Anza限制酶克隆系统简化了定向克隆

白皮书Anza限制酶克隆系统Anza限制酶克隆系统简化了定向克隆摘要通常使用含有与制备载体末端配对的酶切位点引物对目标DNA序列进行PCR扩增，完成插入片段的制备，用于定向克隆。使用尽管分子克隆近年来有诸多发展，但使用限制性内切酶(REases)T4DNA连接酶将插入片段与载体序列相连接，完成克隆，在ATP和其他DNA修饰酶的传统克隆仍然是用于处理和扩增目的DNA存在的条件下，T4DNA连接酶催化了带有3´羟基和5´磷酸基的双片段和质粒的最常用方法。Invitrogen™Anza™限制酶克隆系链DNA之间磷酸二脂键的形成。统提供了128种限制酶和5种DNA修饰酶，采用独特的统一缓冲液以及快速、方便使用的实验方案，进一步简化了传统克隆实验不幸的是，由于限制酶的非特异性剪切(星号活性)、不兼容的缓流程。我们在此介绍了Anza限制酶克隆系统的特点，以及如何冲液或多酶切温度、以及较长的酶切反应时间，其功能存在诸多使用Anza组分将Emerald绿色荧光蛋白(emGFP)定向克隆至限制。使用多种内切酶同时进行酶切使用的缓冲液可能对其中一Invitrogen™Champion™pET302/NT-His载体中。我们的结果种或多种限制酶效果不佳，导致剪切效率较低。其通常的解决方证明了Anza系统的简便、快速和高效，并提供了将这些新型试剂法是在最佳缓冲液中进行连续酶切，但这增加了样品制备的时整合至标准克隆流程的最佳方法范例。间，并会造成样品损失。下文介绍了Anza系统的优点，并举例说明如何使用这些内切酶和修饰酶将基因定向克隆至简介DNAemGFPChampionpET302/NT-His载体中。在过去40年中，限制性内切酶和DNA修饰酶已成为标准重组DNA技术“工具盒”的重要组成部分。利用这些酶可以将DNAAnza限制酶分子连入质粒，用于载体构建、基因克隆和蛋白 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达实验。要获Invitrogen™Anza™限制酶是Invitrogen最先进的限制酶系统。得最佳克隆效率，必须精心制备载体和插入片段用于连接和转该酶附带统一缓冲液，可用于多种限制酶同时酶切，只需15分化。钟，即便是过夜酶切，亦无星号活性。Anza限制酶只需采用一种简单的酶切实验方案，与DNA底物(如质粒、PCR产物、基因组在传统克隆中，使用一种或两种内切酶酶切质粒，生成可以靶向DNA和lambdaDNA)无关。独特的Invitrogen™Anza™统一缓连接插入片段的末端，完成载体制备。DNA末端可以是平末端，冲液还包含了一种新型示踪染料，可以将酶切后样品直接上样至一般适用于不注重插入片段方向的情况，例如，当生成克隆用于凝胶进行电泳，且适用于大部分下游实验。测序时(请登录thermofisher.com/anza，查阅Anza限制酶克Anza碱性磷酸酶隆系统白皮书中的平末端克隆)；也可以是粘性末端，带有3'-或5'-Invitrogen™Anza™碱性磷酸酶(货号：IVGN2208)可与Anza缓突出端，具体取决于所使用的限制酶。定向克隆需要特定方向地冲液完全兼容，用于去除Anza限制性酶切后残留的5'-磷酸基团，连接插入片段，应使用两种限制酶生成不配对的末端。此外，还例如，在插入片段连接前进行载体去磷酸化。使用Anza碱性磷酸可以使用碱性磷酸酶处理载体，去除5'-磷酸基团。载体去磷酸化酶处理载体可以防止载体自身连接和重新环化，从而降低了克隆可以防止切割片段的再连接，减少转化过程中的载体背景。时的载体背景。AnzaT4DNA连接酶预混液载体制备Invitrogen™Anza™T4DNA连接酶采用4X浓缩预混液配方(货使用所选的Anza限制酶(各1μl)对500ngChampionpET302/号：IVGN2108)，可用于连接带有粘性末端和平末端的DNA片段，NT-His载体(货号：K6302-03)进行酶切。此外，使用Anza一并修复带有3'-羟基和5'-磷酸末端的双链DNA缺口。可在水、TE、步法去磷酸化实验方案处理此500ng载体，在20μL1XAnza洗脱缓冲液或1XAnza缓冲液中进行DNA连接。缓冲液中酶切载体，同时使用1μLAnza碱性磷酸酶进行去磷酸化，37°C孵育15分钟。然后80°C加热20分钟将酶灭活。材料与方法AnzaDNA连接实验方案实验评估了使用Anza限制酶克隆系统将目的基因定向克隆至使用AnzaT4DNA连接酶预混液处理经酶切和去磷酸化的载质粒载体的简单克隆流程。克隆流程如图1所示。体(每个反应10ng)，检验载体自身连接。将去磷酸化的载体与制备好的插入片段以1:3摩尔比混合，然后使用AnzaT4插入片段制备DNA连接酶预混液连接。20μL反应体系，室温孵育15分钟使用ThermoScientific™Phusion高保真PCR预混液(货号：F-后，将反应物置于冰上。在1%agaroseTAE凝胶上分析连531S)，使用含有所选择内切酶位点的引物对从Invitrogen™接产物。pJTI™R4ExpCMVEmGFPpA载体(货号：A14146)扩增EmeraldGFP(emGFP)。使用Invitrogen™PureLink™快速转化和插入片段验证凝胶回收和PCR纯化两用试剂盒(货号：K2200-01)对1%琼使用标准的推荐实验方案，将2μL各连接反应物(包含1ng脂糖TAE凝胶上的各PCR产物进行凝胶纯化。采用Thermo线性化载体)转化至Invitrogen™OneShot™TOP10化学感Scientific™NanoDrop™分光光度计测量DNA浓度，使用所受态大肠杆菌(货号：C4040-03)中。37°C复苏1小时后，选的Anza限制酶(各1μl)，在20μL1XAnza缓冲液体系中酶将100μL各转化产物接种至含有100μg/mL氨苄青霉素的LB切200ng的各种PCR产物，37°C酶切15分钟。然后80°C加琼脂板上。同时转化超螺旋的pUC19和pET302/NT-His载体热20分钟将酶灭活。作为阳性对照。37°C过夜孵育后，计数各个培养板中的菌5'3'5'P3'3'5'酶切加热灭活3'P5'emGFP扩增片段15分钟,37°C20分钟,80°C(~0.7kb；Phusion高保真PCR预混液)ANZAICONS/NothermalinactivationRequestor:SapnaPadmanabhan连接5'15分钟,25°C酶切+3'加热灭活去磷酸化5'分钟分钟3'DTTDDam15,37°Ccm20Cp,G80°CDamDcmCpGDTTDamDcmCpGDamDcmCpGMethylationsensitivityMethylationsensitivityMethylationsensitivityOverlappingmethylationOverlappingmethylationOverlappingmethylationpET302/NT-His载体一步法(5.780kb)°2037°15APAPAPThermalDigestion1StepRE-AP2Step-Heat2Step-Columninactivation连接前需35分钟(单管)puricationAP图1.使用Anza限制酶克隆系统进行定向克隆的实验流程。采用Phusion高保真PCR预混液扩增emGFP基因，然后凝胶纯化，然后按照标准实验方案，使用Anza限制酶进行双酶切处理。No同时使用thermalAnza一步法实验方案对pET302/NT-His载体去磷酸化。使用AnzaT4DNA连接酶预混液连接经酶切生成的带有配对突出端的inactivation插入片段和载体，然后转化option。5落数，利用菌落PCR筛选一定数量的菌落，进行插入片段转化和克隆效率验证。使用标准的T7启动子和T7反向引物，在25μL反应中采用Anza限制酶克隆系统制备的载体和插入片段连接产物的转利用ThermoScientific™DreamTaq™GreenPCR预混液(化效率可达4.8x105至9.6x106。图3比较了载体-插入片段连接货号：K1081)对插入片段进行扩增。在水中4倍稀释PCR(紫色)与仅包含载体背景(灰色)的转化效率。对于每个载体-插产物，上样至Invitrogen™E-Gel™48孔2%琼脂糖凝胶(货入片段连接反应，采用菌落PCR筛选12个菌落，确定克隆效率。号：G8008-02)上电泳观察。将生成约900bp扩增片段的对于上述两种测试的Anza限制酶组合，超过90%的筛选菌落包样品标为阳性，空载体生成约220bp的条带。计算每次反含插入片段(图4)。应的转化效率(CFU/μg载体DNA)和克隆效率(含有克隆插入片段的菌落百分比)。讨论上述实验说明了如何评估使用Anza限制酶克隆系统，利用定向结果克隆策略将emGFP基因克隆至ChampionpET302/NT-His载体连接分析中。使用独特的Anza统一缓冲液检测两种Anza限制酶组合，在连接产物的凝胶电泳分析如图2所示，采用两个内切酶对制15分钟反应内实现完全酶切。备DNA片段：Anza8XhoI/Anza15XmaJI和Anza12XbaI/即便使用两种不同的限制酶，未使用碱性磷酸酶处理的制备载Anza8XhoI。未酶切样品(U)中可以观察到超螺旋和解旋环体也可以自身连接图，泳道样品；使用连接酶状pET302/NT-His质粒。使用Anza限制酶对载体进行完全酶(22)AnzaT4DNA预混液处理时，小的剪切片段可以重新插入载体内，并与较大的切，反应时间15分钟，在泳道1(未使用Anza碱性磷酸酶)和载体片段形成多联体。利用该方法制备的载体用于克隆会导致3(使用Anza碱性磷酸酶)观察到单条线性条带。载体未去磷酸化，质粒可与短的剪切片段连接，形成载体多联体，如泳极高的背景，需要研究人员筛选大量的菌落，寻找一个含有目的片段的菌落。凝胶纯化是一种传统的解决方案，但延长了处理道2所示。当采用Anza一步法DNA酶切和去磷酸化实验方案时间，会导致样品损失，同时增加污染的几率。因此，使用碱性处理时，载体片段无法重新自连，仍保持线性形态(如图2磷酸酶处理是一种首选方法，采用克隆系统可以在独特的中的泳道4)。AnzaT4DNA连接酶可以将去磷酸化的载体与Anza统一缓冲液中实现酶切和去磷酸化。在大多数情况下，可经酶切生成的含有配对突出端的emGFP插入片段连接起来(Anza以使用分钟一步法酶切和去磷酸化实验方案如上文所泳道5)。15DNA(示)，而其他供应商的产品推荐进行15–60分钟酶切(如果需要连续酶切，则时间更长)，然后还需要30–60分钟进行去磷酸化。若AnzaXhol/XmaJlAnzaXbal/XholAnza一步法实验方案无法实现充足的去磷酸化，则Anza克隆系UM12345M12345MU统可提供两步法/加热灭活或两步法/柱纯化实验方案(详情请参见Anza限制酶克隆系统用户指南)。图2泳道3和4中的样品展示了一步法去磷酸化实验方案的效率。Anza碱性磷酸酶不会影响酶切，且当使用AnzaT4DNA连接酶预混液处理时载体也不会发生自连。使用定向克隆实验流程可以获得极佳的转化和克隆效率(图3和4)。使用载体-插入片段连接进行转化可以生成较载体背景约9图2.pET302/NT-His载体和emGFP插入片段的酶切和连接产物。泳道U：至15倍的菌落落。利用菌落PCR进行插入片段确认，验证了上述未酶切的ChampionpET302/NT-His质粒；泳道M：Invitrogen™1KbPlusDNA结果，从12个集落中筛选出了11或12个含有emGFP插入片段的分子量标准(货号：10787018)；泳道1：使用指定的Anza限制酶对进行双酶切的菌落。pET302/NT-His质粒；泳道2：使用AnzaT4DNA连接酶预混液处理的泳道1的产物；泳道3：使用指定的Anza限制酶对和Anza碱性磷酸酶，经一步法DNA酶切和图5比较了使用Anza限制酶克隆系统与传统的定向克隆工作流去磷酸化实验方案进行双酶切并去磷酸化的pET302/NT-His质粒；泳道4：采用程。使用传统的酶及不相容的缓冲液进行插入片段双酶切可能AnzaT4DNA连接酶预混液处理的泳道3的产物；泳道5：采用AnzaT4DNA连接需要采用连续酶切及多次纯化步骤，而所有的Anza限制酶均可酶预混液处理的泳道3的产物和相应的Anza酶酶切的emGFP插入片段。独特的Anza统一缓冲液兼容，只需15分钟即可完全酶切。使用传统的酶进行载体制备可能也需要连续酶切，然后进行一小时的去磷酸化步骤。大部分内切酶可使用一步法酶切和Transformation使用efficienciesAnza限制酶克隆系统usingtheAnzarestrictionAnzaDNAenzymecloning进行定向克隆的转化效率systemfordirectionalcloning去磷酸化实验方案，只需15分钟即可同时进行酶切和去磷酸化，一步法去磷酸化的One-stepdesphosphorylatedpET302/NT-HispET302/NT-His载体vectorTransformation一步法去磷酸化的One-stepdesphosphorylatedefficienciespET302/NT-HispET302/NT-Hisusing载体与thevectoremGFPAnzawith插入片段restrictionemGFPinsert然后加热将酶灭活。使用Anza限制酶克隆系统，可在40分钟内enzymecloningsystemfordirectionalcloning1.00E+07完成载体和插入片段制备。此外，AnzaT4DNA连接酶预混液One-stepdesphosphorylatedpET302/NT-Hisvectorcy)One-stepdesphosphorylatedpET302/NT-HisvectorwithemGFPinsert可在15分钟内实现粘性末端片段的高效连接，用于定向克隆，使4.80E+06NA1.00E+06DNA)D1.00E+07研究人员能在1小时内完成克隆流程。refficino载体ncy)ectv转化效率tio1.00E+054.80E+06NA1.00E+06µgmaDr(CFU/μgroefficinfosnn(CFU/ecta结论vtio1.00E+04rT1.00E+05XhoI/XmaJIXbaI/XhoIµgmaAnza限制酶对rAnzarestrictionenzymepairsofAnza限制酶克隆系统使研究人员能够在60分钟内完成从经扩sn(CFU/图3.a使用1.00AnzaE+04限制酶克隆系统制备的pET302/NT-His连接载体和emGFP插rTCloningXhoI/XmaJIefficienciesusingtheAnzarestrictionXbaI/XhoI增片段、超螺旋质粒到获得连接产物用于转化的过程。本入片段的转化效率。DNAenzymecloningAnzarestrictionsystemforenzymedirectionalpairscloning文显示了Anza系统用于常见定向克隆流程的灵活性。本文中的Cloningefficiency(%ofcoloniescontaininginsert)110%Cloningefficiencies使用Anzausing限制酶克隆系统theAnzarestriction范例是Anza限制酶克隆系统用于传统限制酶克隆流程的方法之100%enzymecloning进行定向克隆的克隆效率systemfordirectionalcloning90%cy一。如需了解更多实际范例，请登录thermofisher.com/anza，查Cloning克隆效率efficiency(含有插入片段的集落(%ofcoloniescontaining%)insert)80%110%70%找Anza限制酶克隆系统用于其他克隆领域的白皮书。100%efficin60%90%cy50%80%40%70%Cloning30%efficin60%20%50%10%40%0%Cloning克隆效率30%XhoI/XmaJIXbaI/XhoI20%Anzarestrictionenzymepairs10%0%XhoI/XmaJIXbaI/XhoIAnzarestrictionAnza限制酶对enzymepairs图4.使用Anza限制酶克隆系统制备的pET302/NT-His连接载体与emGFP插入片段连接的克隆效率。过程传统克隆Anza系统5'3'DigestionHeatinactivation5'P3'3'5'3'P5'所需时间插入片段emGFPamplicon15min,37°C20min,80°C制备使用两种限制酶进行酶切(~0.7kb;PhusionHigh-Fidelity多达PCR小时MasterMix)分钟5'3'2.5DigestionHeat15inactivation5'P3'3'5'3'P5'Ligation加热灭活或柱纯化15min,3720°C分钟20min,80°CemGFPamplicon5'(~0.7kb;PhusionHigh-FidelityPCRMasterMix)15min,25°C3'载体Digestion+Heatinactivationdephosphorylation制备15分钟，包括5'Ligation使用两种限制酶进行酶切多达2.5小时去磷酸化3'15min,37°C20min,80°C5'5'3'Heatinactivation5'P3'15min,25°CDigestion3'3'5'3'Digestion+P5'去磷酸化多达60分钟Heatinactivation--dephosphorylation5'emGFPamplicon15min,37°C20min,80pET302/NT-His°Cvector(~0.7kb;PhusionHigh-FidelityPCRMasterMix)3'加热灭活或柱纯化(5.7kb)15min,3720°C分钟20min,80°C连接Ligation连接5分钟至过夜5'5至15分钟pET302/NT-Hisvector15min,25°C(5.7kb)3'Digestion+Heatinactivationdephosphorylation传统克隆5'Anza系统15min,37°C20min,80°C3'制备时间120分钟至过夜<60分钟pET302/NT-Hisvector图5.使用传统克隆方法与(5.7Anzakb)克隆系统的实验流程比较。如需了解更多信息，请登录thermofisher.com/anza仅供研究使用。不得用于诊断。©2016ThermoFisherScientificInc.版权所有。除特别说明外，所有商标均为ThermoFisherScientific及其附属公司的财产。pZErO-2是Addgene的商标。COL019670516