126 份番茄材料的抗性基因分子标记检测

—34—新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控研究MATCH_ word word文档格式规范word作业纸小票打印word模板word简历模板免费word简历 _1714857483321_1中国蔬菜CHINAVEGETABLES2016（6）：34-41126份番茄材料的抗性基因分子标记检测陈宝玲1　甘桂云2　王先裕1　于琴芝3　龙安四1*（1广西大学农学院，广西南宁530004；2广西农业科学院蔬菜研究所，广西南宁530007；3桂林市经济作物技术推广站，广西桂林541001）摘　要：利用分子标记技术，对56份大、中果型番茄进行烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a、番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1、Ty-2、Ty-3、叶霉病抗性基因Cf-9、晚疫病抗性基因Ph-3、枯萎病抗性基因I-2和根结线虫病抗性基因Mi-18个抗性基因的检测，对70份小果型番茄进行Tm-2a、Ty-1、Cf-9、I-2、Mi-15个抗性基因的检测。共获得含烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a的材料71份；在番茄黄化曲叶病毒病的3个抗性基因方面，含纯合抗性基因Ty-1的材料7份，杂合16份；含杂合抗性基因Ty-2的材料1份；含纯合抗性基因Ty-3的材料5份，杂合7份。真菌性病害方面，含叶霉病抗性基因Cf-9的材料101份；含纯合晚疫病抗性基因Ph-3的材料1份，杂合6份；含枯萎病抗性基因I-2的材料68份；含根结线虫病抗性基因Mi-1的材料45份。供试番茄材料中，DHG-27同时含有7个抗性基因；含有6个抗性基因的材料有5份，分别为：DHG-11、DHG-20、DHG-34、ZHG-8、HG-4；含有5个抗性基因的有HG-3、XHG-352份材料。关键词：番茄；分子标记；抗性基因检测番茄（SolanumlycopersicumL.）是世界上重要的蔬菜作物之一，因其美味多汁、营养丰富，一直深受人们的喜爱，但是由于连年种植造成严重的连作障碍，番茄病害已达40多种（杜永臣等，1999）。广西地区发生较为严重的有晚疫病、叶霉病、枯萎病、烟草花叶病毒病、番茄黄化曲叶病毒病、番茄根结线虫病等。选用番茄抗病品种是解决病害问题的根本途径之一（孔凡慧等，2015）。赵杨等（2012）指出，目前我国针对番茄主要病害尚缺乏免疫和高抗品种，可能的原因是育成的番茄品种缺乏相关抗病基因。抗病性鉴定是抗病育种的首要工作，常规鉴定方法费时费力，易受环境及人为主观因素影响，且难以对多个抗性同时进行鉴定，随着分子标记技术的迅速发展，可以在苗期进行大陈宝玲，女，硕士研究生，专业方向：蔬菜遗传育种与生物技术，E-mail：chenbl1990721@163.com*通讯作者（Correspondingauthor）：龙安四，男，农艺师，专业方向：园艺方面的试验和栽培技术研究，E-mail：longansi2005@163.com收稿日期：2015-11-06；接受日期：2016-04-19基金项目：广西科学研究与技术开发 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目（桂科攻14121006-5-2、桂科合14123001-3、桂科攻13254002-2），国家大宗蔬菜产业技术体系桂林综合试验站项目（CARS-25-G-37），百色国家农业科技园区建设示范项目（桂科能1598022-1-1）量的抗病性鉴定，不受时间地域限制，显著加速育种进程（吴媛媛等，2009）。本试验利用分子标记技术，对126份番茄材料进行抗性基因检测，以便追踪目标基因，在育种中实现分子标记辅助选择，为今后番茄聚合抗病育种提供依据。1　材料与方法1.1　试验材料供试材料为广西大学农学院番茄课题组从国内外收集的126份番茄材料，经多代分离自交纯化的高代自交系（表1），每一代都严格筛选单株留种，于2015年3月种植在广西武鸣试验基地。其中56份大、中果型番茄进行烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a、番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1、Ty-2、Ty-3、叶霉病抗性基因Cf-9、晚疫病抗性基因Ph-3、枯萎病抗性基因I-2和根结线虫病抗性基因Mi-1共6种病害8个抗性基因的PCR检测；70份小果型番茄检测Tm-2a、Ty-1、Cf-9、I-2、Mi-1共5种病害的5个抗性基因。1.2　DNA的提取及试验试剂DNA提取采用改良的CTAB法（陈昆松等，2004），取新鲜嫩叶作为样品提取番茄基因组《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org—35—新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLESDNA，利用核酸蛋白分析仪检测DNA浓度，用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测纯度，将提取的DNA用TE稀释至400ng·μL-1，-20℃保存备用。试验使用的dNTPs、TaqDNA聚合酶、DNAMarker、CTAB等分子试剂均购自Transgene公司。试验引物序列（表2）由深圳华大基因科技服务有限公司合成。1.3　抗性基因检测及PCR反应体系叶霉病抗性基因Cf-9、烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a、根结线虫病抗性基因Mi-1的检测参照孙亚林（2008）开发的标记（表2）。PCR反应体系25μL：2.5μL10×BufferwithMg2+，0.5μLdNTPs（2.5mM），正反向引物各0.5μL（100μmol·L-1），0.5μLDNA模板（100ng·μL-1），0.5UTaqDNA聚合酶，ddH2O补足25μL。反应程序：94℃预变性5min；94℃变性1min，适宜Tm值退火1min，72℃延伸80s，32个循环；72℃延伸8min，扩增产物4℃保存。参照Matthew等（2010）、Merk和Foolad（2012）利用标记位点dTG328设计的CAPS引物检测番茄抗晚疫病Ph-3基因（表2）。PCR反应体系20μL：2μL10×BufferwithMg2+，0.4μLdNTPs（2.5mM），正反向引物各0.4μL（100μmol·L-1），1μLDNA模板（200ng·μL-1），0.3UTaqDNA聚合酶，ddH2O补足20μL。反应程序：94℃3min；94℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环；72℃10min。酶切反应体系25μL：2.5μLBstN表1　126份番茄材料的类型及来源材料编号类型来源材料编号类型来源材料编号类型来源材料编号类型来源DHG-1大红果日本DHG-33大红果意大利XFG-9小粉果中国XHG-29小红果日本DHG-2大红果日本DHG-34大红果意大利XFG-10小粉果中国XHG-30小红果日本DHG-3大红果日本DHG-35大红果日本XFG-11小粉果中国XHG-31小红果日本DHG-4大红果日本DHG-36大红果中国台湾XFG-12小粉果中国台湾XHG-32小红果中国DHG-5大红果中国CG-1中彩果*中国XHG-1小红果中国台湾XHG-33小红果中国DHG-6大红果日本ZFG-1中粉果日本XHG-2小红果中国台湾XHG-34小红果中国DHG-7大红果中国ZFG-2中粉果日本XHG-3小红果中国XHG-35小红果日本DHG-8大红果中国ZFG-3中粉果日本XHG-4小红果中国XHG-36小红果日本DHG-9大红果日本ZFG-4中粉果日本XHG-5小红果日本XHG-37小红果中国DHG-10大红果中国ZFG-5中粉果日本XHG-6小红果中国XHG-38小红果中国DHG-11大红果中国ZHG-1中红果日本XHG-7小红果日本XHG-39小红果以色列DHG-12大红果中国ZHG-2中红果中国XHG-8小红果中国台湾XHG-40小红果中国DHG-13大红果日本ZHG-3中红果中国XHG-9小红果中国台湾XHG-41小红果日本DHG-14大红果荷兰ZHG-4中红果中国台湾XHG-10小红果以色列XHG-42小红果中国台湾DHG-15大红果荷兰ZHG-5中红果中国台湾XHG-11小红果中国XHG-43小红果日本DHG-16大红果荷兰ZHG-6中红果中国XHG-12小红果中国HGG-1小黄果日本DHG-17大红果荷兰ZHG-7中红果以色列XHG-13小红果中国HGG-2小黄果中国台湾DHG-18大红果中国ZHG-8中红果以色列XHG-14小红果中国HGG-3小黄果中国DHG-19大红果日本ZHG-9中红果日本XHG-15小红果中国HGG-4小黄果中国DHG-20大红果中国台湾ZHG-10中红果日本XHG-16小红果中国HGG-5小黄果中国DHG-21大红果中国台湾HG-1大黄果中国XHG-17小红果中国HGG-6小黄果中国DHG-22大红果中国台湾HG-2大黄果中国XHG-18小红果中国HGG-7小黄果中国DHG-23大红果中国台湾HG-3中黄果荷兰XHG-19小红果中国HGG-8小黄果中国台湾DHG-24大红果中国台湾HG-4中黄果荷兰XHG-20小红果中国台湾HGG-9小黄果中国台湾DHG-25大红果中国台湾XFG-1小粉果中国XHG-21小红果中国HGG-10小黄果中国DHG-26大红果以色列XFG-2小粉果中国台湾XHG-22小红果中国HGG-11小黄果中国DHG-27大红果以色列XFG-3小粉果中国XHG-23小红果中国HGG-12小黄果中国DHG-28大红果中国XFG-4小粉果中国XHG-24小红果中国HGG-13小黄果中国DHG-29大红果荷兰XFG-5小粉果中国XHG-25小红果中国HGG-14小黄果中国DHG-30大红果荷兰XFG-6小粉果中国XHG-26小红果中国CSG-1小紫果中国台湾DHG-31大红果荷兰XFG-7小粉果日本XHG-27小红果中国DHG-32大红果荷兰XFG-8小粉果日本XHG-28小红果中国注：*指果实颜色为黄绿色相间。《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org—36—新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLES表2　用于分子标记的引物信息病害名称基因标记类型标记性质引物序列（3′-5′）最适Tm/℃烟草花叶病毒病Tm-2aSNP显性标记F：GCCTCATTCAACTTCCTTCTGGR：GCCAGTATATAACGGTGTAAAC59番茄黄化曲叶病毒病Ty-1SNP共显性双重标记F1：TGTATGCGTCGTGTTAGAAGGTCR1：AATGGTGACAGAATCAAGATCCACF2：AAACGCTCTTCTTCCCCTCGR2：AGTTAGATTCAGGCTCCTCGCA57叶霉病Cf-9SNP显性标记F：GTTCTTATCCTTTAACACCCAR：TCCCTCCAAATTATTACTTCC60晚疫病Ph-3CAPS共显性标记F：GAATCTTCCCCTCGACCCCTCCTCACGR：GGCTTGCATCTTTCTCCCCTTAAATACCAGC56枯萎病I-2SNP显性标记F：CCATCTCTCAAGGAACTGCGTCR：GTAGTGGTGTGAGCAATGGGCA58根结线虫病Mi-1SNP显性标记F：TTCTCTAGCTAAACTTCAGCCR：TTTTCGTTTTTCCATGATTCTAC58IBuffer，0.3μLBstNI内切酶，2.2μLddH2O，20μLPCR反应产物，37℃酶切2h。枯萎病抗性基因I-2的检测参照徐薪惟（2012）开发的SNP标记（表2），PCR反应体系25μL：2.0μL10×BufferwithMg2+，2.5μLdNTPs（2.5mM），正反向引物各1.0μL（10μmol·L-1），0.5μLDNA模板（100ng·μL-1），0.5UTaqDNA聚合酶，ddH2O补足25μL。反应程序：94℃5min；94℃30s，58℃30s，72℃70s，35个循环；72℃7min，扩增产物4℃保存。番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1的检测参照华中农业大学番茄课题组葛乃蓬等（2014）开发的双重SNP标记（表2），PCR反应体系20μL：2.0μL10×BufferwithMg2+，0.4μLdNTPs（2.5mM），正反向引物（100μmol·L-1）各0.4μL，正反向引物（100μmol·L-1）各0.2μL，1.0μLDNA模板（200ng·μL-1），0.2UTaqDNA聚合酶，ddH2O补足20μL。反应程序：94℃5min；94℃1min，58℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min，扩增产物4℃保存。番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2、Ty-3的检测参照中国农业科学院蔬菜花卉研究所提供的引物进行（未列出）。PCR反应体系10μL：2×GoTaqGreenMasterMix5μL，正反向引物（100μmol·L-1）各0.25μL，DNA模板（200ng·μL-1）0.5μL，ddH2O补足至10μL。反应程序：94℃4min；94℃40s，55℃40s，72℃90s，35个循环；72℃8min，扩增产物16℃保存。上述PCR及酶切产物在含有核酸染料的1.2%琼脂糖凝胶中电泳40min，120V恒定电压，最终结果在ChemiDocMP型凝胶成像系统上显示。2　结果与分析2.1　烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a的检测图1为部分材料Tm-2a的PCR扩增结果。含Tm-2a基因的材料可以扩增出472bp的特异性片段，不含该抗性基因的材料则无扩增产物。经检测，126份材料中，71份含有抗性基因Tm-2a，55份不含抗性基因。2.2　番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1、Ty-2、Ty-3的检测经Ty-1引物双重SNP扩增（图2），含纯合抗图1　烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a检测结果M：Marker；CK1：阳性对照；CK2：阴性对照；1～22：不同番茄材料，下图同。MCK1CK2123456789101112131415161718192021221000bp750bp500bp250bp《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org—37—新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLES性基因的材料扩增出938bp的特异性片段，含杂合抗性基因的材料扩增出948bp和1343bp的特异性片段，不含抗性基因的材料扩增出1343bp的片段。经检测，126份材料中，含纯合抗性基因Ty-1的有7份，杂合的16份，103份材料不含Ty-1基因。经Ty-2引物扩增（图3），含抗性基因的材料扩增出300bp的特异性片段，不含抗性基因的材料扩增出600bp的片段。经检测，56份大、中果型材料中，均不含纯合抗性基因Ty-2，仅DHG-34含有杂合抗性基因。经Ty-3引物扩增（图4），含纯合抗性基因的材料扩增出500bp的特异性片段，含杂合抗性基因的材料扩增出500bp和300bp的特异性片段，不含抗性基因的材料扩增出300bp的片段。经检测，56份大、中果型材料中，含Ty-3纯合抗性基因的有5份，杂合的7份，无抗性基因的材料44份。2.3　叶霉病抗性基因Cf-9的检测经Cf-9引物扩增（图5），含抗性基因的材料扩增出415bp的特异性片段，不含抗性基因的材料则无扩增产物。经检测，126份材料中，有101份含有抗性基因Cf-9，25份不含抗性基因。2.4　晚疫病抗性基因Ph-3的检测经Ph-3引物扩增（图6），所有材料均可扩增出400bp的特异性片段，经BstNI酶切后，含纯合抗病基因的材料扩增出250bp和150bp的特异性片段，含杂合抗病基因的材料扩增出150、250bp和400bp的特异性片段，不含抗病基因的材料不存在酶切位点，呈现400bp的片段。经检测，56份大、中果型番茄材料中，含纯合抗性基因Ph-3的材料有1份，材料编号为DHG-11；含杂合抗性基因Ph-3的有6份，其余不含抗性基因。2.5　枯萎病抗性基因I-2的检测经I-2引物扩增（图7），含抗病基因的材料扩增出1300bp的特异性片段，不含抗病基因的材料则无扩增产物。经检测，126份材料中，68份含有抗性基因I-2，58份不含抗性基因。2.6　根结线虫病抗性基因Mi-1检测经Mi-1引物扩增（图8），含抗性基因的材料图5　叶霉病抗性基因Cf-9检测结果MCK1CK212345678910111213141516171819202122500bp250bp图2　番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-1检测结果MCK1CK2123456789101112131415161718192021222000bp1000bp750bp图4　番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-3检测结果MCK1CK212345678910111213141516171819202122750bp500bp250bp图3　番茄黄化曲叶病毒病抗性基因Ty-2检测结果MCK1CK212345678910111213141516171819202122750bp500bp《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org—38—新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLES表3　大、中果型番茄材料抗性基因检测结果材料编号Tm-2aTy-1Ty-2Ty-3Cf-9Ph-3I-2Mi-1材料编号Tm-2aTy-1Ty-2Ty-3Cf-9Ph-3I-2Mi-1DHG-1+---+-+-DHG-29+---+-+-DHG-2+---+-+-DHG-30+---+-+-DHG-3+---++-+-DHG-31------+-DHG-4+---+---DHG-32----+-+-DHG-5+---+-+-DHG-33+---+---DHG-6+---+-++DHG-34+-+--++-++DHG-7+---+-+-DHG-35+---+-++DHG-8+-----+-DHG-36----+-+-DHG-9+---+--+CG-1----+---DHG-10+---+-++ZFG-1----+---DHG-11++-+-+++ZFG-2+---+-++DHG-12+---+-+-ZFG-3+---+-++DHG-13---+-+--+ZFG-4----+---DHG-14-+--+-+---ZFG-5----+-+-DHG-15++-++---ZHG-1+---+-++DHG-16-+--+-+---ZHG-2----+---DHG-17++--+-+---ZHG-3----+---DHG-18----+---ZHG-4+---+---DHG-19----+-++ZHG-5+---+---DHG-20++-++-++ZHG-6----+---DHG-21+---+-+-ZHG-7++---+---DHG-22----+---ZHG-8++-++-++DHG-23----+-+-ZHG-9----++---DHG-24----+-+-ZHG-10----++---DHG-25----+---HG-1+---+---DHG-26++--+-----HG-2----+-+-DHG-27++--+-++-++HG-3+--++-++DHG-28------+-HG-4++--+--+-++注：“+”表示含有纯合抗性基因，“-”表示未检测到该抗性基因，“+-”表示含杂合抗性基因，下表同。图6　晚疫病抗性基因Ph-3检测结果MCK1CK212345678910111213141516171819202122500bp400bp300bp100bp图7　枯萎病抗性基因I-2检测结果MCK1CK2123456789101112131415161718192021222000bp1000bp750bp图8　根结线虫病抗性基因Mi-1检测结果MCK1CK2123456789101112131415161718192021222000bp1000bp750bp500bp《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org—39—新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLES扩增出1353bp和556bp的特异性片段，不含抗性基因的材料扩增出1287bp的特异性片段。经检测，全部供试材料中，45份材料含有抗性基因Mi-1，81份不含抗性基因。以上的试验结果表明（表3、4），126份供试材料中，含烟草花叶病毒病抗性基因Tm-2a的材料有71份。在番茄黄化曲叶病毒病的3个抗性基因方面，含纯合抗性基因Ty-1的材料7份，杂合16份；仅1份材料含杂合抗性基因Ty-2；含纯合抗性基因Ty-3的材料5份，杂合7份。在真菌性病害方面，含叶霉病抗性基因Cf-9的材料最多，有101份；含纯合晚疫病抗性基因Ph-3的材料1份，杂合6份；含枯萎病抗性基因I-2的材料68份；含根结线虫病抗性基因Mi-1的材料共45份。供试番茄材料中，DHG-27同时含有7个抗性基因；含有6个抗性基因表4　小果型番茄材料抗性基因检测结果材料编号Tm-2aTy-1Cf-9I-2Mi-1材料编号Tm-2aTy-1Cf-9I-2Mi-1材料编号Tm-2aTy-1Cf-9I-2Mi-1XFG-1+-+-+XHG-13+-+++XHG-37--+++XFG-2--+++XHG-14+-+--XHG-38----+XFG-3----+XHG-15+-+--XHG-39++----XFG-4+-+--XHG-16+-+++XHG-40---+-XFG-5--++-XHG-17--+++XHG-41-+-+-+XFG-6--++-XHG-18+---+XHG-42-++--XFG-7++-+--XHG-19+-+--XHG-43++-+--XFG-8+--+-XHG-20++-+-+HGG-1--++-XFG-9----+XHG-21+--+-HGG-2+-++-XFG-10+---+XHG-22+----HGG-3+-+--XFG-11----+XHG-23--+++HGG-4--++-XFG-12++-++-XHG-24+-+--HGG-5+-+--XHG-1-++++XHG-25--+--HGG-6--+-+XHG-2+--+-XHG-26--+++HGG-7+-+--XHG-3+--++XHG-27+-+--HGG-8+-+--XHG-4--++-XHG-28--+-+HGG-9--+++XHG-5+-+++XHG-29-+--+-HGG-10+-+++XHG-6---+-XHG-30+-++-HGG-11--+--XHG-7----+XHG-31-+--+-HGG-12--+++XHG-8--++-XHG-32+----HGG-13+-++-XHG-9+-+--XHG-33+-++-HGG-14+-++-XHG-10---+-XHG-34+-+++CSG-1+-++-XHG-11--+-+XHG-35++-+++XHG-12+-+--XHG-36-++-+的材料有5份，分别为：DHG-11、DHG-20、DHG-34、ZHG-8、HG-4；含有5个抗性基因的有HG-3、XHG-352份材料。3　结论与讨论本试验从126份不同类型的番茄材料中筛选出多份兼抗多种病害的材料。其中含有抗性基因Tm-2a、Cf-9、I-2、Mi-1的材料较多，为今后培育多抗聚合番茄材料提供更多选择。多份材料番茄黄化曲叶病毒病Ty-1和Ty-3抗性基因的检测结果一致，这可能与Ty-1和Ty-3基因都位于6号染色体有关。付蓉蓉等（2011）认为，同时含有纯合抗性基因Ty-1和Ty-3的番茄材料具有更高更稳定的抗性。曹永翔和张喜春（2007）指出，Cf-9抗性基因对中国目前的2个叶霉病优势生理小种具有较强抗性。含有Cf-9抗性基因的供试材料最多，对防御叶霉病有巨大优势。虽然国内外学者在番茄晚疫病抗病性鉴定方面取得了一定成果，但目前生产中还没有真正被应用的抗病品种（赵杨等，2012）。根据本试验结果，含有晚疫病纯合抗性基因的材料只有DHG-11，后期试验应充分合理利用此材料。吴媛媛等《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org—40—新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLES（2010）报道，I-2基因可同时抗枯萎病生理小种1和生理小种2，在番茄抗枯萎病育种中应重视含有该基因的材料。曹永翔和张喜春（2007）还指出，Mi-1基因可抗南方根结线虫、花生根结线虫、爪洼根结线虫3种主要线虫，含有Mi-1基因的材料对番茄连作严重、根结线虫病高发地区具有重要意义。分子标记技术以抗病基因研究为基础，具有操作简便、用时短的优点，可进行高通量的抗病筛选，这对缩短抗病育种年限及减少工作量具有重要意义。培育兼抗多种病害的番茄品种是防治番茄病害最经济有效的方法。本试验对126份番茄材料进行抗性基因的分子标记辅助选择，发现多数材料具有多种抗性基因。下一步试验应进行更多材料的相关抗性基因检测，尽可能检测更多的抗性基因，同时对部分杂合抗病基因材料进一步筛选纯化。孙亚林（2008）指出，在育种过程中运用分子标记辅助选择对基因型进行选择时，所用标记大多与目标基因具有一定的遗传距离，分子标记会与目标基因发生连锁互换，从而在检测过程中出现假阳性，影响最后的选择效果。因此为了验证分子标记技术的准确性，在后期的试验中，应对材料进行室内及田间接种鉴定，进一步确定材料对病害的抗感程度，并且对农艺性状进行观测统计，从而筛选出抗多种病害且农艺性状优良的番茄材料，同时应继续收集番茄种质资源，为今后培育品质优良、兼抗多种病害的番茄品种奠定基础。参考文献曹永翔，张喜春．2007．分子标记技术在番茄抗性育种中的应用．中国农学通报，24（2）：81-88．陈昆松，李方，徐昌杰，张上隆，傅承新．2004．改良CTAB法用于多年生植物组织基因组DNA的大量提取．遗传，26（4）：529-531．杜永臣，严准，王孝宣，李树德，朱德蔚．1999．番茄育种研究主要进展．园艺学报，26（3）：161-169．付蓉蓉，刘杨，陈火英．2011．番茄黄化曲叶病的Ty-1和Ty-3抗性基因的PCR鉴定．分子植物育种（网络版），9：1647-1652．葛乃蓬，崔龙，李汉霞，叶志彪．2014．番茄抗黄化曲叶病毒病抗病基因Ty-1的双重SNP标记的开发．园艺学报，28（1）：195-200．孔凡慧，李冬艳，许向阳，姜景斌，李景富．2015．多抗、耐贮存番茄育种材料的创制．中国蔬菜，（9）：20-25．孙亚林．2008．番茄四个抗病基因的基因标记的创建与辅助选择〔硕士论文〕．武汉：华中农业大学．吴媛媛，李海涛，张子君，邹庆道，吕文书，杨国栋．2009．番茄抗晚疫病基因Ph-3的RAPD及CAPS标记．沈阳农业大学学报，40（6）：716-719．吴媛媛，李海涛，张子君，邹庆道．2010．番茄抗病基因分子标记研究进展．贵州农业科学，38（2）：27-31．徐薪惟．2012．番茄抗枯萎病I-2基因的SNP分子标记及种质资源的筛选〔硕士论文〕．哈尔滨：东北农业大学．赵杨，苗则彦，李颖，白元俊．2012．番茄品种抗病性鉴定研究进展．辽宁农业科学．（6）：38-44．MatthewDR，MohammedAT，DilipRP，RandolphGG，DavidMF，MikelRS．2010．Marker-assistedselectionforcouplingphaseresistancetoTomatospottedwiltvirusandPhytophthorainfestans（LateBlight）intomato．HortScience，45（10）：1424-1428．MerkHL，FooladMR．2012．Parent-offspringcorrelationestimateofheritabilityforLateblightresistanceconferredbyanaccessionofthetomatowildspeciesSolanumpimpinellifolium．PlantBreed，131（1）：203-210．MolecularMarkerDetectionofResistantGenesfrom126TomatoVarietiesCHENBao-ling1，GANGui-yun2，WANGXian-yu1，YUQin-zhi3，LONGAn-si1*（1AgronomyCollegeofGuangxiUniversity，Nanning530004，Guangxi，China；2VegetableResearchInstitute，GuangxiAcademyofAgriculturalSciences，Nanning530007，Guangxi，China；3GuilinCityCashCropsTechnologyExtentionSta-tion，Guilin541001，Guangxi，China）Abstract：Molecularmarkertechnolocywasusedtotest8resistantgenesfrom56tomatomaterialswithlargeandmiddlefruittypesincludingTobaccomosaicvirusdiseaseresistantgeneTm-2a，TomatoyellowleafcurlvirusdiseaseresistantgenesTy-1、Ty-2、Ty-3，leafmouldresistantgeneCf-9，lateblightresistantgenehomozygousPh-3，fusariumwiltresistantgenesI-2，androotknotnematoderesistantgeneofMi-1.Besides，5resistantgenesincludingTm-2a、Ty-1、Cf-9、I-2、Mi-1from70tomatomaterialsofsmallfruittypeswerealsotested.71materialswithresistantgeneTm-2a，7materialswithpureresistantgeneTy-1，16materialswithheterozygosis《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org—41—新优品种栽培管理本期视点产业市场病虫防控研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLES2016（6）：41-46马铃薯内生细菌的分离鉴定及种群多样性分析屈青松　彭万里　翟立明　刘　晓　林榕姗*（山东农业大学生命科学学院，山东农业微生物菌种资源保藏中心，山东泰安271018）摘　要：为了分离鉴定马铃薯内生细菌，对相同种植地点的3个不同品种马铃薯内生细菌的群落结构进行分析；从不同品种马铃薯中分离纯化菌株，进行基因序列分析和生理生化鉴定；取相同部位马铃薯组织进行PCR-DGGE操作，并对DGGE图谱上的条带进行差异性分析。最终分离得到9株内生细菌，鉴定1-1、1-2为枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilissp.），1-3为类芽孢杆菌（Paenibacillussp.），1-4为韩国假单胞菌（Pseudomonaskoreensissp.），1-5、1-6、2-3为解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefacienssp.），2-2为苍白杆菌（Ochrobactrumsp.），3-6为副球菌（Paracoccussp.）。DGGE图谱表明不同品种的马铃薯内生细菌既有差异性又有相似性。最终结果表明3个品种马铃薯内生细菌具有较丰富的种群多样性，且差异性明显，品种可能是影响马铃薯内生细菌群落结构的重要因素。关键词：马铃薯；DGGE；内生细菌；鉴定植物内生菌是指在植物生活史的一定阶段或全部阶段存在于健康植物内部组织的微生物类群，而被感染的寄主植物不会表现明显感染症状（Herreetal．，2007；陈雪英等，2008；李瑞等，2009）。内生菌要从严格消毒的组织和汁液中分离，或从植物组织内直接扩增微生物DNA来证明其存在（Stoneetal，2000；石晶盈等，2006）。内生细菌广泛存在于植物体内，分布于植物的叶、茎、花、果实、屈青松，男，本科生，专业方向：生物科学，E-mail：quqingsong@outlook.com*通讯作者（Correspondingauthor）：林榕姗，女，副教授，硕士生导师，专业方向：资源与环境微生物，E-mail：lrs2680@163.com收稿日期：2016-01-18；接受日期：2016-04-20基金项目：国家级大学生创新创业训练计划项目（201410434084）种子等器官、组织或细胞间隙之中。部分内生细菌的次生代谢物中有时含有与宿主植物相同或相似的活性成分（Fisheretal．，1993；何劲等，2006）。由于内生细菌长期生长于寄主内部，并与之协同进化，故具有促进植物生长、抵抗病虫害的能力，部分内生细菌还有增加寄主对环境胁迫的抗性作用（Munifetal．，2001）。研究表明马铃薯的块茎中具有丰富的内生菌资源（文才艺等，2004），因此研究马铃薯内生细菌的分类及其生物多样性对后续的研究有很大的指导意义。一些不可培养的微生物可通过扩增出其DNA分子的手段证明其存在，变性梯度凝胶电泳（DGGE）就是一种常用的非培养手段研究微生物种群的方法，根据DNA在不同浓度变性剂中变性resistantgeneTy-1，1materialwithheterozygosisresistantgeneTy-2，5materialswithpureresistantgeneTy-3，7materialswithheterozygosisresistantgeneTy-3，101materialswithresistantgeneCf-9，1materialwithpureresistantgenePh-3，6materialswithheterozygosisresistantgenePh-3，68materialswithresistantgeneI-2，45materialswithresistantgeneMi-1.Amongthem，DHG-27contains7resistantgenes.Therewere5materials（DHG-11，DHG-20，DHG-34，ZHG-8，HG-4）containing6resistantgenes.Therewere2materials（HG-3andXHG-35）containing5resistantgenes.Keywords：Tomato；Molecularmarker；Resistantgenedetection《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org