茶多糖的提取与初步纯化

茶多糖的提取与初步纯化 中国饲料2008年第l0期 茶多糖的提取与初步纯化 安徽农业大学生命科学学院王在贵刘朝良杨世高杨文静高丽萍 『摘要1本试验采用水煮醇沉淀法研究了影响茶叶多糖(TPS)提取的因素,并利 用苯酚一硫酸法测定多糖含量.通 过控制和改变提取时间,提取温度,乙醇沉淀体积倍数研究这些因素对提取结果 的影响,并比较了Sevag法与三氯乙 酸(TCA)法除蛋白质的效果.再刺用凝胶柱层析法对TPS进行初步纯化.结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明,TPS最佳提取的条件为:100”(2, 4h,2.5倍体积乙醇沉淀效果最佳.粗糖提取率为9,1624%,相对含量为44.6%.TCA 法除蛋白质效果较好,经凝胶 柱层析.确定本方法所提取的茶叶多糖为一种糖蛋白. [关键词】茶多糖;提取;纯化 [中图分类号】$816.17[文献标识码】A[文章编号】1004-3314(2008)10—0038—03 [Abstract]Inthisexperiment,thefactoronextractionofsolublepolysaccharidefromtae(T PS)withthemethodofwa— terdissolvingfollowingbyethanoldepositwasresearchedbycontrollingthefactorofextra ctingtime,temperatare,deposit— ingvolumetimesofethano1.rI’hedifferentreclaimingefficiencywasresearchedbydetecti ngthepolysaccharidewiththe methodofvitriol-pheno1.Atthesametime,thepurifiedmethodofTPSbythemethodofSev agandTCAwascompared. ThentheprimarypurifiedTPSwaspurifidbySephadexG一 75forfurtherstep.nleresultshowedthatthebestextraction conditionsofTPSwerethatthetempratureWas100?.theextractiontimeWas4handthebestdepositingvolumemulti- pleofethanolWas2.5times.Thecrudeefficiencyofextractionwas9.1624%.therelativeco ntentwas44.6%.Iemethod ofTCAwasbeuerthanSevag.BythepurifyingmethodforfurtherstepofSephadexG一 75columechromatography,thepro— ductionwasasortofglycoprotein. [Keywords】teapolysaccharide;extraction;purification 茶多糖(TPS)是从茶叶中提取的与蛋白质结 合在一起的酸性多糖或酸性糖蛋白.具有抗肿瘤, 抗炎,降血糖,抗凝血及抗血栓等作用(汪东风和 谢晓凤,1995;王淑如,1992).国内对TPS活性方 面进行研究较多.而对适合工业化生产TPS的提 取分离方法研究较少(李布青和张慧玲,1996;汪 东风和谢晓凤,1995).本试验通过对粗老茶叶中 多糖的提取与纯化研究,为实际生产提供一定的 依据. 1 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1试验材料及主要设备制备茶多糖(TPS)的 粗老茶叶(安徽农业大学茶厂提供).分光光度计 (VIS一7220北京瑞利分析仪器有限公司),可调恒 基金项目:国家自然资金资助项目(30371088) 通讯作者 温水浴锅(HH一5江苏国顺仪器厂).高速离心机 (TDL一60B上海科学仪器厂),电热恒温鼓风干燥 箱(DHG一9425A型),1/1000台式天平(上海医用 激光仪器厂),分液漏斗,葡萄糖标准品,三氯乙酸 (TCA),苯酚,浓硫酸(98%分析纯),95%乙醇, 丙酮,乙酸乙脂. 1.2试验方法 1.2.1TPS的提取工艺 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 粗老茶叶_?烘干_? 研磨_?微沸浸泡_?过滤_?浓缩_?乙醇沉淀一静 _?无水乙醇,丙酮,乙酸乙脂交替洗涤_? 置_?离心 烘干—1]PS粗成品. 具体步骤:将粗老茶叶在烘箱中50?干燥后 研磨成粉末状保存.称取5g茶叶粉末于杯中,加 50mL蒸馏水置于一定温度的水浴锅里浸泡2h. 4层纱布过滤.滤液继续在6o?水浴锅中浓缩至 16mL,然后加入2.5倍(即40mL)95%乙醇静置 2008年第10期中国饲料 充分沉淀8h.5000r/min离心5min后弃上清 液.在沉淀中加入丙酮洗涤后离心2次,然后继续 分别加入无水乙醇和乙酸乙脂洗涤后离心2次, 将所得的沉淀放入表面皿中5O?烘12h,即得 到60?条件下提取的茶多糖粗产品. 1.2-2标准曲线的绘制称取20mg,经105? 干燥至恒重的葡萄糖标准品.定容至500mL.配 制成0.040mg/mL标准葡萄糖溶液.称取6g苯 酚溶于100mL容量瓶中配成0.06g/mL的苯酚 溶剂.准备24只20mL试管分成3组,编号按表 1.分别加入蒸馏水和葡萄糖溶液,然后在每只试 管中加入0.06g/mL的苯酚溶液1mL,将各试管 摇匀后,每试管中加入5mL98%浓硫酸,静置 20min后摇匀.4O?恒温水浴15min.490nm处 测定OD值.根据0D49o值绘制标准曲线. 表1标准葡萄糖溶液的配制 1.2.3多糖含量的测定取0.025g多糖粗制品, 研磨后加少量去离子水溶解.转入25mL容量瓶 中定容.取1mL样品液稀释1O倍,取稀释后的 样品液2mL于试管中,依次加入0.06g/mL的苯 酚1mL,浓硫酸5mL,静置10min摇匀,4O?恒 温水浴15min后取出,测定0D490值,依据标准回 归方程,计算含量. 1.2.4多糖的纯化 1.2.4.1多糖的初步纯化:Sevag法除蛋白质按照 张帷杰(1987)的方法进行. TCA法除蛋白质:称取1.5g粗糖.加30mL 纯水溶解,再分别称取一定量TCA,使其中的 TCA达到一定浓度,静置5h后离心,加入无水乙 醇至含醇量达8O%,静置过夜.离心后弃去上清 液,取沉淀5O?烘干即得初步纯化的产品. 1.2.4.2多糖的进一步纯化:SephadexG一75干粉 参考张树政(1987)方法进行处理. 取2.6cmx60em层析柱一根.用铅垂法将柱 垂直至于铁架上,在柱内先注入1/5,1/4的水 柱.底板以下全部充满水不留气泡,然后将柱的出 VI关闭.出VI处接上一根长约1.5m,直径2mm 细塑管.塑管另一端固定在柱的上端约45em处. 把已经溶胀好的凝胶调成薄浆,沿漏斗倒入柱内, 胶粒逐渐扩散下沉,薄浆连续加入.当沉积的胶床 至2,3em高时.打开柱的出VI并控制调节操作 压以均匀不变的流速.随着下面水的流出,上面不 断加凝胶,使形成的凝胶床面上有凝胶的连续下 降.当凝胶沉积到柱的顶端约6em处,可停止装 柱.柱材料装好后,再用去离子水平衡柱体,直至 层析的床体高度不变为止.将层析床体稳定4h, 然后连接恒压洗脱瓶出VI和层析柱顶端,稳定过 程中维持操作压在45em水柱 打开柱的出VI,待柱中洗脱液流至距床表面 1,21TlIn时,关闭出口,用滴管将样品慢慢加至 柱床表面,打开出VI并开始计算流出体积,当样品 渗入床中接近床表面1mm时关闭出VI,小心地 加入少量洗脱液,再打开柱的出VI,使床表面的样 品也全部渗入柱内.在床的表面再小心地加水.使 水面高出床体表面3,5em.接上恒压洗脱瓶.调 节操作压在30em水柱高度以内.连接部分收集 器按每管2mL收集流出液. 2结果与分析 2.1葡萄糖含量标准曲线的绘制见图1 葡萄1椐含量/旧 图1葡萄糖含量标准曲线 2.2影响多糖提取的因素 2.2.1不同温度对粗糖的提取量的影响重复 1.2.1步骤,改变茶叶多糖的提取温度.分别在7O, 8O,9O?和100?条件下提取得茶叶多糖粗品. 根据1.2.3测定不同提取温度下所得到多糖的含 量,结果见图2.由图2可知,温度为100?时,从 茶叶中提取粗糖的总量和糖的相对含量都最高. 2.2.2不同提取时间对粗糖提取量的影响将茶 叶粉分别在100?水中浸泡2.5,3,3.5h和4h, 用4层纱布过滤,再把所得滤液离心8min(5000 ----—— 40----——中国饲料2008年第1O期 r/rain),取上清液在100c《二水浴锅中浓缩至16 mL,按1,2.3步骤,测定在不同提取时间下所得到 多糖的含量,结果见图3. E 删 冀 E 删 窭 檗 图2温度对TPS提取量的影响 22.53354 时间/h 图3时间对TPS提取量的影响 由图3可知.在100c《=提取4h.所得的粗糖 量最高,糖的相对含量也较高. 2.2-3不同乙醇体积对粗糖提取量的影响将茶 叶粉于100?水中浸泡4h,4层纱布过滤,所得 滤液离心8min(5000r/min),取上清液,100c《二水 浴浓缩至16mL,后分别加入2,2.5,3倍的95% 乙醇,静置,沉淀8h.其他按1.2.1步骤操作,结 果见图4. E 删 檗 一总糖量一相对台量,% 1522533.5 乙醇体积倍数 图4不同乙醇体积对TPS提取量的影响 由图4可知,100c《二条件下,提取时间为4h, 用2.5倍体积的95%乙醇沉淀时,从茶叶中提取 多糖的粗糖总量和相对含量均最高. 2.3粗糖的大量提取按以上研究结果.对100g 茶叶粉末进行提取.得到粗糖重量为9.1624g,另 外从中分离得到0.5695g纯白样品.按1.2-3的 方法,分别测定糖含量,结果见表2. 2.4茶叶多糖的初步纯化取1.5g的粗多糖经 Sevag法除蛋白后,回收得到0.5796g样品.测得 净糖量为O.284g,其中净糖的相对含量为 48.9%. 表2粗糖大量提取后糖含量测定结果 分别称取三氯乙酸0.5,0.7,1.0,1.2g各加水 10mL配置浓度分别为5%,7%,1O%,12%的 TCA溶液,加入1.5g粗糖,依照1.2.4.1的纯化方 法测得不同的TCA浓度与总糖量和糖相对含量 的关系见图5. 由图5可知.1O%浓度的TCA除蛋白效果最 好.除蛋白质后多糖相对含量为72.6%. 250 詈200 删150 篓?. 0 图5不同TCA浓度对多糖蛋白去除效果的影响 2.5茶叶多糖的进一步纯化根据1.2.4.2试验 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ,将经过Sevag法除蛋白质后的样品进行 SephadexG一75柱层析纯化, 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 每管样品的 ?瑚值,从第1管开始检测每隔5管检测?伽 值,以管号为横坐标.OD值为纵坐标,绘出凝胶 层析洗脱曲线,见图6. I2 1O 趔 .4 2 0 趔 霉 8 冒号 图6SephadexG一75层析图谱 从图6可知,曲线上在5,12管处出现了1 个明显的蛋白质吸收峰.用硫酸一苯酚法检测每 隔5管的糖吸收曲线,在1O管处出现糖峰,糖峰 跟蛋白质吸收峰重叠的比较好,判断该TPS是一 种糖蛋白. 3讨论 本试验从粗老茶叶中提取得到的茶叶多糖粗 (下转第44页) 一 44一中国饲料2008年第10期 在本试验得出最佳方案为:Y=38.033%,X=一 0.68,Xz=0.57,X3=0.47;即中性蛋白酶加量为3820 U/g蛋白,复合风味蛋白酶加量为43.5LAPU/g, 水解22,8h时水解度为38.033%.以上优化条件 下共进行3次平行试验,平均水解度为37.8l%. X2 FixedIevels:X1=0 响应面图(左)和等值线图(右) 图9风味蛋白酶,时间对水解度的影响 3结论 采用蛋白酶处理血球蛋白可使其部分水解, 同时可在一定程度上脱色和去腥.初步比较中性 蛋白酶,木瓜蛋白酶,复合风味蛋白酶等对猪血球 蛋白酶解效果表明,木瓜蛋白酶的水解效果最差. 本试验在单酶水解猪血球蛋白的基础上进行双酶 复合,利用Box—Behnken中心组合设计和响应面 分析可知,酶水解猪血球蛋白的最适工艺条件为 温度50?,底物浓度为l2%,中性蛋白酶加量为 3820U,g蛋白,复合风味蛋白酶加量为43.5LA— PU/g,时间为22.8h.同时表明两种蛋白酶之间交 互作用显着(尸<0.05),但本试验酶水解时间较长 还需进一步研究. 参考文献 [1】宫霞,郭本恒,李云飞,等.酶解酷蛋白生产生物活性肽的研究现状及开 发前景U].中国乳品工业,2005,33(4):44,47. [21姜锡瑞,段钢.新编酶制剂实用技术手册.中国轻工业出版社,2003. [31解蕊,张根生,范俊杰,等.木瓜蛋白酶水解鸡骨泥工艺条件的研究U].食 品工,3k.2003.1:40,42. f4]林维宣,佟绍芳.食品分析试验.大连:大连轻工业学院专业分析教研 室.2000.40,43. [51沈其君.SAS统计分析.南京:东南大学出版社,2001.123,132. [61杨胜.饲料分析及饲料质量检测技术.北京:北京农业大学出版社, 1993.19,21. 同张寒俊,刘大川,李永明,等.响应面分析法在菜子浓缩蛋白制备工艺中 的应用U].中国油脂,2004,29(8):41,45. [81赵新淮,冯志彪.大豆蛋白水解物水解度测定的研究U].东北农业大学学 报.1995.26(2):178—181. [91赵永芳.生化试验技术及应用.北京:科学出版社,2002. [101SayanG,ManoharCSAnimprovedresponsesurfacemethodforthe determinationoffailureprobabilityandimportancemeasuresU].Structural Safety,2004,26:123,139. [通讯地址:武汉市,邮编:430023] (上接第40页) 品为淡黄褐色松弛块状物,一经搓捏即变为粉末 固体,不易潮解.粗糖的最佳提取在时间为4h, 温度为100?,乙醇沉淀体积为2.5倍,在此提取 条件下,粗糖得率9.1624%,净糖相对含量达 44.6%. 柱层析结果表明,TPS为一种糖蛋白.对 Sevag法和TCA法除蛋白方法的比较,Sevag法除 蛋白后净糖的相对含量为48.9%,而用TCA法 (10%的TCA溶液)除蛋白后TPS的相对含量为 72.6%.从数据上看,TCA法明显较Sevag法好, 但是TCA可能会破坏TPS的二级和三级结构而 降低其生物活性,同时与蛋白质结合态的TPS具 有更好的生物活性,因此,还应通过动物饲养试 验来验证这两种方法的优劣. 参考文献 【1_l李布青,张慧玲.中低档绿茶中茶多糖的提取及降血糖作用U].茶叶科 学,1996,16(1):67,72.’ f2]汪东风,谢晓凤.粗老荼治糖尿病的药理成分分析?1_中草药,1995,26 (5):255,257. [31王淑如.茶多糖的抗凝血及抗血栓作用U].中草药,1992,23(5):254,256. [41张帷杰.复合多糖生化研究技术口.上海:上海科技出版社,1987251,253. 『通讯地址:合肥市长江西路130号,邮编: 2300361