用COI基因确定直隶环毛蚓(Pheretima
用COI基因确定直隶环毛蚓(Pheretima
第17卷第2期:22
2007年4月
生物技术
B加fI1HN0IOGY
Vo1.17,No.2:22
Apr.2007
[10]Ca~A,WalshG.IdentificationanddmractefizationapIIytaseofpo-
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用COI基因确定直隶环毛蚓【Pheretimatschiliensistschiliensis)的属的地位 黄健,孙振钧.
(中国农业大学资源与环境学院,北京1ooo94)
摘要:目的:由于采用新的分类体系,国内外学者通过形态学特征对直隶环毛蚓(Pheretknatwh~//ens/stwh///ens/s,Mic~alson,
1928)的分类地位一直存在争议,该文的目的在于将此种给予明确的划分.方法:用采自不同地区的直隶环毛蚓COI基因(534bp)
及结合其相应的氨基酸(178个),以陆正蚓(/amlbr/oasIer对)为外群,用最大简约法和贝叶斯法构建进化树的方法,结果:试验
结果表明,构建的系统树将直隶环毛蚓与腔蚓属聚为一族,并得到很好的支持(BP>76,pp?O.94),种间校正基因距离介于0.006
0.263.种内校正基因距离介于0.0000.162,结论:因具有交配腔,故分子生物学和形态学特征均表明,直隶环毛蚓应属于腔
蚓属而不是远盲蚓属.其学名应为Metaph/re地岫t.w_h~/iens/s(Michealson,1928).
关键词:直隶环毛蚓;腔蚓属;远盲蚓属;COl;分类
中图分类号:Q959.193文献标识码:A文章编号:1004—311X(2007)02-OO22一? EstablishmentofAffinityofPheretimatschiliensistsch///ensisbyCOIGene
HUANGJian.SUNZhen—Jun'
(CollegeResourceandEflvilDl1n=lll8】Science,Ofina姆icIllnI试University,Beijing100094,China) :Objective:Sinceiiewtaxonomysystemwssused,a伍IlityofP^魄砌l口础越(Mic~alson,1928)hadbeen
discussingac(幻tomorphologieAd1a妊Icte鹉.Methods:Theobjectiveofthispaperwastovealla】五加明lo珂result,themethodofCOIgene
(534bp)andtheiraminoacids(178)ofP.tsch~tsch///ens/sfromdifferentgeographicalsitesw
ereemployed,I~mbricustereisfialwereused 8sout.upandcomtructedph1dtreewithinaxilnuin—pa~nyandBayesianinference.Results:TheresultsshowedthatP.d矗
tscI缸clusteredtogetherwithMetaphire,~vingdoselyrelationshipwithMetaphire,andwellsuppo
rted(BP>76,PP?0.94).Con~ed
gelnecdistancesofinter—sp-ecivariedfrom0.006to0.263,andcorrectedgeneticdistancesofintra—speciesvariedfrttn0.000to0.162.A conclusionwasdrawnthatP.tw_h/hhns/stsch/hhns/sshouldberevisedin肘如批,notAmynthas,anditsscientificmIIleshouldbeMetaph/re
tsc掘e,Its(ns(M诎日1B0n,1928).
Keywol~!Pheretbnatwh~//ens/stwh~//ens/s;;砒?;COI;taxonomy Kinberg(1867)建立了环毛蚓属(Phem/ma)和远盲蚓属
(d删as),SimsRW&Efl/3tonEG…将环毛蚓属(P^)
修定为8个属,EasI加(1982)又修定为1O个属J.而做为亚洲
种的直隶环毛蚓(P.tsch///ens/stseh///ens/s)的分类地位一直就
存在争议.SimsRW&El~tonEG….BlakemoreRol~xt将其 修正在Amynthas属内,冯孝义等将其修订在Metaph/re属内. 以上学者均是从形态学的特征进行鉴定的.何获平等用聚 丙烯酰胺凝胶电泳证明直隶环毛蚓和峨眉大蚯蚓(P.praep/n. )是两个不同种,但并未进行属的修订.直隶环毛蚓不仅
作为传统中药,还可以提取抗菌肽[6】.所以其分类地位的归属 有着重要意义,用分子生物学的方法可以客观直接鉴定其分 类地位的归属.
细胞色素酶亚单位I(COI)基因是线粒体编码蛋白的基
因.它有着比核基因进化快的位点,特别是编码子的第三位 点对于推断更近的支序发生有着潜在的作用.已经证明它能
评价
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从门到种内的各级关系.HebertPD等们认为COI 基因可以做为识别物种的条形码.
SchindelDE&MillerSE认为DNA条形码对分类学家 来说,在鉴定已知种和未知种及确定种的边界是非常有用的 工具.分子方法对鉴定种类和确定蚯蚓问的进化关系能提供 新而且准确的手段-lI1.国内尚无报道用此方法对蚯蚓的分 类地位进行鉴定.有本文就是用此基因及其相应的氨基酸, 运用分子生物学的方法来确定直隶环毛蚓的属的地位. l材料与方法
收稿日期:2006—11—16;修回日期.2.007—01—11
基金项目:国家自然科学基金项目资助(No.30470220,No. 30270195);教育部博士点基金项目(20020D190凹);北京市生态重点学 科资助(XK10019440)
作者简介:黄健(1974一).男,博士生,专业方向:分子生物学.Tel:010 —
62814372,E—mail:dietsmart@163.ecm;*通讯作者:孙振钧(1956 一
).男.博士.教授,博导,从事蚯蚓生态学的研究,E—mail:mnl08
@Cal1.edu.?,Tel:010—62732942o
1.1材料
所用的直隶环毛蚓(P.t.whglAms/st.whglAms/s)采自四川,河 北,北京各2条.成体用30%的乙醇杀死并保存于95%的乙 醇中,置于室温.
1.1.1实验材料
从尾部剪取部分肌肉组织并用清洗干净以防内脏内容物 的污染.
1.1.2试剂
蛋白酶K购自美国Merk;Taq酶,dNTP和PER产物胶回 收试剂盒均购自大连宝生物公司;PcR引物由北京奥科生物 公司进行进行合成;琼脂糖购自西班牙产;苯酚,氯仿,异戊 醇,;(,溴化乙锭均购自北京普博生物公司.其他试剂为国 产分析纯.
1.1.3仪器
MJ一200PcR仪,SIZHI自动凝胶成像系统.Cn'型型洁净 工作台,DJ1000电子精密天平(常德市仪器厂),FAIl04电子精 密天平.
1.2方法
1.2.1基因组抽提
将剪碎的组织加入20mg/ml的蛋白酶K50t,i并在65~C水 浴过夜.基因组DNA按
标准
excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载
的酚氯仿方法进行抽提. 1.2.2扩增和测序
扩增COI基因的引物为LCO1490(5一~CAAAT- CATAAAGATATrGG一3)和HCO2198(5一TAAACITCA~- GACC,AAAAAATCA一3).模板1,Taq酶1.25U,引物浓度 25pmoFL,dNTP浓度200vmol/L,ida浓度,2mnml/L,5vL10× PCRbt~er,加超纯水至ll.循环设置为:94?预变性4min, 94?45s,49?40s,72?908,共35个循环,最终72?延伸
7min.反应过程设空白对照.PCR产物在1.5%的琼脂糖凝 胶中用溴化乙锭染色,进行切胶回收.委托北京奥科生物公 司进行双向测序.所测序列已经输入Genbank,登录号为 DQ835672一t~835677,其他序列从Genbe~下载,见表l.
2OO7年4月用COI基因确定直隶环毛蚓(P^珂呖mtsch///ens/s纰订切岫)的属的
地位23
裹l本研究所用的分类的登录号
TablelTaxasequetaeodforthis8h.dy
Taxon
Metaph/reg/arena砂地腔蚓
胁细ma/na天平腔蚓
Metaph/~m/wa,~白湾腔蚓
Metaph/re砌"ae(a)台湾腔蚓
胍蛔"—ae(b)台湾腔蚓
Met,,p~fei/ani(a)飞栈腔蚓
腻啦倒(b)飞栈腔蚓
Metaphirebununa(a)布农腔蚓
Metaph~bununa(b)布农腔蚓
Metaphire(a)直隶腔蚓
Metaphire纰(b)直隶腔蚓
Metaphire(c)直隶腔蚓
Metaphire纰(d)直隶腔蚓
Metaphire纰(e)直隶腔蚓
Metaphire椒(f)直隶腔蚓
Amyrahasmtd/n~mis(a)武临远盲蚂I
^,lmu//n~ns/s(b)武临远盲蚓
^,l//:1/(a)李氏远盲蚓
^,l//:1/(b)李氏远盲蚓
^,lcon/ce~皮质远盲蚓 ^,l^如露玻远盲蚓 ^,lmayshanens/s(a)梅山远盲蚓
^,lrr^d,l?出(b)梅山远盲蚓
,"HI6Ilm'r~ar/s陆正蚓 AccessionNumlx~
AY962l82 Al48
AY9I62138 AY739l326 AY735l327 AY960809 Al59
AY9曰D804
AY739337 I)0835672 D0835673 I)0835674 DQ835675 I)0835676 D0835677 DQ224175 DQ224176 DQ224166 DQ224167 DQ224190 Al85
DQ224183 DQ224184 U24570
*注:DQ635672和DQ635673采自四川.DQ635674和1)Q635675采 自河北.DQ635676和DQ635677采自北京.
*Note:r~35672andDQ635673collectedfromSiehmnProvince;
DQ635674andDQ635675collectedfromHebeiPl~inee;DQ835676and
DQ635677collectedfromBeijiIlg. 2结果与分析
2.1对位
所测序列用ClustalX,version1.8,并进行手工校对,没有
发现插入,删除突变.将核酸转化成氨基酸,并添加到核酸数 据中.这是给非同义核酸替代赋予特殊权重的一种方法. 为此将COI基因转化成氨基酸.用PAUP4.OblO[23]最大简约 法对COI,COI+从分别构建一致树,以/.~mbr/eustetrestr/s外 群,结合已经公认的腔蚓属(M~aphire)和远盲蚓属(Amymhas) 的种为内群,运用启发式搜索,树枝交换双向连接,自举值为1 000次,结合534个核酸及其与相应的178氨基酸组合后分别 运算.
通常认为转换与颠换比小于2.0时该基因序列的突变已 达到饱和状态,在系统发生分析时需进行特别的加权H副.本 研究中24个类群(包括1个外群)的转换颠换比的平均值为 3.7564,大于临界值,因此在简约法分析不用加权【l.
2.2运算
对于贝叶斯法的运算中,先用btodeltest3.06选出进化的 最合适模型.在最大似然法的框架内,模型用MC进行比较, 这种方法能减少处理更复杂模型时对这些数据发挥作用很少 不必要的参数.对于COI基因的534个核酸选取HKY+I+G (Nst=2.=0.3247,7dC=0.2414.=0.1066,fir=0.3273,I
=0.5975,=1.6742,Tvratio=3.7564)为最适模型,
设置4条链,3条热链1条冷链,马尔柯夫链蒙特卡洛叠代同 时运行,以随机树起始树,每100代抽取一棵树,运行5000(10
代后,舍弃老化样本1250(10代,根据剩余样本构建一致树,并 计算相关参数.
2.3进化分析
在我们所测的直隶环毛蚓的序列中,它们的氨基酸没有 中止密码子,说明我们所测的序列都来源于线粒体,没有核基 因污染.所扩增的部分COI基因序列共640bp,其中53-4bp用 于比对和进化分析,在这534bp中,平均A+T的含量为 60.5%,其中密码子第一,二,三位的A+T含量分别为44. 4%,57.3%和79.9%.所有序列与,.的COI基因中 第88—727位同源.
在只有核酸序列数据中,简约信息位点177个,密码子第 一
,二,三位的信息位点分别为:31,0和146个.树长647,一 致性指数(CI)=0.4807,保持性指数(RI)=0.6352,重复测量一 致性指数(Rc)=0.3053.在核酸与氨基酸组合数据中,简约 信息位点184个,树长668,一致性指数(a)=0.4820,保持性 指数(Il1)=O.6319,重复测量一致性指数(RC)=0.3046.这两 者的简约树拓扑结构一致,并且得到较好的自举支持.贝叶 斯法构建的一致树的拓扑结构与简约树的拓扑结构一致,也 得到较高的支持.简约法运算的结果如图1和图2.在自举 一
致树中,支持率超过50%的为很好支持.贝叶斯法运算的 结果如图3.
Me,h/re且Io?
JI|.tnId?
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^f.for~er丑J
JI|.,0r?l?矗e函J
JI|.feij~ffraJ
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AmynO~nni(a) A.1i
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A.~llnensis A.oofl如e矗
A.ta'raI
A.m置y暑tnens函
A.m8】啊han?s
圈l对于COl基因用筒约法进行l000次自举所获得的一致树
?
l胁唧嗽l000_呻?蛔0fII州alCOl舭data8el(1hemiIld)
生物技术第17卷第2期 Metaphire丑lb?
jI|.trutina M.9nnna
JIf.formos~ JIf.[ormos~) jI|.feljanl jI|.feijani JIf.bununar1) JIf.buaunafb)
JIf.tschiliensisrc) jI|.tsc.hilieaslsrdJ jI|.tschiliemis?
JIf.tsc.hiliensis) jI|.tschiHeasis JIf.tschiliemisfb) Amynthaslini
A.肺fb)
A.wullnermis)
A.w~ulineasis
A.corlicea
A.~yalis
A.mayahanensisr矗J
A.mayshanemis
Lumbdcusterrestris 图2对于COI基因结合其相应的氨基酸用简约法进行l000次自举所获得的一致
树
Fig.2Paralmanyo啊
18alsu8treel000boot~preplicatestheconfined(nfitochondrialCOlgeneandtheirsla
?)data~t
The.un~ers~cateb'?L岬values. Me~phirealb?
jI|.b-utlna
jI|-Dw丑?na
】If.formm~r1)
jI|.formm~
Mfeijanlr矗J
M.feijani(b)
JIf.blnlunar1)
M.bununa(b1
JIf.tschih'ensisrc)
jI|.tschih'ensisrdJ
jI|.tsclu'liensis?
胍tsehi~ensisreJ
JIf.tschi~ens扫r1)
jI|.tschiliensis
A?I,h?linifr矗J
A.1inifb)
A.mdinensisr1)
A.wulinensisfb)
A.COI'~CeS
A.tayalis
A.mayshanensis
A.mhJmen幽
LU/II~.r/'CUSle口nBs,凼
图3用贝叶斯法对COl基因构建的一致树
Fig.3Bayesinfermeelace缸nmitochond~COIgme(Then??indicatepostesiorpn~tbilities.Pp>0.50aredisplayed.)
在所有(DNA,DNA+AA)和BI的COI基因进化分析生殖隔离间有很强的相关性",而且有着很重要的分类指
中,每组直隶环毛蚓在各个树中的支持率没,但都形成单系,示】.本文中所有的种都能通过在COI基因的变异率得到确
在单系内部自举值(bp?76)和后验概率(pp?0.94)都很好的认,而且与形态学的鉴定一致.
支持该拓扑结构.在所有分析中,种内关系都到了很好的解直隶腔蚓A+T的含量(6o.5%)明显不同于其他种的含
析.种间校正基因距离(表2)介于0.006—0.263.种内校正量(58.1%62.2%),特别是在密码子的第三位.密码子第二
基因距离介于O.000—0.162.建树表明P.tsch///ens/stsdu2~一位没有信息位点说明
该位置高度保守,并且所有种的A+T含
墙和腔蚓属(Metaph/~)聚在一起,在简约法能得到较好的支量相同.而在第三位点却有大量的信息位点(1461177),很多
持,虽然在贝叶斯法中支持率不高(pp=O.63),但仍能说明其替换都发生在该位点,A+T的含量不同,介于是73.1%
和腔蚓属的关系较近,而和远盲蚓属(Amymhas)关系较远,故83.2%.第一位点的信息位点很少(31/177),并且A+T的含
应腔蚓属.量介于42.2%一50.6%.由于DNA水平上受自然选择压力的 3讨论影响,密码子第三位点的突变率高于第一位点和第二位点,而 HebertPD,eta1.发现98%的动物都有大于2%的变异.且第三位点的突变大多属于同义突变受自然选择压力小,突
2%的种类鉴定阈值就能鉴定他们所检验的种类u.本文中,变后易固定,第一,二位点则反之(周继亮等,2001).ll条序
所有种都大于2%的变异率.因此每个种都能鉴定.种内变列中有179个核甘酸变异位点第一,三位点的A+T的含量与
异率介于0—4.3%,平均变异率是2.37%.直隶腔蚓较低的总的A+T含量随种类不同而不同.HeethaffM,etaI[2l用A+
种内变异率说明该种不是复合种.T的含量区别出Ocm/as/on妞朋(Savig~y1826)
两种不同的
基因变异通常被用来推测种的边界,因为在基因变异和类群,但是,对于A+T的含量是否能用于鉴定种值得进一步
2OO7年4月用COI基因确定直隶环毛蚓(P/~et/ma蹴椒)的属的地位25 N
一n.nhao2=0=:2竺呙罱
*注:表2中[1]瑚w嘲sQl趣lgeIal,2O05(a); L2JAl,Il?mChangeIal,2OO5(b);
L3J蛳棚Taai,ShineITaai,2001(a); L4JAl,Il?蛳Taai,ShineITaai,2001(b);
Lsj山//n/ChangeIal,2OO5(a);
L6]//n/ChangeIal,2O05(b);
L7J肌咖—'Ic'Ic(^Iidlcal8?,1928)(a);
L8J胍蜘tsc'Ic豳(^Iich,1928)(b);
L9J肌咖—8d|j'Ic(^Iid嘲d80rI,1928)(c);
L101肌咖—lsc'Ic豳(^Iiche山m,1928)(d);
L11J肘咖'Ic墙'Ic(^IidIeal80lt,1928)(f);
L12]胍蜘'Ic'Ic(^IjdIeal8m,1928)(e);
Ll3J肘咖咖Taai,SII?eITmi,2000;
L14j朋rdqa-u~a,TmieITmi,嬲;
.
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第17卷第2期:26
2OO7年4月
生物技术
BIaIECHN0IOGY
Vo1.17.No.2:26
Apr.2OO7
[15JMemph/rep,a,oa~n,1etLiaw,2000; [16]M呦细m0I(tCticll~son,1922)(a); [17]肘—如向m螂(Mic}leal8?.l922)(b);
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[23J,lto-r~tr/s(Linnaeus,1758)o
研究的.
Midwt22]在描述Pheret/ma,鼻c蠡时只描述了具浅腔的
受精囊,未描述交配腔,而腔蚓属和远蚓属蚓的最大区别就是是否具
有交配腔….陈义也未
记录
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其有交配腔,Sire8Rw&E嘲mEG[I】,
BlakemoreRobeltJb】均据此认为是远盲蚓属.冯孝义H】指出Phem'bna lsc矗,Ic蠡具有交配腔,且腔大内有一小平顶乳头,这与何荻
平等【5】解剖的结果相似.也与我们的解剖结果一致,冯孝义等【4】将其 修定为腔蚓属.而我们用分子生物方法所做的结果也符合形态学的
鉴定结果(BP>76,pp?0.94),因此我们认为日wlsc憾"d趣.
应属于Memph/re,而不是das.其学名应为Me,h/re"d趣.
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翘嘴红鲒苏州和宜兴养殖种群的遗传多样性分析
李建林,吴婷婷
(中国水产科学研究院淡水渔业研究中心,江苏无锡214081)
摘要:目的:对翘嘴红刍白养殖种群遗传多样性进行分析,以科学地评价它们的种
群遗传结构.方法:采用RAPD技术,对翘嘴
红刍白苏州和宜兴养殖种群的遗传多样性进行分析.结果:苏州养殖种群的多态位点比例为25%,种群平均杂合度为0.1654,
Shannon多样性指数为0.671;宜兴群体的多态位点比例为22.4%,群体平均杂合度为0.1446,Shannon多样性指数为0.0594.苏州
群体内各个体之间的遗传相似度度为0.9378,遗传距离为0.0622;宜兴群体内各个体之间的遗传相似度度为0.9444,遗传距离为
O.0556;两群体之间的遗传距离为0.0146.结论:两种群具有较低的遗传多样性. 关键词:翘嘴红刍白;随机扩增多态性DNA;遗传多样性;多态位点
中图分类号:Q959.468文献标识码:A文章编号:1(104—3ttX(2~07)O2—0026—04 oftheGeneticDiversityinSnT,houandYixingCultivated
LIJian—lin,7,rU'I一tg
(FreshwaterFisheriesResearchCenter,ChineseAcademy0fFisherySci?c?,w214081,Chi.a)
Abe"act_*Objectives:Analysisthegeneticdiversity0fthecul?