母双杂交系统最初仅采用 p —半乳糖苷 合能力但仍可结合阳的转录因子 E2F1 的突变物 ,并发现了 酶这一单一的报告基因体系 ,常常不能十分严谨地控制报告 E2F1 的新 DPI 结合位点 。基因的表达 ,灵敏度也不高 。容易产生假阳性 ,随后 ,大多数 () 6将蛋白的相互作用场所从核内移至细胞膜 。为了克服 酵母双杂交系统利用酵母营养缺陷特点引入额外的报告基 13 双杂交系不能研究大量非核内蛋白 ,如膜受体 、细胞外分泌蛋白 因 ,如较早发展起来的 Y190就采用了 GALl - HIS3 、GALl - 20 (等的局限 。Aronheim 等人构建了 Sos 恢复系统 Sos recruitment LacZ 双重报告基因 ,其中启动子 GALl 由包含转录因子 Gal4 ) 的 BD 特 异 识 别 位 点 的 上 游 激 活 序 列 UAS 和 基 础 启 动 子 system ,SRS,将蛋白间相互作用场所从核内转移到酵母细胞膜 () minimaipromoter组成 。营养筛选适宜作为初筛处理大量筛 () 上 。人的鸟苷酸交换因子 guanyl nucleotideexchangefactor , GEF- 查对象 ;颜色筛选则可对杂合蛋白复合体转录激活功能作进 Sos 蛋白是一种胞质蛋白 ,而酵母的对应物 cdc25 蛋白是膜蛋白 , 一步验证 ,易于排除部分假阳性 。 可将相关受体信号传递给 Ras 蛋白 。酵母的一种温度敏感 - ras() 2有性生殖过程中涉及两种配合类型 :a 接合型和 ɑ接 途径突变体由于缺乏 cdc25 ,不能将外来信号传递给 Ras 蛋白 ,在合型 。这两种单倍体之间接合能形成二倍体细胞 。根据酵 14 ) (母有性生殖这一特点 ,Bendixen 等人将酵母接合型引入双 36 ?的温度下不能存活 。引入正常的 GEF Sos 蛋白,并使其能 杂交体系 ,将文库质粒转化成 ɑ接合型酵母细胞 “, 诱饵”表 与 Ras 蛋白足够接近 ,可以补偿该缺陷 。为此 ,Aronheim 等人将 达载体转化 ,a 接合型细胞 , 分别铺筛选平板使 待 长 成 菌 苔 GEF 蛋白与蛋白 X 融合 ,将蛋白 Y与豆蔻酰化信号相连 ,使 Y定后 ,将这两种菌苔复印到同一三重选择平板上 ,只有诱饵和 ( ) 位于膜上 ,若 X 与 Y结合 ,X 连接的蛋白 GEF就会定位于膜上 ,靶蛋白发生相互作用的二倍体细胞方能在此平板上生长 ,单 从而得以靠近膜上的 Ras 蛋白 ,激活 Ras 途径 ,完成 Sos 过程 ,在倍体细胞或 DB 融合蛋白和 AD 融合蛋白不相互作用的二倍 36 ?情况下生长 。该系统大大扩展了经典杂合系统的探索领 β体细胞都被淘汰 ,阳性克隆经- 半乳糖苷酶活力进一步鉴 定 ,既简化了实验操作 ,也提高了筛选效率 。Fromont - Racine 域 。Aronheim 等利用这一系统找到了 c - J un 的两个新的作用蛋 白 JDP1 和 JDP2。 () 7初步建立了哺乳动物细胞双杂交系统 。为了更好地 研究蛋白质生物学功能 ,需要有一个类似于生理环境的蛋白 质合成 、加工及反应体系 ,这种需求使双杂交体系扩展到哺 15 则 直 接 把 这 两 种 细 胞 在 滤 膜 上 混 合 后 铺 选 择 性 平 乳动物细胞 。在哺乳动物细胞双杂交系统中 ,用单纯疱疹病 等人 板 ,避免了繁琐的复印操作 ,进一步提高了工作效率 。 毒的 VPl6 编码区取代 GAL4 的 AD 区段 ,同时又引入一个含 () ( ) 3表达载体构建的改进 。首先 ,双杂交体系中不同载有氯霉 素 乙 酰 转 移 酶 chloramphenicol acetyltransferanse , CAT 漯河职业技术学院学报 8 2004 年 ) P53 蛋 白 与 RNA 病毒包装和感染等的蛋白质 ,可用于调控的机理研究 、 运用哺乳 动 物 双 杂 交 系 统 成 功 地 验 证 了 小 鼠 22 SV40 大 T 抗原 间 蛋 白 质 的 相 互 作 用, 也 检 测 了 FRAP 与疾病的防治以及抗病毒药物的研制开发 。23 FKBP12 两种蛋白质之间的相互作用。4 结束语 () ( 8三杂交系统的产生 。三杂交系统 three - binding hy2 细胞或组织的蛋白质间的相互作用和相互协调是细胞 ) brid system用于分析蛋白和 RNA 间的相互作用 ,由 Senguptaxi 进行一切代谢活动的基础 ,病原体蛋白和机体蛋白质之间的 24 等首先报道,其基本原理是将一已知的 RNA 结合蛋白与 相互作用则是疾病发生 、发展的物质基础 。认识生物体系中 ( ) 转录因 子 的 DNA 结 合 domain 如 LexA构 建 第 一 个 融 合 蛋 纷繁复杂的蛋白质间的联系是蛋白质组研究的重要课题 ,迅 白 ,待选的 RNA 结合蛋白与转录激活结构域构建融合蛋白 。 速发展的双杂交体系提供了一个获得这些生物学信息的新 途径 。随着该体系的不断完善 、提高和在应用及处理结果方 此外 ,构 建 和 表 达 含 有 两 个 不 同 的 结 合 位 点 的 杂 合 RNA 。 面经验的不断积累 ,以双杂交系统为基础建立的一系列方法 RNA 与两个 RNA 结合蛋白的结合位点的相互作用可激活报 不仅会为生命科学的发展起到积极的推动作用 ,同时也将对 告基因的转录和表达 。该系统提供了快速 、多用的体内检测 揭示某些疾 病 的 发 病 机 制 、寻 找 新 的 可 能 的 治 疗 方 法 做 出 RNA - 蛋白间相互作用的新方法 。应用此系统可以分析确 贡献 。 定 RNA - 蛋白作用的精确结构域和单个核苷酸或氨基酸残 基 。通过构建杂交 RNA 库 ,可筛选与特定蛋白结合的 RNA 。 ( 鉴定和克隆 识 别 结 合 有 重 要 生 理 功 能 RNA 如 转 录 、定 位 、 参考文献 : 1 Fields S , Song O. 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