毛细管电泳原理及分析策略(2010)

null毛细管电泳分离原理及分析策略 毛细管电泳分离原理及分析策略 贝克曼高效毛细管电泳仪贝克曼高效毛细管电泳仪null毛细管电泳是带电粒子在电场力的驱动下，在毛细管中按其淌度或和分配系数不同进行高效、快速分离的电泳新技术，也称为高效毛细管电泳(Capillary Electrophoresis, CE)。 毛细管电泳的原理 毛细管电泳的原理 1 装置 毛细管 数据处理 电极 检测器 电极 试样 缓冲液 高压电源 （可高至30KV） 2 电泳和电渗 2 电泳和电渗 电泳 是指在电场作用下，溶液中的带电粒子作定向移动的现象。 电渗 是指在电场作用下，毛细管或固相多孔物质内液体沿固体表面移动的现象。 2 电泳和电渗 2 电泳和电渗 电泳 行为与特性使用淌度描述 即单位场强(E)下离子的平均电泳速度υ μep=υ/E 实验中，只发生电泳时有效淌度 μef =υef ﹒ (L /V) =( l / tm )﹒(L /V) 毛细管有效长度 迁移时间 毛细管总长度 电压 2 电泳和电渗 2 电泳和电渗 电渗 与固液界面的双电层有着密切的关系 在毛细管壁双电层的扩散层中的阳离子，相对于毛细管壁的负电荷表面，形成一个圆筒形的阳离子鞘，在电场作用下，溶剂化了的阳离子，沿滑动面与紧密层作相对运动，携带着溶剂一起向阴极迁移，便形成了电渗流（electroosmotic flow ,EOF）。 null固液两相间的总电势-热力学电势-φ0 Zeta电势-ζ 2 电泳和电渗 2 电泳和电渗 电渗流的流型特点 电渗流 HPLC 塞流 层流 2 电泳和电渗 2 电泳和电渗 电渗流的表示 电渗流的大小可用淌度(μeo)或电渗流系数表示 μeo =υeo / E = l /( teo﹒E ) 电渗流速度 毛细管有效长度 电渗流流出时间 电场强度 第22章 毛细管电泳 22－1 毛细管电泳的原理 2 电泳和电渗 第22章 毛细管电泳 22－1 毛细管电泳的原理 2 电泳和电渗 电渗流的意义 电泳过程中，伴随着电渗现象 电渗流的速度比电泳速度快5－7倍 利用电渗流可将正、负离子或中性分子一起向同一方向，产生差速迁移，在一次电泳操作中同时完成正、负离子的分离分析 电渗流是毛细管电泳分离的重要参数 控制电渗流的大小和方向，可提高毛细管电泳分离的效率、重现性、分离度。 分情况而论 2 电泳和电渗 2 电泳和电渗 改变电渗流的方法 改变外加径向电场 改变缓冲液成分和浓度 Zeta电势 改变缓冲液pH 加入添加剂 改变温度 粘度 盐-离子强度表面活性剂µeo正比于Zeta电势和介质的介电常数 反比于介质的黏度 Zeta电势正比于双电层厚度和界面有效电荷密度 反比于介质的介电常数表观电泳淌度 µap 表观电泳淌度 µap μap=υap/E υap为离子的表观迁移速度 υap=υef +υeo µap= µef + µeo 2 电泳和电渗 3 分离效率和分离度 3 分离效率和分离度 分离效率 柱效可以用理论塔板数n表示 n = (µep+µeo) V l /(2DL) 毛细管电泳分离的柱效方程 理论塔板高 H =L / n n = 5.54(χ/ W½)2 实验上可按上式求出理论塔板数 χ为电泳图上从起点至电泳峰最大值之间的距离 W½为电泳峰的半高峰宽 3 分离效率和分离度 3 分离效率和分离度 分离度 电泳中两峰的分离度（Rs），也称为分辨率，它表示了淌度相近的组分分开的能力，可表达为 Rs= （n 1/2/4）×（ Δυ /υ平 ） Δυ相邻两区带的迁移速度差 υ平为两者的平均速度 Δυ / υ平表示分离选择性 n为柱效 3 分离效率和分离度 分离度计算式 Rs = 2 (tm2 - tm1 ) / ( W1 + W2 ) tm1、tm2 分别为两个组份的迁移时间 W 为峰底的宽度  3 分离效率和分离度 4 区带宽度及其展宽因素 4 区带宽度及其展宽因素 区带宽度展宽因素 焦耳热 进样 电泳扩散 毛细管壁对组分的吸附 4 区带宽度及其展宽因素 焦耳热 细内径（<100µm），粗外径的毛细管柱 温度轮廓 ---- 黏度轮廓 ----速度轮廓 4 区带宽度及其展宽因素 4 区带宽度及其展宽因素 进样 试样导入毛细管柱时，总有一定的试样区带长度。 细内径的毛细管柱时，进样操作的要求更为严格。 一般进样区带控制在柱长的1% 电泳扩散 试样区带中的缓冲溶液浓度或电阻率与毛细管其它地方的浓度或电阻率不相等时，因两个区域电场强度的差异，而引起区带电分散。 µs---µb 峰前展或拖尾？ 4 区带宽度及其展宽因素 4 区带宽度及其展宽因素 毛细管壁对组分的吸附 电泳峰拖尾或变形，甚至消失。 抑制吸附作用常用的方法有： ●使用极端pH条件 ●加入中性盐或两性离子化合物 ●对毛细管内壁进行涂层处理 需要注意：方法也会抑制或改变电渗流 4 区带宽度及其展宽因素 CE分离原理-与模式有关CE分离原理-与模式有关毛细管区带电泳（CZE） 毛细管胶束电动色谱（MECC/MCKC） 毛细管凝胶电泳（CGE） 毛细管等电聚焦（cIEF） 亲和毛细管电泳（ACE） 毛细管电色谱（CEC） 第一章 毛细管区带电泳第一章 毛细管区带电泳样品在电解液中泳动,根据物质的荷/质比差异来进行分离，比值愈大,跑得愈快进样方式进样方式压力进样 电动进样 浓缩进样毛细管种类毛细管种类非涂层毛细管（裸管） 内壁涂层毛细管（涂层管）非涂层毛细管-电渗流的概念非涂层毛细管-电渗流的概念nullnull电渗流的特点null纯电泳状态null电泳+电渗流电渗流的作用电渗流的作用电渗流的活塞流特点电渗流的活塞流特点Hydrodynamic flow Parabolic Resistance to flow at surface More diffusion/broader detection zoneEOF gives plug flow Minimizes band broadening Narrows detection zone 电渗流的活塞流特点Hydrodynamic flow Parabolic Resistance to flow at surface More diffusion/broader detection zoneEOF gives plug flow Minimizes band broadening Narrows detection zone 电渗流的活塞流特点电渗流是CE中最大的驱动力来源之一电渗流是CE中最大的驱动力来源之一电渗流的正面及负面作用电渗流的正面及负面作用正面作用 增加分离速度 使得正、负电荷物质同时分离负面作用 减少分离时间和分离有效距离 电渗流的波动极大的影响了迁移时间的重复性影响电渗流的因素影响电渗流的因素pH值 pH越高，电渗流越大 离子强度 离子强度越高，电渗流越小 缓冲溶液添加剂 离子型表面活性剂、有机溶剂、环糊精电渗流随pH的变化情况电渗流随pH的变化情况控制电渗流的三个重要手段控制电渗流的三个重要手段采用涂层毛细管，消除电渗流的影响 改变pH，从而调整电渗流的大小。pH<3时电渗流很低；当pH>10以后，电渗流基本不增加 添加剂：有机溶剂可以降低电渗流的大小，从而增加分离的有效距离；表面活性剂可以彻底改变电渗流的方向和大小，主要是在阴离子分析时使用缓冲溶液的影响和选择缓冲溶液的影响和选择在CE中应该根据以下性质来选择缓冲溶液： 在所选的pH范围内有较强缓冲能力； 在检测波长处有低的紫外吸收； 小的淌度（即大体积、低电荷离子）以降低所产生的电流。 那些被称为生物“优良缓冲液”的，如Tris, borate, CAPS等特别有用，因为这些缓冲溶液中的离子一般较大，能够在较高浓度下使用而不会产生大的电流，但一个潜在的缺点是这些大的缓冲离子有强的紫外吸收。常用的CE缓冲体系常用的CE缓冲体系磷酸钠体系 宽缓冲范围 硼酸钠体系 高pH范围 Tris-HCl体系 低pH范围 醋酸-醋酸铵体系 CE/MS常用体系CZE分离条件的选择CZE分离条件的选择毛细管类型--涂层还是非涂层？ 毛细管长度--长毛细管还是短毛细管？ 缓冲液体系--种类和pH值 添加剂类型--甲醇|环糊精|乙腈 检测器选择--紫外|二极管阵列|激光诱导荧光缓冲溶液的选择缓冲溶液的选择 可先用磷酸缓冲体系为搜寻基础，初步确定（最佳）pH范围后，再进一步细选出更好pH和缓冲试剂。磷酸盐是毛细管电泳中最常用的缓冲体系之一，它的紫外吸收低，pH缓冲范围比较宽（pH=1.5～13），但电导也比较大。缓冲溶液及pH值的选择缓冲溶液及pH值的选择 研究经验表明：对于蛋白质、肽和氨基酸等两性样品，采用酸性（pH 2）或碱性（pH＞9）分离条件，比较容易得到好的分离结果；糖类样品通常在pH=9～11之间能获得最佳分离；羧酸或其他样品多在pH=5～9之间选择分离条件。缓冲溶液及pH值的选择缓冲溶液及pH值的选择 pH 的选择也和所用的毛细管种类有关，许多涂层毛细管只能在一定的pH范围内工作，例如聚丙烯酰胺涂层毛细管，在3＜pH＜8的范围以外工作，其涂层容易水解失效。缓冲溶液及pH值的选择缓冲溶液及pH值的选择 在相同的 pH下，不同缓冲体系的分离效果不尽相同，有的可能相差甚远。一般的经验是，能与样品发生相互作用的试剂，有可能就是最好的试剂。一个典型的例子是，在分离糖类和DNA等分子时优先使用硼酸盐缓冲体系，因为硼酸根能与糖羟基形成配位键，从而增加糖的负电荷和分离度。硼酸缓冲试剂也适用于其他含邻位羟基或多羟基化合物的分离。缓冲溶液及pH值的选择缓冲溶液及pH值的选择 缓冲试剂及pH调节剂的浓度也需要优化。缓冲试剂的浓度一般控制在10～200 mmol/L之间。电导率高的缓冲试剂如磷酸盐和硼砂等，其浓度多控制在20 mmol/L附近，而电导小的试剂如硼酸及HEPES等，其浓度可在100 mmol/L以上。有时为了抑制蛋白质吸附等特殊目的，可采用很高（＞0.5mol/L）的试剂浓度，此时要注意减少分离电压，分析速度自然也将随之降低。添加剂的选择添加剂的选择目的： 改善分离 抑制分析物在毛细管上的吸附添加剂的选择添加剂的选择甲醇|乙腈（5-50%） 降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果 增加非极性物质的水溶性 环糊精|SDS等表面活性剂 增加分离选择性，提高分析效果 降低电渗流，增加分离有效距离，从而改善分离效果 非极性高分子聚合物 掩蔽毛细管内壁电荷，抑制分子吸附 降低电渗流 形成一定的分子筛，提高分子大小选择性第二章 毛细管胶束电动色谱第二章 毛细管胶束电动色谱 电解质中加入表面活性剂(surfactant，例如SDS)，使之形成胶束（Micelle），样品根据其疏水性(Hydrophobicity)强弱的差异，在胶束与电解质的分配系数有所不同來进行分离 ，样品疏水性愈強，则进入胶束的机会愈大。通常物质进入胶束后，泳动的速度会变慢，因此疏水性愈強的物质则愈慢出來。毛细管胶束电动色谱原理毛细管胶束电动色谱原理nullnullMicellar Electrokinetic Chromatography (MEKC)七种青霉素的分离七种青霉素的分离CZE : 20mM Pi-Borate, pH 8.5(B) MEKC : 0.1 M SDS in (A) soln. 胶束电动色谱的特点胶束电动色谱的特点优点 增加对弱极性物质分离的分离度 在中药分析、天然产物分析、农药分析中经常使用缺点 稳定性不佳，达到好的重复性比较困难第三章 毛细管凝胶电泳第三章 毛细管凝胶电泳 毛細管內先填充凝胶(例如polyacrylamide或cellulose)，此时凝胶会在毛細管內形成分子筛，样品依分子量的大小在毛細管內移动速度不同而进行分离。 主要用于核酸片断及蛋白分子量分析毛细管凝胶电泳毛细管凝胶电泳CE双链及单链核酸分析CE双链及单链核酸分析45-寡核苷酸质控CE-SDS蛋白分子量分析CE-SDS蛋白分子量分析第四章 毛细管等电聚焦第四章 毛细管等电聚焦第五章 亲和毛细管电泳 -分离条件基于CZE第五章 亲和毛细管电泳 -分离条件基于CZE 当在CZE样品或缓冲液中引入抗原或抗体时，便可以用于研究和分析抗体或抗原，也可以利用这种方法对电泳峰进行特异性定性。显然除抗原与抗体的选择需要应用生化知识外，其他方面的选择与CZE等相同。 用于研究 分子间相互作用测定，分子构型变化 特定物质检测 活性物质筛选ACE测定分子间结合常数与解离速率ACE测定分子间结合常数与解离速率JAK2与SH2-B之间的相互作用研究CE药物筛选CE药物筛选ACE用于相互作用筛选ACE用于相互作用筛选适体Aptamer类似于抗体，但可以体外合成，结合常数比抗体更高，有广泛的药物筛选和临床诊断应用潜力 目前已有以下的一些蛋白的aptamer是采用CE方法筛选得到的 IgE HIV type 1 reverse transcriptase Thrombin Anti-thrombin III Taq DNA polymerase ACE用于相互作用筛选ACE用于相互作用筛选传统筛选方法如亲和色谱或者CEC筛选一个Aptamer需要4-6周 而CE只需要几天就可以了，大大提高了筛选速度 --MicroScale Bioseparations 2006 第六章 检测器选择第六章 检测器选择小分子检测 大分子检测 CE检测器种类及性能CE检测器种类及性能小分子检测小分子检测有紫外吸收 首先选择二极管阵列检测器或紫外检测器 无紫外吸收 可以衍生化的，可以采用自外衍生的方法再用紫外检测器检测，如氨基酸、还原性糖等 不可以衍生化的，可采用间接紫外法用紫外检测器检测，也可以尝试电化学检测器 有荧光或需要高灵敏度检测的可采用LIF检测器 需要测定结构或者难以用光学检测器检测的，可以考虑质谱检测大分子检测大分子检测蛋白、核酸 可以首先选择紫外检测器 如果需要高灵敏度检测可以采用柱前或者柱上衍生的方法标记荧光，然后用LIF检测 如果需要特异性检测，可使用特异性荧光探针，标记后再LIF检测 需要测定分子量或氨基酸序列，可采用质谱检测 多糖 含量较高的多糖可以采用末端吸收法以紫外检测器检测 含量较低的还原性多糖可用衍生试剂标记后以LIF、UV的方式检测第七章 分离条件选择流程 第七章 分离条件选择流程 分离条件的选择是毛细管电泳中最重要但也是最难之处。不同的专业研究工作者可能会有各自不同的选择策略和流程，我们提出如下九步选择流程，仅供参考： 第一步，尽可能多地了解分离样品的类型、来源、组成及其性质； 第二步，根据样品的可能性质和来源，选择分离模式，若无样品信息可先选CZE；条件选择流程条件选择流程 第三步，根据样品性质确定检测方法，一般先选直接紫外吸收； 第四步，确定样品处理方式，包括衍生 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 以及离心过滤除蛋白等； 第五步，根据样品解离常数计算最佳pH，或利用75µmID毛细管和磷酸缓冲体系确定pH范围;条件选择流程条件选择流程 第六步，根据所需pH构建缓冲体系，包括进一步优化pH、缓冲试剂浓度等； 第七步，优化其他操作参数，如毛细管 尺寸 手机海报尺寸公章尺寸朋友圈海报尺寸停车场尺寸印章尺寸 、分离电压和温度等； 第八步，确定是否需要使用添加剂和使用非水溶剂； 第九步，确定是否需要换用其他分离模式。条件选择流程条件选择流程 在毛细管电泳条件选择中，还应充分注意下列操作事项： ①最好对样品和缓冲液进行过滤或离心处理。 ②毛细管的洗涤或平衡，与缓冲体系、pH以及柱子有关。磷酸根与石英和玻璃之间存在慢相互作用，需要延长平衡或冲洗时间，处理的时间应由分离重现性决定。条件选择流程条件选择流程 ③欲降低缓冲液的电导，应尽量使用所谓的“生物缓冲试剂”；欲降低检测背景，则应尽量使用无机缓冲试剂。 ④欲保持分离重现，要尽量采用相同的条件，包括毛细管、缓冲液、温度、电压、洗涤等。第八章 各类物质的分离要点第八章 各类物质的分离要点阴离子及有机酸 此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法 间接紫外法一般以铬酸钠等物质作为背景吸收物 CTAB通常用作电渗流反向剂，以加速出峰，提高峰的尖锐度 要使用反向极性分离各类物质的分离要点各类物质的分离要点阳离子及金属离子的分离 此类物质没有紫外吸收，要采用间接检测法 间接紫外法一般以氨基吡啶等物质作为背景吸收物 与阴离子不同的是阳离子的分析不需要在缓冲溶液中添加电渗流反向试剂 也不需要使用反向极性分离 各类物质的分离要点各类物质的分离要点易电离有极性的化合物 一般采用长60cm的毛细管 分离的最佳pH在分析物pKa+/-1左右 通常不需要添加剂各类物质的分离要点各类物质的分离要点弱极性物质和水溶性差的物质（一些中药成分、农药等） 要注意分析物的溶解性，防止在毛细管中的沉淀 通过有机溶剂的添加，提高分析物在buffer中的溶解度 添加SDS，增加溶解度 降低样品中分析物的浓度，延长ramp time也可以防止分析物的析出各类物质的分离要点各类物质的分离要点还原性的单糖、寡糖和多糖（葡萄糖、半乳糖等及其聚合物） 通常无紫外和荧光，注意检测问题 可用APTS等衍生试剂衍生，使其带上电荷和紫外/荧光基团 多糖也可以采用末端吸收来检测（180-200nm），不需要衍生化处理，但是要尽量采用高pH使得羟基部分电离带电各类物质的分离要点各类物质的分离要点非还原性的单糖、寡糖和多糖 很难采用衍生的方法检测，通常对单糖和寡糖采用间接检测法 对多糖采用末端吸收的方法来检测 通常采用高pH使得羟基部分电离带电 高pH缓冲液还有防止多糖在毛细管内壁吸附的作用各类物质的分离要点各类物质的分离要点单链核苷酸、双链核苷酸片断及PCR产物 容易在毛细管内壁吸附，通常需要使用涂层管或者对毛细管进行动态涂层 分子筛原理，凝胶的种类和浓度决定了分辨率的最佳范围和大小 各类物质的分离要点各类物质的分离要点多肽及蛋白质 一般来说小的肽段不需要考虑在毛细管内壁的吸附问题 对于大的肽段和蛋白质一定要考虑在毛细管内壁的吸附，可采用极端pH和涂层毛细管的方法来避免吸附 在使用极端pH条件的时候，通常都是用正向电压分离 在使用涂层毛细管时通常没有电渗流，而蛋白是两性物质，需要仔细考虑使用涂层管时的分离极性