高效液相色谱法测定 1, 3-丙二醇发酵液中的有机酸
牟 英1 王元好1 修志龙* 1 王龙星 2 肖红斌 2
1 (大连理工大学环境与生命学院生物科学与
工程
路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理
系,大连 116024) 2 (中国科学院大连化学物理研究所, 大连 116023)
摘 要 采用高效液相色谱法在 Krom asilC18色谱柱 ( 5 Lm, 250 mm @ 416 mm .i d. )上测定了 1, 3-丙二醇发酵
液中的有机酸, 流动相为 012% ( V /V )磷酸和乙腈混合溶液 (体积比为 961 5B315) ,发酵液经氯仿处理后直接
分离定量, 8 m in内可将发酵液中的甲酸、乳酸、乙酸、琥珀酸、柠檬酸及延胡索酸完全分离定量。流动相流速
为 11 0 mL /m in,紫外检测波长为 214 nm,柱温为 20e 。方法的回收率为 9717% ~ 1001 5% ; RSD为 0198% ~
21 35%。实验结果
表
关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf
明,该法是测定发酵液中有机酸的快速、有效的定量
分析
定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析
方法。
关键词 反相高效液相色谱,有机酸, 1, 3-丙二醇,发酵液
2005-12-28收稿; 2006-03-10接受
本文系国家自然科学基金 ( No. 20176005 )、科技部 / 十五 0科技攻关计划 ( N o. 2004BA713B06-03 ) 和 / 9730计划项目
( No. 2003CB716000)基金资助
1 引 言
1, 3-丙二醇 ( 1, 3-PD)可应用于油墨、涂料、抗冻剂、保护剂以及医药等行业,可以作为生产优质的聚
酯和聚氨酯的单体,因此具有广阔的应用前景 [ 1]。
在 1, 3-PD发酵过程中,生成 1, 3-PD的同时还有其它一些有机酸生成。对有机酸的分析可以比较
直观地了解菌种代谢途径,对于确定菌体内的代谢通量分布、从代谢工程角度实现菌体生理代谢网络途
径的优化或阻遏以改变代谢流、发酵过程的优化控制以及 1, 3-PD高产基因工程菌株的构建都具有重要
意义。用于分析有机酸的方法有色谱法、薄层色谱法 [ 2]和气相色谱法 [ 3 ] ,但这些方法都要进行衍生化
处理,操作麻烦。而高效液相色谱法 (HPLC )分析有机酸不仅简单快速, 而且选择性好、准确度高 [ 4]。
B lanco等 [ 5]采用液相色谱法分析酒中有机酸; D ing[ 6 ]和牟世芬 [ 7]用离子色谱法测定了酒和饮料中的有
机酸; C accamo等 [ 8 ]采用衍生化液相色谱法分析酒中有机酸; Daood等 [ 9]以四丁基氢氧化铵作离子对试
剂,分析了果汁和蔬菜中的有机酸。衍生化法和添加离子对试剂都使操作变得繁琐, 而专门的有机酸柱
价格又较昂贵。白冬梅等 [ 10 ]采用 Ec lipse XDB-C8柱,对琥珀酸发酵液中有机酸进行了测定, 415m in可
以把 6种混合酸标样分离定量, 分析速度快,重现性也较好。但从得到的标准样的色谱图可以看出, 峰
拖尾严重而且未能达到基线分离,甲酸和苹果酸的出峰时间都在 2 m in内, 这样会造成在分析复杂的发
酵液样品时受到其他组分的干扰,而且在分析实际样品时,只得到两种有机酸的含量, 信息量较少。本
实验选用普通的 K romasil C18色谱柱,对以前的高效液相色谱法 (多采用硫酸或磷酸缓冲体系 )进行了改
进,在磷酸缓冲液中添加了适量乙腈,建立了测定 1, 3-PD发酵液中有机酸的方法, 8 m in内将发酵液中
6种有机酸完全分离定量,分析速度快,精密度高,重现性好。
2 实验部分
2. 1 仪器与试剂
LC-1100高效液相色谱仪,含 G1313A自动进样器、G1311A四元泵、G1314A VWD检测器、G1316A
柱温箱、1100化学工作站 (美国 Ag ilent公司 ) ; SK2200H超声清洗器 (上海科导超声仪器有限公司 );
LG16-W离心机 (北京医用离心机厂 ); GM-0. 15Ⅱ隔膜真空泵 (天津市腾达过滤器件厂 ); Jasco V-560紫
外可见分光光度计。HPLC级乙腈 ( Burd ick& Jackson, USA ); 磷酸 (沈阳市试剂一厂 ); 氯仿 (天津市天
河化学试剂厂 ); 甲酸 (辽宁省医药经贸公司试剂厂 ) ;乙酸 (天津科密欧化学试剂开发中心 ) ;柠檬酸、琥
珀酸 (沈阳市试剂三厂 ) ;延胡索酸 (北京金龙化学试剂有限公司 ), 除乙腈外,所用试剂均为分析纯。实
第 34卷
2006年 9月
分析化学 ( FENXIHUAXUE) 研究简报
Ch inese Journa l o f Ana ly tica l Chem istry
特刊
S183~ S186
验用水为超纯水。
2. 2 流动相的配制
量取 H 3PO4 2mL,用超纯水定容至 1000 mL,用 0145 Lm孔径的合成纤维素滤膜进行真空抽滤, 再
经超声波脱气即可用作流动相。
2. 3 有机酸标准混合液
精确称取一定量的甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸和延胡索酸, 用上述流动相配制成有机酸标准
溶液, 经过稀释, 得到有机酸标准混合液,浓度为甲酸 2186 g /L,乳酸 2156 g /L, 乙酸 5132 g /L,柠檬酸
5144 g /L, 琥珀酸 5157 g /L,延胡索酸 01073 g /L。
2. 4 样品预处理
取经离心 ( 12000 r /m in, 20m in)除去克雷伯氏菌体的 1, 3-PD发酵液,加入等体积氯仿,离心除去发
酵液中蛋白,进行适当稀释,然后以 0122 Lm孔径的滤膜过滤,即得到待测样品。
2. 5 色谱分析条件
色谱分析柱 K romasil C18, 250 mm @416mm .i d. , 5 Lm (中国科学院大连化学物理研究所 ); 流动相
A如 212所述, B为乙腈, A BB= 9615B315 ( V /V ) , 等度分离; 紫外检测波长: 214 nm; 流动相流速:
110mL /m in; 柱温: 20e 。
3 结果与讨论
3. 1 分析条件的选择
3. 1. 1 检测波长的选择 用紫外分光光度计分别对标准有机酸溶液进行扫描,发现有机酸的紫外吸收
大多在 214 nm左右,而磷酸缓冲溶液在紫外区几乎无吸收,故选用此波长为检测波长。
3. 1. 2 分离条件的选择 乙腈-水系统和磷酸缓冲系统是在十八烷基柱中应用较多的流动相。而后者
适于分析有机酸。本实验流动相选择磷酸溶液与乙腈体系,甲酸、乳酸、乙酸、柠檬酸分离效果很好, 完
全达到了基线分离,琥珀酸和延胡索酸稍差。但如果增加流动相中乙腈含量使它们完全分开,前面的乳
酸和乙酸就会部分重合。所以,确定磷酸溶液与乙腈体积比为 9615B315。在同样色谱条件下, 在 Intersil
ODS3( 250mm @ 416 mm .i d. )柱上也实现了 6种有机酸的良好分离。
3. 1. 3 柱温的选择 有机酸在水溶液中存在离解平衡 HA = H + + A -。当温度升高时, 会增加溶质的
图 1 有机酸标准混合液与发酵液的液相色谱图
F ig. 1 Chrom atog ram o f standa rd organ ic ac id and ferm entation bro th
a.有机酸标准混合液 ( s tandard organ ic acid) ; b. 发酵液 ( ferm en tation broth) ; 1. 甲酸
( form ic acid ); 2.乳酸 ( lactic acid) ; 3.乙酸 ( acet ic acid) ; 4.柠檬酸 ( citric acid ) ; 5.琥
珀酸 ( succin ic acid) ; 6.延胡索酸 ( fum aric acid)。
离解, 离子受 DONNAN作用, 导
致保留时间减少 [ 11] , 不利于有机
酸的分离。但温度超过 20e 时,
琥珀酸和延胡索酸难以分开。所
以,实验选择柱温 20e , 色谱图见
图 1。
3. 2 回归分析与检出限
采用自动进样器分别吸取混
标 110、210、410、610、810、1010
和 20 LL, 在上述色谱条件下进
样,线性回归处理峰面积 y和有
机酸含量 x ( Lg ), 得到 6种有机
酸的标准曲线方程, 6种有机酸相关系数都在 0199999~ 1之间,说明线性关系良好。表 1列出了回归
分析结果以及检出限,以 3倍信噪比 ( S /N )计算最小检出限量, 6种有机酸的检出限都较低。其中延胡
索酸最低,因为它分子中含有两个碳碳双键,所以检测的灵敏度较高。
3. 3 精密度测定
本方法对 1, 3-PD发酵液进行定性定量分析 5次, 结果见表 2。从表中可以看出, 6种有机酸的相对
184 分 析 化 学 第 34卷
标准偏差 ( RSD, % )都小于 215%, 说明这种分析方法是可靠的。
表 1 回归分析和检出限
Table 1 Regress ion equation, linear range and de tection lim it
有机酸
O rgan ic acid
回归方程
Regress ion equat ion
相关系数
Correlat ion coefficien t(R )
线性范围
L inear range( Lg)
检出限
D etect ion lim it( ng)
甲酸 Form ic acid y= 1. 67548+ 51. 57925x 1 2. 86~ 57. 15 5. 82
乳酸 Lact ic acid y= 7. 84968+ 119. 20901x 1 2. 56~ 51. 17 2. 52
乙酸 A cetic acid y= - 39. 26378+ 31. 79417x 0. 99927 5. 32~ 102. 32 9. 44
柠檬酸 C itric acid y= 11. 50014+ 61. 53346x 0. 99999 5. 44~ 108. 84 4. 88
琥珀酸 Succin ic acid y= 20. 90137+ 25. 00677x 0. 99959 5. 57~ 111. 39 12. 00
延胡索酸 Fumaric acid y= - 68. 69139+ 9464. 84763x 0. 99994 0. 07~ 1. 47 0. 03
表 2 精密度实验结果 ( n= 5)
Table 2 P rec ision of determ ination( n = 5)
有机酸 O rgan ic acid 1 2 3 4 5 X RSD(% )
甲酸 Form ic acid 738. 5 741. 0 735. 5 732. 5 737. 5 737. 0 1. 43
乳酸 Lact ic acid 368. 5 370. 5 367. 5 363. 0 363. 5 366. 6 1. 45
乙酸 A cetic acid 1789. 5 1795. 5 1790. 0 1790. 5 1794. 5 1792. 0 1. 24
柠檬酸 C itric acid 648. 0 650. 0 642. 0 645. 0 642. 0 645. 4 1. 60
琥珀酸 Succin ic acid 355. 0 357. 0 361. 0 358. 0 358. 5 357. 9 0. 98
延胡索酸 Fum aric acid 1352. 5 1362. 5 1349. 5 1350. 0 1353. 0 1353. 5 2. 35
表 3 有机酸的回收率测定结果
Table 3 Recovery study o f organ ic ac ids
有机酸
O rgan ic acid
本底值
Background
(Lg)
加入量
Added
( Lg)
计算值
C a.l
( Lg)
制得量
Found
( Lg)
回收率
Recovery
(% )
平均回收率
Average
recovery(% )
甲酸 2. 876 100. 1
Form ic acid 1. 402 1. 4710 2. 8732 2. 888 100. 5 100. 3
2. 882 100. 3
乳酸 0. 3392 100. 5
Lact ic acid 0. 1582 0. 1792 0. 3374 0. 3405 100. 9 100. 4
0. 3365 99. 7
乙酸 6. 348 99. 9
A cetic acid 3. 376 2. 977 6. 352 6. 352 100. 0 100. 0
6. 366 100. 2
柠檬酸 1. 0580 99. 7
C itric acid 0. 2991 0. 7619 1. 0610 1. 0630 100. 2 100. 1
1. 0638 100. 3
琥珀酸 1. 368 97. 4
Succin ic acid 0. 6249 0. 7798 1. 4047 1. 370 97. 6 97. 7
1. 380 98. 2
延胡索酸 0. 0295 100. 8
Fum aric acid 0. 0145 0. 0148 0. 0293 0. 0296 101. 2 100. 7
0. 0294 100. 1
3. 4 有机酸的回收率测定
取同一发酵液样品 2份,其中一
份作本底,另一份添加一定量的 6种
有机酸标准品溶液后测定各成分含
量,每份样品进行 3次平行测定, 考
察方法的回收率,结果见表 3。
从表 3可以看出, 6种有机酸的
回收率在 9717% ~ 10014%之间,说
明方法的准确度较高,重现性较好。
3. 5 1, 3-PD发酵液中有机酸分析
分别对厌氧批式流加发酵不同
时间的发酵液进行了分析, 图 2是
各有机酸的浓度曲线。从图 2可见,
6种有机酸含量随发酵时间变化趋
势大致相同,都是随发酵时间增加而
增加。乙酸、琥珀酸和乳酸在发酵过
程中有一定程度的积累,乙酸和琥珀
酸最高都达到了 10 g /L左右, 乳酸
浓度也较高, 达到了 8 g /L, 甲酸稍
低,接近 3 g /L,而柠檬酸和延胡索酸
浓度最低,不到 1 g /L。从克雷伯氏菌利用甘油生产 1, 3-PD的代谢途径 [ 12 ]可以看出,乙酸的产生伴随
有 ATP生成,这对 1, 3-PD生成是有利的。而琥珀酸的产生伴随有 ATP生成同时消耗了 NADH, 乳酸生
成也消耗了 NADH, 所以不利于 1, 3-PD生产。若要提高 1, 3-PD产量, 应阻断或减弱流向琥珀酸和乳酸
的代谢流,但它们也是重要的化工原料。如果能增强流向它们的代谢流,达到利用克雷伯氏菌来生产它
们的目的,也具有很大的现实意义,这些都为菌种选育工作提供了参考。
综上所述,采用 K rom asil C18色谱柱, 8 m in内即可把 1. 3-PD发酵液中 6种有机酸完全分离定量,灵
敏度高、分析速度快、准确度高和重现性好。
185特 刊 牟 英等:高效液相色谱法测定 1, 3-丙二醇发酵液中的有机酸
图 2 厌氧批式流加发酵各有机酸浓度曲线
F ig. 2 Concentration of organ ic acids in fed-batch ferm en ta-
tion under anaerob ic cond ition
1.乙酸 ( acet ic acid) ; 2. 琥珀酸 ( su ccin ic acid ) ; 3. 乳酸 ( lact ic
acid) ; 4.甲酸 ( form ic acid) ; 5.柠檬酸 ( citric acid) ; 6.延胡索酸
( fum aric acid)。
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by Reversed Phase H igh Perform ance L iquid Chromatography
M ou Y ing1, W ang Yuanhao1, X iu Zh ilong* 1, W ang Longx ing2, X iao H ongbin2
1 (Depar tm ent of B ioscience and B io technology, S chool of Environm ental and
B io logica l Science and Techno logy, Dalian University of T echno logy, Dalian 116024)
2 (Dalian Ins titute of Chem ical Physics, Ch inese A cademy of Sciences, Dalian 116023)
Abstract A reversed phase high performance liqu id chrom atographic m ethod on a co lumn of K romasil C18
( 5 Lm, 250mm @ 416 mm .i d. ) w ith an eluant containing 012% ( V /V ) phosphoric acid and aceton itrile
( 9615B315, V /V ) w as used fo r the analysis of o rgan ic ac ids in 1, 3-propanedio l fermentation bro th. The so lu-
t ion of samples w as pretreated w ith chlorofo rm. The form ic acid, lactic acid, acetic acid, citric ac id, succinic
acid and fumaric acid w ere complete ly separated and determ ined in 8 m inutes. The flow rate ofmobile phase
w as 110 mL /m in and the co lumn temperature w as 20e . The detect ion w avelength w as 214 nm. The reg res-
sion equation, the linear range, the corre lation coefficient and detection lim it of the standard curves w ere
determ ined. The re lative standard deviat ion ( RSD, n= 5) w as in the range of 110% - 214%, and the average
recoveries o f themethod ranged from 9717% to 10015% . Themethod w as proved to be a rapid, effective w ay
to determ ine the organ ic acids in 1, 3-propanediol fermentation broth.
Keywords R eversed phase high perfo rmance liqu id chromatography, organic ac ids, 1, 3-propanedio,l
fermentation broth
( Received 28 D ecem ber 2005; accep ted 10M arch 2006 )
186 分 析 化 学 第 34卷