微生物课件 chapter01

微生物学生命科学与技术学院袁明雄ymingx@mail.hust.edu.cn第一章绪论第一节微生物与人类第二节微生物学的发展史第三节微生物的类群及特点第四节微生物学及其分科第五节微生物学研究现状和发展附：教材与参考文献第七章病毒自19世纪末Ivanowski和Beijerinck分别发现烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）以来，研究病毒的本质及其与宿主的相互作用的病毒学（virology）得到飞速发展，并成为微生物学的重要分支。病毒学研究极大地丰富了微生物学乃至现代生物学的理论与技术，同时，病毒学研究对于有效地控制和消灭人及有益生物的病毒病害，利用病毒对有害生物、特别是害虫进行生物防治，保护人类的健康和人类的经济活动以及人类赖以生存的环境，发展以基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 为中心的生物高新技术产业，具有特别重要的意义。第一节概述同所有其他生物—样，病毒是一类具有基因、复制、进化、并占据着一定的生态学地位的生物实体，是一类体积非常微小、结构极其简单、性质十分特殊的生命形式。一、病毒的特点和定义病毒在细胞外环境以形态成熟的颗粒形式，即毒粒存在。毒粒具有一定的大小、形态、化学组成和理化性质，甚至可以结晶纯化，如同化学大分子一般不 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 现任何生命特征。但是毒粒具有感染性，即具有在一定条件下进入宿主细胞的能力。一旦病毒进入细胞，毒粒便会解体，释放出的病毒基因组具有繁殖性，能利用宿主细胞的大分子合成装置进行复制表达，从而导致病毒的繁殖，并随之表现出遗传、变异等一系列生命特征。由此可见，病毒是一类既具有化学大分子属性，又具有生物体基本特征；既具有细胞外的感染性颗粒形式，又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。病毒以其结构简单、特殊的繁殖方式以及绝对的细胞内寄生，显著区别于其他生物（表7-1）。病毒不具有细胞结构，一些简单的病毒仅由核酸和蛋白质外壳构成，故可把它们视为核蛋白分子。一种病毒的毒粒内通常只含有一种核酸，DNA或者RNA，而且病毒不具有完整的酶系统和能量合成系统，也不具有核糖体。病毒没有生长，也不能以分裂方式进行繁殖。病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，通过其复制与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质，然后由这些新合成的病毒组分装配成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。病毒的这种特殊繁殖方式称做复制。病毒是严格的细胞内寄生物。在生活的细胞内，病毒核酸提供遗传信息，利用宿主细胞的酶、能量合成系统、核糖体、细胞因子以及大分子合成的前体来完成自身的生命活动，病毒的寄生是基因水平的寄生。为概括病毒的本质，病毒学工作者一直试图给“病毒”一个科学而严谨的定义，但迄今仍无定论。Luria等（1968）指出：病毒是一种生物实体，其基因组是能利用细胞的合成系统在活细胞内复制，并合成能将病毒基因组转移到其他细胞中去的特殊颗粒的核酸分子（DNA或RNA）。Fields等则于1990年定义病毒为具有独立于其宿主的进化史的绝对细胞内寄生物，它的DNA或RNA基因组被其所编码的蛋白质壳体化。在病毒学研究工作中，还发现类病毒、卫星RNA和朊病毒等更为简单的感染性因子，并将之归在亚病毒因子之列，因此，现在病毒有真病毒与亚病毒之分，真病毒系前所指经典意义的病毒。二、病毒的宿主范围病毒的宿主范围是病毒能够感染并在其中复制的宿主种类和组织细胞种类。病毒几乎可以感染所有的细胞生物。另—方面，病毒又具有宿主特异性，即就某一种病毒而言，它仅能感染—定种类的微生物、植物或动物。因此，根据病毒的宿主范围可将之分为噬菌体、植物病毒和动物病毒等。从原核生物中分离到的病毒统称为噬菌体，它们包括感染细菌的噬菌体，感染蓝-绿藻的噬蓝（绿）藻体以及感染柔膜细菌（支原体和螺旋体）的支原体噬菌体等。已经鉴定的植物病毒达1000多种，其中以种子植物为宿主的植物病毒最为普遍。在藻类植物和真菌中都发现有病毒存在，它们分别称做噬藻体和真菌噬菌体或称真菌病毒。广义的动物病毒包括原生动物病毒、无脊椎动物病毒和脊椎动物病毒。无脊椎动物病毒以昆虫病毒最为常见。在脊椎动物病毒中，能感染人并引起人类疾病的病毒被归为医学病毒范畴。有些病毒有较宽的宿主谱，如虫媒病毒能在吸血的蚊、蠓、白蛉等节肢动物中繁殖，并以它们为介体在哺乳类和禽类等脊椎动物中广泛传播。三、病毒的分类与命名对已发现的病毒进行有序的分类并给以科学的名称，无论是在病毒的起源与进化研究方面，还是在病毒的鉴定与病毒性疾病防治方面都具有重要的意义。1．病毒的分类原则病毒主要依据包括病毒形态、毒粒结构、基因组性质以及生物学性质进行分类。2．病毒的命名规则由于历史的原因，至今仍在沿用的病毒命名仍十分混乱，很多病毒是以地名、症状或疾病、毒粒形态、人名、缩拼字以及字母或数字命名，完全不能反映病毒的种属特征。为求统一，在已有的工作基础上，国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV）于1996年在第10届国际病毒大会上提出了38条新的病毒命名规则，主要内容如下：病毒分类系统依次采用目（order）、科（family）、属（genus）、种（species）为分类等级，在未设立病毒目的情况下，科则为最高的病毒分类等级。病毒“种”是构成—个复制系，占据特定的生态环境并具有多原则分类特征（包括基因组、毒粒结构、理化特性和血清学性质等）的病毒。病毒种的命名应用少而有实意的词组成。种名与病毒株名一起应有明确含义，不涉及属或科名。已经广泛使用的数字、字母及其组合可以作为种名的形容语，但新提出的数字、字母及其组合不再被接受：病毒“属”是一群具有某些共同特征的种，属名的词尾是“virus”，承认一个新属必须同时承认一个代表种。病毒“科”是一群具有某些共同特征的属，科名的词尾是“viridae”，承认一个新科必须同时承认一个代表属。科与属之间可设或不设亚科，亚科的词尾是“virinae”。病毒目是一群具有某些共同特征的科，目名的词尾是“virales”。3．病毒分类系统在1995年发表的ICTV的病毒分类与命名第六次报告中共报道了4000余种病毒，分别划归为49个病毒科。经过以后的几次修改和补充，现在的分类系统将已发现的病毒分为dsDNA病毒、ssDNA病毒、DNA和RNA逆转录病毒、dsRNA病毒、负意ssRNA病毒、正意ssRNA病毒和亚病毒因子等7大类、62个病毒科，其中有少数病毒科已分别划归于有尾噬菌体目、单组分负意RNA病毒目和成套病毒目中，并且一些真核生物的逆转录转座子，如酵母的Ty，果蝇的copia，gypsy现在分别归于DNA和RNA逆转录病毒类的假病毒科和转座病毒科。另外将卫星、类病毒和朊病毒归在亚病毒因子类，其中类病毒科的词尾为“viroidae”、属名词尾是“viroid”。表7-2概括了一些重要的病毒科及其主要特征。第二节病毒学研究的基本方法同微生物学其他学科分支一样，病毒学的进步完全得益于研究方法和技术手段的发展。一、病毒的分离与纯化通过病毒的分离与纯化获得纯化的、有感染性的病毒制备物是病毒学研究和实践的基本技术。1．病毒的分离病毒的分离是将疑有病毒而待分离的标本（如微生物发酵的倒罐液，可疑病毒感染患者的体液、血液、粪便等临床标本）经处理后，接种于敏感的实验宿主、鸡胚或细胞培养，经过一段时间孵育后，通过检查病毒特异性病理表现或用其他方法来肯定病毒的存在。（1）标本的采集与处理用于分离病毒的标本应含有足够量的活病毒，因此必须根据病毒的生物学性质、病毒感染的特征、流行病学规律以及机体的免疫保护机制，来选择所需要采集标本的种类，确定最适采集时间和标本处理的方法。为了避免细菌污染，标本一般都应加人抗菌素除菌，亦可用离心和过滤方法处理。为了使细胞内的病毒充分释放出来，往往还须以研磨或超声波处理破碎细胞。由于大多数病毒对热不稳定，所以标本经处理后一般部应立即接种。若需运送或保存，数小时内可置50％中性甘油内4℃保存，对需较长时间保存标本最好置-20℃以下或干冰保存。（2）标本接种与感染表现标本接种于何种实验宿主（动物、植物、细菌）、鸡胚或细胞以及选择何种接种途径主要取决于病毒的宿主范围和组织嗜性，同时应考虑操作简单、易于培养、所产生的感染结果容易判定等要求。噬菌体标本可接种于生长在培养液或营养琼脂平板中的细菌培养物，噬菌体的存在表现为细菌培养液变清亮或细菌平板成为残迹平板。若是噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域，即噬菌斑。动物病毒标本可接种于实验动物、鸡胚和多种细胞培养。嗜神经病毒主要采取脑内接种；嗜呼吸道病毒可进行鼻腔接种、或鸡胚的尿囊腔或羊膜腔接种；嗜皮肤病毒可接种动物皮下、皮内或鸡胚绒毛尿囊膜。由于组织培养生长的细胞对病毒的敏感性较体内成熟细胞高，没有特异性抗体和一些非特异性病毒抑制物的影响，培养和接种方法简单，条件易于控制，成本低，所以现在多数动物病毒都利用细胞培养进行分离。接种于细胞培养的标本主要以细胞病变作为病毒感染的指标。大多数动物病毒感染敏感细胞培养都能引起其显微表现的改变，即产生致细胞病变效应，例如细胞聚集成团、肿大、圆缩、脱落、细胞融合形成多核细胞，细胞内出现包涵体，乃至细胞裂解等。若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区域，即蚀斑或称空斑。与之类似，植物病毒接种敏感植物叶片可产生坏死斑，或称枯斑。若经第一次接种而未出现症状时，往往需要进行重复接种，进行盲传。即将取自经接种而未出现感染症状的宿主或细胞培养的 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 ，再接种传递给新的宿主或细胞培养，以提高病毒的毒力或效价。如果标本中有病毒存在，经重复传代，其效价或毒力提高，必定会在新的宿主或细胞培养中产生感染症状。相反，在盲传二代后若仍无感染症状出现，便可否定标本中有病毒存在。2．病毒纯化由于病毒只能在活细胞内繁殖，所以用于病毒制备的起始材料只能是病毒感染的宿主机体、组织或细胞经破碎后的抽提物，或病毒感染的宿主的体液、血液和分泌物，或病毒感染的细胞培养物的培养液等。在这些材料中不可避免地混杂有大量的组织成细胞成分、培养基成分、可能污染的其他微生物与杂质。为了得到纯净的病毒材料，必须利用—切可能的方法将这些杂质成分除去，这就是病毒的纯化。（1）病毒纯化的标准病毒纯化有如下二个标准：第一，由于病毒是有感染性的生物体，所以纯化的病毒制备物应保持其感染性。纯化过程中的各种纯化方法对病毒感染性的影响，以及最终获得的纯化制备物是否符合标准，都可利用病毒的感染性测定进行定量分析，第二，由于病毒具有化学大分子的属性，病毒毒粒具有均一的理化性质，所以纯化的病毒制备物的毒粒大小、形态、密度、化学组成及抗原性质应当具有均一性表现。（2）病毒纯化的方法用于病毒纯化的方法很多。不同的病毒有不同的纯化方法，即使同一种病毒．若在不同的宿主系统中其纯化方法也可能不同。但无论是哪种纯化方法，都是根据病毒的基本理化性质建立：第一，毒粒的主要化学组成是蛋白质，鉴于病毒的高蛋白含量，故可利用蛋白质提纯方法来纯化病毒，如盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等；第二，毒粒具有一定的大小、形状和密度，一般可在10000-100000g的离心场中1-2h沉降，特别是由于毒粒是由许多大分子（蛋白质、核酸等）组成，离心时它们比细胞蛋白沉降更快，而且许多病毒都有较高的浮密度，所以超速离心技术广泛地用于病毒纯化。二、病毒的测定病毒的测定是病毒的定量分析。病毒既能根据其理化性质或免疫学性质进行定量，亦能够根据它们与宿主或宿主细胞的相互作用进行测定。运用不同的方法所进行的测定，具有迥然不同的意义。1．病毒的物理颗粒计数利用一定方法，可以在电镜下直接计算病毒颗粒数目。在动物病毒中，—些裸露病毒的壳体蛋白，特别是许多有包膜的病毒的包膜蛋白能够在一定条件下凝集一定种类的脊椎动物红血球细胞，并且所能凝集血细胞的量与病毒浓度成正比，根据这一原理所设计的血细胞凝集试验亦能用于病毒定量。此外，根据病毒的抗原性质，可以用免疫沉淀试验、酶联免疫吸附试验等方法对病毒进行定量，利用分光光度法也可对病毒定量，但这些方法灵敏性相对较低．多在—些特殊情况下使用。以上所有方法测定的是病毒物理颗粒的数目，即有活力的病毒与无活力病毒数量的总和。而且除电镜计数外，其他方法所测定的是样品中病毒颗粒的相对数量。2．病毒的感染性测定有感染性病毒颗粒数量的测定称做病毒感染性测定，它测定的是因感染所引起宿主或细胞培养某一特异性病理反应的病毒数量。由于病毒的繁殖所引起的宿主反应扩增，以至无论最初接种病毒量的多少，最终所产生的症状可能完全相似，所以用任何感染性测定方法所测得的都不是有感染性病毒颗粒的绝对数量，而是能够引起宿主或宿主细胞—定特异性反应的最小剂量，即病毒的感染单位（infectiousunits，IU）。待测样品中所含病毒的数量，通常以单位体积（ml）病毒悬液的感染单位数目来表示（IU/ml），称作病毒的效价。例如，鼠经鼻孔滴注流感病毒悬液会患肺炎，如果使鼠患肺炎的病毒最小剂量是0.1ml10-6病毒悬液，那么这种流感病毒悬液的感染效价为10’7，即每毫升病毒悬液中有10’7个感染单位的病毒。（1）噬（蚀）斑测定噬斑测定方法最先为噬菌体的感染性测定所建立，以后为动物病毒与植物病毒的测定所借鉴。噬菌体的噬斑测定一般采用琼脂叠层法，一定量的经序列稀释的噬菌体悬液分别与高浓度的敏感细菌悬液以及半固体营养琼脂均匀混合后，涂布在已铺有较高浓度的营养琼脂的平板上，经过孵育后，在延伸成片的细菌菌苔上出现分散的单个噬班，因噬斑数目与加入样品中的有感染性的噬菌体颗粒数量成正比，统计噬斑数目后可计算出噬菌体悬液效价，并以噬斑形成单位（plaqueformingunits，PFU）/毫升表示。动物病毒的蚀斑测定方法与噬菌体的噬斑计数类似，不同的是以生长在固体支持物（培养容器）上的单层细胞代替了生长在营养琼脂平板上的细菌。由于动物病毒在单层细胞培养上所产生的蚀斑表现不同，故有空斑测定、合胞体计数、转化测定和吸附蚀斑测定等不同方法，通过这些方法测定的动物病毒效价以蚀斑形成单位（PFU）表示。植物病毒最为简单的感染性测定方法是坏死斑测定，亦称枯斑测定，即用如金刚砂之类能破坏植物表皮与细胞壁的粉末状物质与一定量的植物病毒混合摩擦植物叶片进行接种，以产生坏死斑的数目来测定病毒样品的效价。（2）终点法对于那些不能用蚀斑法或坏死斑法测定的动、植物病毒可用终点法定量。其方法是取等体积的经10倍或2倍稀释的病毒系列稀释液分别接种同样的实验单元（如某种动物或植物、鸡胚或细胞培养），经过一致时间孵育后，以试验单元群体中的半数（50％）个体出现某一感染反应所需的病毒剂量来确定病毒样品的效价，称做半数效应剂量，并以使50％试验单元出现感染反应的病毒稀释液的稀释度的倒数的对数值表示。根据试验单元的性质及感染反应的性质，半数效应剂量也有不同的表示：如使半数试验宿主死亡的病毒剂量称做半数致死剂量（50％1ethaldose，LD50）；使半数试验宿主发生感染的剂量称做半数感染剂量（50％infectivedose，ID50）；使半数组织培养物遭受感染发生细胞病变的病毒剂量称做半数组织培养感染剂量（50％tissuecultureinfectivedose，TCID50）等。目前，诸如竞争性聚合酶链式反应（PCR）或是竞争性逆转录聚合酶链反应（cRT-PCR）等分子生物学定量方法亦广泛用于病毒研究中。这些方法对于那些体外培养困难的病毒或者病毒含量极微的样品定量分析具有特别的意义。三、病毒的鉴定以物理、化学、生物学乃至分子生物学方法鉴别病毒的性质，描述其特征是病毒分类的前提。另一方面，病毒鉴定是诊断病毒性疾病的可靠方法。1．根据病毒感染的宿主范围及感染表现的鉴定大多数病毒都有相当专一的宿主范围，因而病毒的宿主谱可以作为病毒初步鉴定的指标。病毒感染宿主机体所引起的疾病症状．在鸡胚绒毛尿囊膜上所形成的痘疮的形态，以及在单层细胞培养上所产生的致细胞病变效应表现都有—定特异性，根据病毒这些特征性的表现亦可对其进行初步的鉴定。2．病毒的理化性质鉴定利用电镜技术、分析超速离心技术以及热、紫外线、化学药物、脂溶剂等理化因子对病毒感染性的作用可检查毒粒的大小和形态，测定病毒及其组分的沉降系数、浮力密度和相对分子质量，鉴定病毒的核酸类型，确定病毒对不同理化因子的敏感性。3．血细胞凝集性质鉴定许多病毒能吸附于一定种类的哺乳动物或禽类的红血球细胞表面产生凝集现象。不同的病毒所凝集的血细胞种类以及发生凝集所要求的温度、pH条件可能不同，这些性质给病毒鉴定提供了重要依据。4．病毒的血清学鉴定建立在抗原与抗体特异性反应基础上的免疫学方法是一类非常重要的病毒鉴定方法。免疫沉淀反应、凝集反应、酶联免疫吸附测定、血凝抑制试验、中和试验、免疫荧光、免疫电镜、放射免疫以及单克隆抗体等技术都广泛用于病毒鉴定工作。在这些血清学方法中，利用病毒的性质来检测抗原-抗体反应的方法有血凝抑制试验和中和试验。前者是根据特异性的病毒抗体与病毒表面有血凝活性的蛋白结合，可抑制血细胞凝集发生这一性质设计的；后者则是建立在病毒中和作用的基础上，即某些特异性病毒抗体与毒粒作用，能够使其失去感染性，抑制病毒繁殖，这类病毒抗体称做中和抗体，一种病毒的感染性只能被特异性的中和抗体中和，而且中和一定量病毒的感染性必须有一定效价的病毒抗血清。血清学方法所进行的病毒抗原分析可使病毒鉴定更为难确、精细。它们对于病毒的最终鉴定，乃至区分同型病毒的不同毒株，了解病毒的亲缘关系以及病毒性疾病的诊断都是至关重要的。5．病毒鉴定的分子生物学方法运用变性或不变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质的肽图与N末端氨基酸分析、核酸的酶切图谱和寡核苷酸图谱分析、分子杂交、序列测定、多聚酶链式反应等生物化学与分子生物学方法鉴定病毒核酸、蛋白质等组分的性质，为在分子水平上阐明病毒的性质，对其进行准确的分类鉴定提供了更为直接可靠的证据，而且对于病毒性疾病的实验诊断也具有特殊的意义。例如，至今尚不能在细胞培养中增殖的人乳头瘤病毒的检测主要是用各种类型的核酸杂交方法。其分型亦是根据基因组的序列同源性，分型界限是50％的同源性，超过50％的同源性则为亚型，若仅有几个酶切位点的区别则称做变异株。第三节毒粒的性质毒粒是病毒的细胞外颗粒形式，也是病毒的感染性形式。Dulbacco等（1985）指出：病毒颗粒或毒粒是一团能够自主复制的遗传物质，它们被蛋白质外壳所包围，有的还具有包膜，以保护遗传物质免遭环境破坏，并作为将遗传物质从一个宿主细胞传递给另一个宿主细胞的载体。本节将着重介绍毒粒的形态结构，化学组成以及理化性质。一、毒粒的形态结构毒粒具有一定的大小，形状和结构组成，这些特征为病毒的分离纯化、分类鉴定、病毒的进化和遗传功能研究提供了可靠的依据。1．病毒的大小和形状不同病毒的毒粒大小差别很大，最小者如植物的双粒病毒直径仅18-20nm，最大者如动物的痘病毒的大小达300-450nm×170-260nm。尽管已发现的病毒达数千种。但毒粒的形状大致可分球形颗粒（或称拟球形颗粒）、杆状颗粒和复杂形状颗粒（如蝌蚪状，卵形）等少数几类。另外有的病毒毒粒呈多形性，如流感病毒新分离的毒株常呈丝状，在细胞内稳定传代后则为直径约100nm的拟球形颗粒。2．毒粒的壳体结构病毒毒粒的基本结构是包围着病毒核酸的蛋白质外壳，即壳体或称衣壳。壳体是由大量的同一的壳体蛋白单体分子，即蛋白质亚基以次级键结合形成的，蛋白质亚基又称原体根据相对简单的几何学原理，病毒的壳体主要有两种结构类型。（1）螺旋对称壳体病毒壳体呈螺旋对称，即蛋白质亚基有规律地沿着中心轴呈螺旋排列，进而形成高度有序、对称的稳定结构（图7-1）。病毒的螺旋壳体的特征可以用以下参数描述：螺旋长度、螺旋直径、轴孔直径、螺距及每一螺转上的蛋白质亚基数目等。螺旋壳体的直径是由蛋白质亚基的特征决定的，其长度则是由与壳体结合的病毒核酸分子的长度所决定。在螺旋对称壳体中，病毒核酸以多个弱键与蛋白质亚基相结合，不仅可能控制螺旋排列的形式、壳体的长度，而且核酸与壳体的相互作用还增加了壳体结构的稳定性。（2）二十面体对称壳体构成对称结构壳体的第二种方式是蛋白质亚基围绕具立方对称的正多面体的角或边排列，进而形成一个封闭的蛋白质的鞘。几何学中的立方对称结构实体包括正四面体、正六面体、正八面体、正十二面体和正二十面体。在这些拓扑等价多面体中，若以一定数目的亚基排列成具有一定表面积的立方对称实体，以二十面体容积为最大，能包装更多的病毒核酸，所以病毒壳体多取二十面体对称结构。在病毒的二十面体壳体构成中，一定数目的蛋白质亚基以特殊方式聚集形成在电镜下可见的壳粒，壳粒也称形态学单位。在二十面体壳体形成时，若干个蛋白质亚基聚集形成壳粒，若干个壳粒结合构成壳体。壳粒通常都是由5个或6个蛋白质亚基聚集形成（图7-2），因而它们分别称做五聚体和六聚体。因为五聚体和六聚体各与5个和6个其他的壳粒相邻，所以又分别称做五邻体和六邻体，二十面体壳体也存在其他的构成方式，如SV40的二十面壳体仅由72个中心凹陷的圆筒状的五聚体构成。12个五聚体占据二十面体的顶并分别与5个相邻的五聚体结合，60个非顶五聚体分别与6个相邻的五聚体结合。在二十面体壳体中，病毒核酸盘绕折叠在壳体的有限空间内。在病毒二十面体壳体制备物中，常发现不具有核酸的空壳体存在，这表明核酸对于二十面体壳体的形成并非必需，然而空壳体较完整的病毒颗粒更容易降解，所以核酸的结合有助于增加二十面壳体的稳定性。（3）双对称结构病毒壳体除螺旋对称和二十面体对称两种主要结构类型外，亦有少数病毒壳体为双对称结构。具有双对称结构的典型例子是有尾噬菌体，其壳体由头部和尾部组成。包装有病毒核酸的头部通常呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。图7-3所示的是T4噬菌体的壳体结构。3．病毒的包膜结构病毒的壳体与核心一起构成的复合物为核壳。一些简单的病毒，如烟草花叶病毒、脊髓灰质炎病毒等的毒粒就是—个核壳结构。这类毒粒也称做裸露毒粒。而—些复杂的病毒的核壳外还覆盖着一层称做包膜的脂蛋白膜。包膜是病毒以出芽方式成熟时，由细胞膜衍生而来的。病毒包膜的基本结构与生物膜相似，是脂双层膜。在包膜形成时，细胞膜蛋白被病毒的包膜糖蛋白取代。包膜糖蛋白靠一跨膜固着肽附着于脂双层，其主要的结构域凸出在包膜外侧，形成在电镜下可识别的包膜突起，另有—较小的结构域在包膜内侧。一些无包膜的病毒表面也有一些向外凸出的突起，如腺病毒二十面体核壳的顶上的五邻体纤维，这些突起与病毒的包膜突起一起称做刺突。病毒包膜有维系毒粒结构，保护病毒核壳的作用。特别是病毒的包膜糖蛋白，具有多种生物学活性，是启动病毒感染所必需的。4．毒粒的结构类型根据病毒毒粒有无包膜以及壳体的对称形式，可以将毒粒分为四种主要结构类型（图7-4）：裸露的二十面体毒粒；裸露的螺旋毒粒；有包膜的二十面体毒粒；有包膜的螺旋毒粒。在以上4种结构类型中，不同病毒的毒粒结构复杂程度有很大的区别。还有些病毒，如有尾噬菌体、痘病毒等结构更为复杂，不能包括在这些结构类型之内。二、毒粒的化学组成毒粒的基本化学组成是核酸合蛋白质。有包膜的病毒和某些无包膜的病毒除核酸外，还含有脂类和糖类。有的病毒还含有聚胺类化合物，无机阳离子等组分。1．病毒的核酸核酸是病毒的遗传物质。—种病毒的毒粒只含有一种核酸，DNA或是RNA。除逆转录病毒基因组为二倍体外，其他病毒的基因组都是单倍体。（1）病毒核酸的类型病毒核酸存在单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）、单链RNA（ssRNA）和双链RNA（dsRNA）4种主要类型。除双链RNA外，其他各类核酸又有线状形式和环状形式，表7-3列举了病毒的主要核酸类型。单链病毒核酸（主要是RNA）能够按照它的极性或意义进行分类。如果病毒ssRNA可以作为mRNA直接进行翻译，则规定它为正极性（+意义），称为正链RNA（+RNA）。如果病毒ssRNA核苷酸序列与其mRNA序列互补，即规定它为负极性（-意义），称为负链RNA（-RNA）。也有某些病毒的RNA是双意，即部分为正极性、部分为负极性。对于病毒的单链DNA，如果与其mRNA序列相同，即为正极性，称正链DNA（+DNA）。如果其核苷酸序列与mRNA互补，即为负极性，即负链DNA（-DNA）。根据病毒核酸转染的结果，即将从病毒毒粒或病毒感染的细胞抽提分离的病毒核酸实验性地导人细胞，若能启动病毒复制循环，产生子代毒粒，则此种病毒核酸为感染性核酸，否则为非感染性核酸。（2）核酸的结构特征不同病毒的核酸均可能具有各自不同的结构特征，主要包括：粘性末端、循环排列和末端重复序列等。分段基因组，即有些病毒基因组是由数个不同的核酸分子构成。许多真核生物的正链RNA病毒的基因组同真核细胞mRNA一样，5’末端有帽子结构，3’末端有聚腺苷酸即poly（A）结构。2．病毒的蛋白质病毒蛋白质根据其是否存在于毒粒中分为结构蛋白和非结构蛋白两类：前者系指构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质，包括壳体蛋白、包膜蛋白和存在于毒粒中的酶等；后者系指由病毒基因组编码的，在病毒复制过程中产生并具有一定功能，但不结合于毒粒中的蛋白质。在此主要介绍病毒的结构蛋白。（1）壳体蛋白壳体蛋白是构成病毒壳体结构的蛋白质，由一条或多条多肽链折叠形成的蛋白质亚基是构成壳体蛋白的最小单位。—些简单的病毒的壳体蛋白仅由一种或少数几种蛋白质构成，而一些复数病毒则可多达20余种。亚基的组成和数目的不同是区别不同的壳体蛋白的标志。壳体蛋白的功能是构成病毒的壳体，保护病毒的核酸。无包膜病毒的壳体蛋白参与病毒的吸附、进入、决定病毒的宿主嗜性，同时它们还是病毒的表面抗原，并还可能有其他的功能活性。（2）包膜蛋白构成病毒包膜结构的病毒蛋白质包括包膜糖蛋白和基质蛋白两类。包膜糖蛋白是由多肽链骨架与寡糖侧链．通过β-N-t糖苷键将糖链的N-乙酰葡萄糖胺与肽链的天冬酰胺残基连结形成。根据寡糖链中单糖残基组成的区别，包膜糖蛋白又分为简单型糖蛋白和复合型糖蛋白两类。除通常的N-糖苷键外，有的病毒包膜糖蛋白，如鼠冠状病毒E1糖蛋白是通过O-糖苷键，在丝氨酸或苏氨酸残基糖基化。包膜糖蛋白是病毒的主要表面抗原，包膜糖蛋白多为病毒吸附蛋白，它们与细胞受体相互作用启动病毒感染发生，有些病毒的包脂糖蛋白还介导病毒的进入，此外它们还可能具有凝集脊椎动物红血球细胞、细胞融合以及酶等活性。有些有包膜病毒，如正粘病毒、副粘病毒等的包膜结构中，还含有一种非糖基化的基质蛋白或称内膜蛋白。基质蛋白构成膜脂双层与核壳之间的亚膜结构。具有支撑包膜，维持病毒结构的作用。更重要的是它介导核壳与包膜糖蛋白之间的识别，在病毒出芽成熟过程中发挥重要作用。（3）毒粒酶参与病毒感染复制的酶有三个来源：—是宿主细胞酶或经病毒修饰改变了的宿主细胞酶；二是病毒的一些非结构蛋白，如正链RNA病毒在复制时产生的依赖于RNA的RNA聚合酶；三是存在于毒粒内的酶即毒粒酶。毒粒酶根据其功能大致可分为两类：一类是参与病毒进入，释放等过程的酶，如T4噬菌体的溶菌酶、流感病毒的神经氨酸酶等；另一类是参与病毒的大分子合成的酶，如逆转录病毒、嗜肝DNA病毒的逆转录酶，所有dsRNA病毒、负链RNA病毒以及—些dsDNA病毒毒粒中存在的转录酶等。一些复杂的病毒，如在细胞质内复制的痘病毒还具有许多参与RNA转录物加工和DNA复制的酶。除以上所述结构蛋白外、在某些病毒的毒粒中还有其他病毒蛋白质，甚至有宿主的蛋白质。例如，腺病毒基因组dsDNA和脊髓灰质炎病毒基因组+RNA的5’端都结合有蛋白质。在乳多空病毒中有细胞组蛋白与病毒DNA结合形成染色体祥复合物。3．病毒的脂类有包膜病毒的包膜内含有来源于细胞的脂类化台物。其中50％-60％为磷脂，余下的多为胆固醇。由于病毒包膜的脂类来源于细胞，所以其种类与含量均具有宿主细胞特异性。脂类构成了病毒包膜的脂双层结构。此外，在少数无包膜病毒，如T系噬菌体、λ噬菌体以及虹彩病毒科的某些成员的毒粒中也发现脂类的存在。4．病毒的糖类有些病毒、其中绝大多数是有包膜病毒含有少量的糖类。它们主要是以寡糖侧链存在于病毒糖蛋白和糖脂中，或以粘多糖形式存在。除了有包膜病毒的糖蛋白突起外，某些复杂病毒的毒粒还含有内部糖蛋白或者糖基化的壳体蛋白。由于这些糖类通常是由细胞合成的，所以它们的组成与宿主细胞相关。5．其他组成在一些动物病毒、植物病毒和噬菌体的毒粒内，存在—些如丁二胺、亚精胺、精胺等阳离子化合物。在某些植物病毒中还发现有金属阳离子存在。这些含量极微的有机阳离子或无机阳离子与病毒核酸呈无规则的结合，并对核酸的构型产生一定的影响。它们的结合量仅与环境中相关离子浓度有关，是病毒装配时从环境中获得的不恒定成分。第四节病毒的复制病毒是严格细胞内寄生物，它只能在活细胞内繁殖。病毒进入细胞后，具有感染性的毒粒消失，存在于细胞内的是有繁殖性的病毒基因组。病毒的繁殖是病毒基因组复制与表达的结果，这是一种完全不同于其他生物的繁殖方式。一、病毒的复制周期1．一步生长曲线一步生长曲线是研究病毒复制的—个经典试验，最初是为研究噬菌体的复制而建立，以后推广到动物病毒和植物病毒的复制研究中。基本方法是以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，或高倍稀释病毒-细胞培养物，或以抗病毒抗血清处理病毒-细胞培养物以建立同步感染，然后继续培养，定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线（图7-5）。从一步生长曲线中，可以获得病毒繁殖的两个特征性数据：潜伏期和裂解量。潜伏期是毒粒吸附于细胞到受染细胞释放出子代毒粒所需的最短时间，不同病毒的潜伏期长短不同，噬菌体以分钟计，动物病毒和植物病毒以小时或天计。裂解量是每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目，其值等于潜伏期受染细胞的数目除以稳定期受染细胞所释放的全部子代病毒数目，即等于稳定期病毒效价与潜伏期病毒效价之比。通过一步生长曲线测定，噬菌体的裂解量—般为几十到上百个，植物病毒和动物病毒可达数百乃至上万个。2．隐蔽期一步生长曲线反映了病毒在细胞培养物中复制的动力学性质。运用成熟前裂解方法，研究病毒在细胞内的复制动态发现，在潜伏期的前—段，受染细胞内检测不到感染性病毒，后一阶段，感染性病毒在受染细胞内的数量急剧增加，自病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性病毒的时间为隐蔽期。不同病毒的隐蔽期长短不同，例如，DNA动物病毒的隐蔽期为5-20h，RNA动物病毒为2-10h。隐蔽期病毒在细胞内存在的动力学曲线呈线性函数，而非指数关系．从而证明子代病毒颗粒是由新合成的病毒基因组与蛋白质经装配成熟，而不是通过双分裂方式产生。3．病毒的复制周期病毒的复制过程概括于图7-6中。病毒感染敏感的宿主细胞，首先是毒粒表面的吸附蛋白与细胞表面的病毒受体结合，病毒以一定方式进入细胞。经过脱壳，释放出病毒基因组。然后病毒基因组在细胞核和/或细胞质中，进行病毒大分子的生物合成：一方面病毒基因组进行表达，产生：①参与病毒基因组复制的蛋白质；②包装病毒基因组成为病毒颗粒的蛋白质；③改变受染细胞结构和/或功能的蛋白质。另一方面病毒基因组进行复制产生子代核酸，并装配成病毒核壳。若是无包膜病毒，装配成熟的核壳就是子代毒粒，并以—定方式释放到细胞外；若是有包膜病毒，核壳通过与细胞膜的相互作用以出芽方式释放，并在此过程中获得包膜。这样—个自病毒吸附于细胞开始，到子代病毒从感染细胞释放到细胞外的病毒复制过程称为病毒的复制周期或称复制循环。病毒的复制周期依其所发生的事件顺序分为以下五个阶段：①吸附；②侵入；③脱壳；④病毒大分子的合成，包括病毒基因组的表达与复制；⑤装配与释放。病毒的吸附、侵入和脱壳又称做病毒感染的起始。二、病毒感染的起始病毒感染细胞，毒粒必须吸附于细胞表面，并进入细胞，经脱壳释放病毒基因组。1．吸附吸附是病毒表面蛋白与细胞受体特异性的结合，导致病毒附着于细胞的表面，这是启动病毒感染的第一阶段。（1）病毒吸附蛋白病毒吸附蛋白（viralattachmentprotein，VAP）是能够特异性地识别细胞受体并与之结合的毒粒表面的结构蛋白分子，亦称做反受体。无包膜毒粒的VAP往往是核壳的组成部分，有包膜病毒的VAP为包膜糖蛋白，如T-偶数噬菌体的尾丝蛋白，流感病毒包膜表面的血凝素糖蛋白等。—些复杂的病毒，如痘苗病毒、单纯疱疹病毒有数种反受体分子，而且反受体可能有几个功能结构域，各与不同的受体作用。编码反受体的基因的突变，能够灭活或破坏反受体的蛋白水解酶、β-糖苷酶及中和抗体等均可导致反受体与受体相互作用能力的丧失，进而影响病毒的感染性。（2）细胞受体病毒的细胞受体亦称病毒受体，系指能被病毒吸附蛋白特异性地识别并与之结合，介导病毒进入细胞，启动感染发生的细胞表面组分。现在已知病毒受体是细胞的功能性物质，为细胞正常生长代谢所必需，而非病毒专一性的成分，例如，狂犬病毒的受体是细胞表面的乙酰胆碱受体，单纯疱疹病毒的受体是硫酸乙酰肝素。不同种系的细胞具有不同病毒的细胞受体，病毒受体的细胞种系特异性决定了病毒的宿主范围。最近还发现人免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus，HIV）等的感染需要辅助受体的参与。这种稍后与病毒结合并引发病毒穿入或膜融合的细胞组分又称为第二受体。但至今仍未发现植物病毒的细胞受体存在。（3）病毒的吸附过程病毒吸附蛋白与细胞受体间的结合力来源于空间结构的互补性，相互间的电荷、氢键、疏水性相互作用及范德华力。不同病毒的吸附速率常数有很大差别。而且影响细胞受体和病毒吸附蛋白的活性的因素，如细胞代谢抑制物、蛋白酶、糖苷酶、脂溶剂、抗体等，以及包括温度、离子浓度和pH在内的环境因素均可影响病毒的吸附反应。2．侵入侵入又称病毒内化，它是一个病毒吸附后几乎立即发生，依赖于能量的感染步骤。不同的病毒-宿主系统的病毒侵入机制不同。有伸缩尾的T-偶数噬菌体采取注射方式将噬菌体核酸注入细胞，其过程如图7-7所示。动物病毒能以下列不同的机制进入细胞：①完整病毒穿过细胞膜的移位方式；②利用细胞的内吞功能进入细胞，这种侵入方式又称病毒入胞，以内吞方式进入的病毒颗粒累积在细胞质小泡内，还须以一定方式释放到细胞质中；③毒粒包膜与细胞质膜的融合，病毒的内部组分释放到细胞质中。无包膜病毒以前两种机制侵入细胞。以内吞方式进人的有包膜病毒亦需要通过包膜与小泡膜的融合将内部组分释放入细胞质中。病毒包膜与细胞膜的融合皆需要病毒包膜中有融合活性的包膜蛋白与细胞膜中特定的蛋白组分相互作用。植物有角质化或腊质化的表皮和坚硬的细胞壁，所以植物病毒只能通过因人为地或自然的机械损伤所形成的微伤口进入细胞；或者靠携带有病毒的媒介，主要是靠有吮吸式口器的昆虫取食将病毒带入细胞。植物病毒一旦进入细胞后，增殖产生的子代病毒或病毒核酸可通过病毒编码的运动蛋白与胞间连丝的相互作用从受染细胞进入邻近细胞。3．脱壳脱壳是病毒侵入后，病毒的包膜和/或壳体除去而释放出病毒核酸的过程，它是病毒基因组进行功能表达所必需的感染事件。至今对于病毒脱壳的机制和细节仍缺乏了解，但病毒与细胞受体的作用对于病毒脱壳是至关重要的。T-偶数噬菌体脱壳与侵入是一起发生的，仅有病毒核酸及结合蛋白进入细胞，壳体留在细胞外。动物病毒存在不同的结构类型和不同的侵入方式，其脱壳过程也较复杂。许多病毒（如正粘病毒、副粘病毒、小RNA病毒）的保护性包膜或壳体在病毒进入受染细胞时除去。疱疹病毒、乳多空病毒和腺病毒感染时，壳体沿着细胞骨架从进入位点移到核孔，很可能因细胞因子激活病毒功能，释放病毒DNA或DNA-蛋白质复合物进入核内，空壳最后降解。呼肠孤病毒的壳体仅部分除去。而所有负链RNA病毒的基因组都不完全从壳体释放。痘病毒分两阶段脱壳：首先外壳由宿主细胞酶除去，然后在感染后合成的病毒脱壳酶的作用下，病毒DNA从核心中释放。三、病毒大分子的合成病毒大分子的合成是通过病毒基因组的表达与复制完成的，在这一过程中所发生的各种病毒复制事件存在着强烈的时序性。病毒复制的时序性主要表现为基因组转录的时间组织，即病毒基因组的转录是分期进行的。发生在病毒核酸复制以前的转录为早期转录，所转录的基因称作早期基因，早期基因编码的早期蛋白主要是参与病毒核酸复制、调节病毒基因组表达，以及改变或抑制宿主细胞大分子合成的蛋白质。在病毒核酸复制开始或复制后所进行的转录为晚期转录，所转录的基因称作晚期基因，晚期基因编码的晚期蛋白主要是构成子代毒粒所需的结构蛋白。一些复杂的病毒基因组转录的时间组织分得更细，如T4噬菌体的转录分为立即早期、迟早期、中期和晚期。根据病毒大分子合成过程中所发生事件的时间顺序，可以将此过程划分为三个连续的阶段：①病毒早期基因的表达；②病毒基因组的复制；③病毒晚期基因的表达。1．噬菌体的大分子合成除光滑噬菌体科等少数例外，绝大多数噬菌体都是DNA噬菌体，且除微噬菌体科和丝杆噬菌体科外，其余的都是双链DNA噬菌体。（1）dsDNA噬菌体研究得最为充分的T4噬菌体的大分子合成如图7-8所示。T4噬菌体早期mRNA由大肠杆菌RNA多聚酶完成，早期基因编码的蛋白质参与宿主控制，病毒DNA复制和晚期基因表达的调节，某些早期病毒特异性酶也能降解宿主DNA，从而停止宿主基因表达并为病毒DNA合成提供前体。噬菌体编码的某些早期蛋白质还可取代σ因子与宿主转录酶结合，从而改变了转录酶的启动子特异性，使之自噬菌体晚期启动子起始转录。同时，晚期转录也需要噬菌体DNA的复制，只有正在复制、结构发生改变的病毒DNA才能作为晚期转录的模板。早期基因与晚期基因定位于不同的DNA链上，它们的转录分别以不同方向进行。与T4噬菌体不同，T7噬菌体的晚期转录由病毒早期基因编码的转录酶完成，且其所有的mRNA都是从右向链转录。图7-9表示T7噬菌体的基因组和基因合成蛋白质的顺序。T4DNA复制有两个特点：一是由于T4DNA中胞嘧啶被羟甲基胞嘧啶取代，所以在其DNA复制开始前，必须由噬菌体编码的酶合成羟甲基胞嘧啶，并且在T4DNA合成后，羟甲基胞嘧啶被葡萄糖基化，以保护T4DNA免遭大肠杆菌核酸酶降解，类似的例子亦见于其他的噬菌体DNA，如λ噬菌体DNA合成后腺嘌呤和胞嘧啶被甲基化；二是在T4DNA复制过程中，由6-8个DNA拷贝结合形成非常长的DNA链，这些由数个单位长度DNA以相同方向连结形成的DNA复制分子称做多连体。T7噬菌体DNA和λ噬菌体DNA复制时也有多连体形成。（2）ssDNA噬菌体属于微噬菌体科的噬菌体由φX174基因组为环状正链DNA。由φX174DNA进入细胞后，在宿主的DNA多聚酶作用下形成双链DNA，这种病毒单链核酸复制产生的双链复制分子称做复制型（replicativeform，RF），然后以复制型为模板进行复制和转录、产生更多的复制型、mRNA和子代+DNA基因组（图7-10）。（3）RNA噬菌体大多数RNA噬菌体都是正链RNA噬菌体，属光滑噬菌体科，如噬菌体Qβ、MS2、R17等。其基因组RNA可作为mRNA指导噬菌体蛋白质的合成，其中一种蛋白质产物是病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶。在此复制酶作用下，以基因组+RNA为模板产生双链复制型，然后复制酶利用复制型的负链为模板，合成数千个+RNA拷贝。这些+RNA或是作为模板合成RF，以进一步复制更多的+RNA；或是作为mRNA进行病毒蛋白质合成。最后新合成的+RNA基因组结合于壳体中，产生成熟的病毒颗粒（图7-11）。2．动物病毒的大分子合成动物病毒基因组的结构类型多种多样，每一种都有其独特的复制方式和表达策略（图7-12）。此外，不同病毒的大分子合成位点亦有所不同。DNA病毒的基因组复制与转录在细胞核中进行，但嗜肝DNA病毒的基因组复制以及痘病毒的基因组复制与转录是在细胞质中进行。RNA病毒基因组的复制与转录都在细胞质中进行，而正粘病毒基因组的复制在细胞核内进行，逆转录病毒基因组的复制在细胞质和细胞核中进行。**割裂基因（splitgene）的发现20世纪70年代以前，人们关于基因的概念主要源于细菌遗传学研究，对于真核生物基因结构与表达调控所知甚少。1976年，美国冷泉港实验室罗伯特（RichardRoberts）领导的研究小组发现，起始于相同的11个核苷的腺病毒的几种mRNA在与腺病毒DNA杂交时，这11个核苷不能与DNA链结合。该实验室的研究者还发现，腺病毒基因组一个片段可与来自另一不同区域的mRNA杂交。这些发现开始彻底动摇由细菌研究得来的连续基因的概念。正当这些富有魅力的现象激起罗伯特等更大兴趣之时，麻省理工学院夏普（Phillipsharp）领导的研究小组也获得关于腺病毒基因的类似重大发现。罗伯特与本实验室的电镜专家及时进行了讨论，由他们精心设计了腺病毒DNA与mRNA杂交的实验。所获得的电镜结果显示，含11个核苷的mRNA起始区未与mRNA的其余部分相连，而是结合到DNA链另一区段。更令人感兴趣的是在与mRNA结合的DNA链上，有两个未与mRNA杂交的向外突出的DNA环。根据这些发现，罗伯特等作出革命性结论，真核生物DNA编码的遗传信息是不连续的，即真核基因与原核基因不同，是割裂基因。与此同时，夏普根据其发现亦得出同样的结论。在1977年6月的冷泉港会议上他们报告了这些结果，并在生物学界引起轰动。罗伯特和夏普的发现不但完全革新了传统的基因概念，而且对真核生物基因的表达调控和进化研究以及生物技术产生了巨大的影响，因此他们分享了1993年诺贝尔生理和医学奖。获奖时他们曾风趣地回顾说，当他们观察腺病毒DNA与其mRNA形成的不连续杂交分子图像时，他们便意识到诺贝尔已带着他的遗产敲开了他们的心扉。（1）DNA动物病毒与真核细胞相同，DNA动物病毒的转录与翻译不互相偶联，因此，转录和转录后的加工、修饰以及转运是病毒mRNA合成的突出特征。动物病毒基因组DNA转录产生的初始转录物要经过包括：①3’末端腺苷化；②5’末端加上帽子结构；③甲基化；④拼接等加工修饰才能成熟为功能性mRNA。大多数DNA动物病毒至少早期基因的转录是利用宿主转录酶进行的，但痘病毒早期mRNA由结合于毒粒核心的病毒转录酶合成。动物病毒DNA的复制也和噬菌体一样，依赖于病毒早期蛋白的功能。—些小型DNA病毒依靠宿主细胞DNA聚合酶进行DNA复制，如细小病毒DNA仅能在处于S期的细胞核内复制，而像疱疹病毒和痘病毒等大型DNA病毒的DNA复制都需要病毒编码的DNA聚合酶。乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）DNA在受染细胞的核内利用宿主RNA聚合酶进行转录并产生几种mRNA，其中最大的3.4kbRNA称做前基因组（progenome），然后RNA前基因组与DNA聚合酶和核心蛋白结合形成未成熟的核心壳粒，继而逆转录酶利用蛋白质为引物，以前基因组+RNA为模板转录产生-DNA，前基因组RNA几乎全部被RnaseH降解，余下的RNA片段再作为DNA聚合酶的引物拷贝-DNA，产生子代dsDNA。（2）RNA动物病毒与DNA动物病毒相比较，RNA动物病毒之间的复制策略存在更大的差别。基于它的基因组复制和转录的模式，可将其分为4个主要类型。①正链RNA病毒如小RNA病毒、黄病毒之类的正链RNA病毒的基因组RNA具有mRNA活性，可直接翻译成聚蛋白，再经宿主和病毒编码的蛋白酶切割产生不同的病毒蛋白质。病毒RNA复制是由新合成的病毒复制酶以基因组+RNA为模板合成-RNA，再以-RNA为模板合成新的+RNA病毒基因组。在复制过程中，有双链形式的复制分子产生。②负链RNA病毒由于负链RNA病毒基因组与其mRNA序列互补，所以它们必须利用结合于毒粒的病毒转录酶合成mRNA。病毒RNA的复制与正链RNA病毒类似。③双链RNA病毒呼肠孤病毒的分段双链RNA基因组的每个节段编码一种mRNA，mRNA的合成是在部分脱壳的颗粒中利用毒粒携带的转录酶转录基因组的负链完成；④二倍体正链RNA病毒逆转录病毒的+RNA基因组由毒粒携带的逆转录酶以细胞的tRNA为引物，逆转录产生-DNA，形成RNA-DNA杂交体。然后+RNA被逆转录酶的RnaseH组分降解，逆转录酶以余下的-DNA为模板复制产生称做前病毒（provirus）的双链DNA。前病毒DNA环化后整合于宿主染色体，并在宿主的RNA聚合酶作用下转录产生mRNA和新的+RNA基因组。另外，布尼亚病毒科白蛉热病毒属成员和沙粒病毒科的成员基因组的S节段是双意RNA，其中的正意部分可直接进行翻译，负意部分则须由毒粒携带的转录酶转录。3．植物病毒的大分子合成以TMV为代表的大多数植物病毒都含有正链RNA基因组。病毒基因组正链RNA的复制与其它的正链RNA病毒类似，包括利用亲代RNA为模板复制负链，然后再以负链为模板合成子代正链这两个步骤。大多数植物都含有依赖RNA的RNA聚合酶，并且这些正常的细胞酶可能参与病毒RNA复制。然而已有证据表明芜菁黄化病毒、豇豆花叶病毒、烟草花叶病毒等可能都是依靠病毒特异性的RNA复制酶进行复制。正链RNA植物病毒亦与其他正链RNA病毒类似，其基因组RNA具有mRNA活性，可直接进行翻译。但是不同的植物正链RNA病毒发展了不同的基因组策略来促进和/或调节基因的表达。这些策略包括合成亚基因组mRNA，翻译的通读和读框移动，产生聚蛋白以及多分基因组等。例如许多植物正链RNA病毒，无论是单分基因组还是多分基因组，定位在基因组RNA3’端的壳体蛋白基因往往不能直接表达，壳体蛋白多是通过与基因组3’端序列相同的亚基因组mRNA翻泽产生。四、病毒的装配与释放在病毒感染的细胞内，新合成的毒粒结构组分以一定的方式结合，组装成完整的病毒颗粒，这一过程称做病毒的装配，亦称成熟或形态发生。成熟的子代病毒颗粒然后依—定途径释放到细胞外，病毒的释放标志病毒复制周期结束。对于有些病毒，特别是有包膜病毒而言，这两个过程有着十分密切的联系。1．噬菌体的装配与释放T4噬菌体的装配过程已作详细研究，这是一个极为复杂的自我装配的过程（图7-13）。这一过程包括4个完全独立的亚装配途径：无尾丝的尾部装配；头部的装配；尾部与头部自发结合；单独装配的尾丝与前已装配好的颗粒相连。以上各个装配步骤通过一系列绝对有序的装配反应进行，其中每一种结构蛋白在装配时都发生了构型的改变，为后一种蛋白质的结合提供了可识别位点。而且前壳体的装配还需脚手架蛋白的参与，这些蛋白质在结构完成后被除去。包括T4噬菌体、单链DNA噬菌体由ΦX174等大多数噬菌体都是以裂解细胞方式释放。丝杆噬菌体不杀死细胞，子代毒粒以分泌方式不断从受染细胞中释放，这是一种病毒与宿主细菌的共生关系，2．动物病毒的装配与释放裸露的、有包膜的和复杂的动物病毒的形态结构都不相同，它们的成熟和释放过程也各有特点，而且，病毒形态发生的部位也因病毒而异。与噬菌体一样，动物病毒晚期基因编码的壳体蛋白自我装配形成壳体。裸露的二十面体病毒首先装配成空的前壳体，然后与核酸结合成熟为完整的病毒颗粒。有包膜动物病毒包括所有具螺旋对称壳体和某些具二十面体壳体的病毒。这些病毒的装配首先是形成核壳，然后再包装上包膜，而且这一过程往往与病毒释放同时发生。有些病毒是在从宿主细胞核出芽的过程中从核膜上获得包膜（图7-14a），如疱疹病毒；有的则是在从宿主细胞质膜出芽的过程中裹上包膜（图7-14b），如流感病毒。3．植物病毒的装配与释放烟草花叶病毒的装配是病毒自我装配的经典范例。TMV壳体蛋白质亚基首先形成20S的双层园盘，然后园盘与靠近TMVRNA基因组3’端的特异性装配起始序列结合，RNA穿过螺旋的中心孔并在生长端形成—个可移动的环。随着蛋白质亚基不断加入，螺旋壳体首先向RNA5’端生长，5’端包装完成后，再向3’端延伸至核壳成熟。植物病毒通过植物的维管进行长距离运动，它们在细胞之间的运动则通过胞间连丝进行，这一过程需要病毒编码的运动蛋白的参与。有些植物病毒的运动蛋白与胞间连丝结合可增大胞间连丝的孔径，以允许病毒颗粒或病毒核酸通过胞间连丝在细胞间扩散；有的植物病毒的运动蛋白可取代胞间连丝，形成利于病毒在细胞间扩散的管状结构。第五节病毒的非增殖性感染病毒对敏感细胞的感染并不一定都能导致病毒繁殖，产生有感染性的病毒子代。因最终的感染结果，敏感细胞的感染可分为两类：一类是增殖性感染，这类感染发生在病毒能在其内完成复制循环的允许细胞内，并以有感染性病毒子代产生为特征；另—类是非增殖性感染，这类感染由于病毒或是细胞的原因，致使病毒的复制在病毒进入敏感细胞后的某—阶段受阻，结果导致病毒感染的不完全循环。在此过程中，由于病毒与细胞的相互作用，虽然亦可能导致细胞发生某些变化，甚至产生细胞病变，但在受染细胞内，不产生有感染性的病毒子代。一、非增殖性感染的类型病毒的非增殖性感染有三种类型：流产感染、限制性感染和潜伏感染。1．流产感染这是一类普遍发生的非增殖性感染。依其发生原因。可以将之分为依赖于细胞的流产感染和依赖于病毒的流产感染两类。（1）依赖于细胞的流产感染如果病毒感染的细胞是病毒不能复制的非允许细胞，将导致流产感染。在非允许细胞内，往往仅有少数病毒基因表达，病毒不能完成复制循环。其原因，可能与这些细胞缺失某些参与病毒复制的酶、tRNA或细胞因子有关。允许细胞与非允许细胞的划分是相对于某—特定的病毒而言的，一种病毒的允许细胞可能是另一种病毒的非允许细胞，反之亦然。例如，猴肾细胞是SV40的允许细胞，但人腺病毒感染猴肾细胞则会导致流产感染发生。（2）依赖于病毒的流产感染这类流产感染系因基因组不完整的缺损病毒引起。这类病毒因一个或多个病毒复制必需基因有缺损，丧失了其功能，所以它们无论是感染允许细胞还是非允许细胞，都不能完成复制循环。2．限制性感染这类感染系因细胞的瞬时允许性产生，其结果或是病毒持续存在于受染细胞内不能复制、直到细胞成为允许性细胞，病毒才能繁殖；或是一个细胞群体中仅有少数细胞产生病毒子代。例如，人乳头瘤病毒可感染上皮细胞，并且其早期基因的转录可在受染的各分化期的上皮细胞中进行。但是由于晚期基因转录仅能在分化成熟的鳞状上皮细胞中进行，所以只有进入终末分化的鳞状上皮细胞才有病毒增殖。3．潜伏感染这类感染的显著特征是在受染细胞内有病毒基因组持续存在，但并无感染性病毒颗粒产生，而且受染细胞也不会被破坏，这种携带有病毒基因组但不产生有感染性病毒的细胞称做病毒基因性细胞。潜伏感染的另—个极端情况是由于病毒基因的功能表达导致宿主基因表达的改变，以致正常细胞转化为恶性细胞。二、缺损病毒从某种意义而言，所有的病毒都是缺损的，因为它们都只能寄生于活细胞内进行复制。然而缺损病毒的复制还需要其他病毒基因组或病毒基因的辅助活性，否则即使在活细胞内也不能复制。不同的缺损病毒的来源和基因组的缺损表现都不相同，而且病毒基因组往往可能因严重缺损而丧失全部生物学功能。有生物活性的缺损病毒包括四类：干扰缺损病毒或称干扰缺损颗粒（defectiveinterferingparticles，DI颗粒）、卫星病毒、条件缺损病毒和整合的病毒基因组。1．干扰缺损颗粒DI颗粒是病毒复制时产生的一类亚基因组的缺失突变体。现在己知无论是动物病毒，还是植物病毒和噬菌体在自然感染或实验感染时，都可能产生各自相关的DI颗粒。特别是在高感染复数（multiplicityofinfection，m.o.i）时，DI颗粒能以较高的频率产生。由于DI颗粒基因组有缺损，故不能完成复制循环，而必须依赖于其同源的完全病毒才能复制。同时，由于DI基因组较其完全病毒小、复制更为迅速，在与其完全病毒共感染时更易占据优势，从而干扰其复制。在病毒感染时普遍产生的DI颗粒能污染病毒制备物，并给病毒的生物学活性带来深刻且通常是有害的影响。DI颗粒干扰标准病毒的复制可能是某些病毒分离和培养困难的原因之一。DI颗粒在病毒持续性感染的形成中也可能起着重要作用。2．卫星病毒卫星病毒是寄生于与之无关的辅助病毒的基因产物的病毒。与DI颗粒类似，卫星病毒的基因组是缺损的，它必须依赖于辅助病毒才能复制。与DI颗粒不同的是，它们不是由其辅助病毒的基因缺失产生的，而是存在于自然界中的一种绝对缺损病毒，而且它们的形态结构和抗原性都与辅助病毒不同，其基因组与辅助病毒的基因组也很少有同源性。细小病毒科中的腺联病毒（Adeno-zssociatedvirus，AAV）是一种卫星病毒。这种小型的二十面体病毒含单链DNA基因组。AAV只能在同时有腺病毒或疱疹病毒感染的细胞核内复制，并且它还可干扰腺病毒的复制以及腺病毒引起的细胞转化。若是AAV单独感染细胞，则会导致流产感染发生，并且AAV的基因组整合在宿主细胞DNA中。大肠杆菌噬菌体P4是一种更为复杂的卫星病毒，属肌尾噬菌体科。若无非缺损的辅助病毒大肠杆菌噬菌体P2的同时感染，它不能复制产生成熟的噬菌体颗粒。其原因是P2缺乏编码壳体蛋白的结构基因，它必须依赖P2合成的壳体蛋白装配成仅有P2壳体大小1/3的P4壳体，这样的壳体适于包装较小的P4DNA。除腺联病毒和P4噬菌体外，卫星烟草坏死病毒，丁型肝炎病毒这些原来未归属于相应的病毒科或属的卫星病毒现在划归在亚病毒因子的卫星病毒之中。3．条件缺损病毒条件缺损病毒是一类基因组发生了突变的病毒条件致死突变体．它们在允许条件下能够正常繁殖，在非允许条件或称限制条件下导致流产感染发生。某些条件缺损病毒也能干扰野生型病毒复制，它们的许多生物学行为与DI颗粒相似。4．整合的病毒基因组某些温和噬菌体和肿瘤病毒感染宿主细胞后，因病毒与细胞的性质，病毒基因组整合于宿主染色体，并随细胞分裂传递给子代细胞，这类感染称之为整合感染。除非缺损的外源性RNA肿瘤病毒外，病毒整合感染的细胞没有感染性的病毒产生。只有在—定条件下，整合在宿主染色体的病毒基因组才能转入复制循环，产生有感染性的病毒颗粒。（1）温和噬菌体的溶源性反应大多数噬菌体感染宿主细胞，都能在细胞内正常复制并最终杀死细胞，这类噬菌体的裂解循环一般都是由烈性噬菌体引起。而另有一些噬菌体除能以裂解循环在宿主细胞内生长外，还能以溶源状态存在。以溶源状态存在的噬菌体不能完成复制循环，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内，没有成熟噬菌体产生，这一现象称做溶源性现象。能够导致溶源性发生的噬菌体称做温和噬菌体或称溶源性噬菌体。在大多数情况下，温和噬菌体的基因组都整合于宿主染色体中（如λ噬菌体），亦有少数是以质粒形成存在（如P1噬菌体）。整合于细菌染色体或以质粒形成存在的温和噬菌体基因组称做原噬菌体。在原噬菌体阶段，噬菌体的复制被抑制，宿主细胞正常地生长繁殖，而噬菌体基因组与宿主细菌染色体同步复制，并随细胞分裂传递给子代细胞。细胞中含有以原噬菌体状态存在的温和噬菌体基因组的细菌称做溶源性细菌。处于溶源性细菌细胞中的噬菌体DNA在一定条件下亦可启动裂解循环，产生成熟的病毒颗粒。自然情况下的溶源性细菌的裂解称为自发裂解，但裂解量较少。若经紫外线、氮芥、环氧化物等理化因子处理，可产生大量的裂解，此称为诱发裂解。溶源性反应是一种比裂解反应更有利于病毒持续和传播的病毒生存方式。处于这种最适应于它们所处环境中的噬菌体不会迅速杀死细胞，从而丧失传播的机会，所以，这也被认为一种原始的分化方式。（2）动物病毒的整合感染在动物病毒中，许多DNA肿瘤病毒（如SV40、乙型肝炎病毒等）和RNA肿瘤病毒都能引起整合感染。在这些病毒感染的细胞中，病毒的基因组DNA或前病毒DNA整合到宿主细胞染色体中。除慢性RNA肿瘤病毒和非复制缺损型的急性RNA肿瘤病毒外，受染细胞内没有病毒繁殖。只有在—定条件下，整合在细胞染色体上的病毒基因组才能转入复制循环，产生子代病毒颗粒。属于逆转录病毒科RNA肿瘤病毒的基因组通过逆转录产生DNA中间体，然后整合到宿主染色体。这一过程是病毒复制的必经阶段。整合到宿主染色体的病毒dsDNA中间体称做前病毒。RNA肿瘤病毒感染细胞后能否繁殖和引起细胞转化取决于病毒和受染细胞的性质。除Rous肉瘤病毒外，所有的急性RNA肿瘤病毒都是缺损病毒，由于其复制必需基因缺损，所以都不能独立复制。另外还有一类内源性病毒，这类RNA肿瘤病毒的基因组普遍存在于许多动物的DNA中，但不转化细胞，也不产生病毒。内源性前病毒与原噬菌体类似，亦可自发或经诱导转入复制循环，产生有感染性的病毒。第六节病毒与宿主的相互作用病毒必须进入细胞并利用宿主细胞大分子合成机制和能量装置进行复制，因此在许多方面，病毒复制研究就是病毒与其宿主相互作用的研究。这一研究不仅有助于阐明病毒感染和致病的生物学和分子生物学机理，而且对于病毒感染的诊断与控制具有重要的意义。一、噬菌体感染对原核细胞的影响不同的噬菌体感染对宿主细胞的生物学效应有很大差别。有些噬菌体，如单链DNA噬菌体fd、f1等的感染对受染细胞影响很小，子代病毒以非致死的分泌方式释放，这是一种非杀细胞感染。这类噬菌体正因为具有这一特点，故在最近发展起来的噬菌体显示技术（phagedisplaytechniques）中被用于构建噬菌体表达载体。然而，许多噬菌体的感染都可能给细胞造成巨大的影响，最终细胞被杀死和/或裂解，这类感染常称作杀细胞感染或裂解感染。温和性噬菌体感染机制已进化到能够控制自身的复制和对细胞的破坏的地步，以致它们仍能够维持相对稳定，以原噬菌体这样一种变化了的生命形式长期与宿主细胞结合在一起，并在一定条件下转入复制，结果噬菌体增殖、细胞裂解。1．抑制宿主细胞大分子合成许多噬菌体感染时都能产生关闭蛋白，这些蛋白质能以不同的方式抑制宿主细胞的大分子分成：①抑制宿主基因的转录。T4噬菌体的某些早期蛋白质结合于宿主转录酶或引起宿主转录酶的磷酸化和腺苷化，改变其启动子识别特异性，使之由细胞mRNA合成转向噬菌体mRNA合成。T7噬菌体基因2编码的蛋白还能结合宿主转录酶并导致其失活，从而抑制宿主细胞mRNA合成。②抑制宿主蛋白质合成。除了因宿主转录的抑制间接影响其蛋白质合成外，有些噬菌体蛋白质能灭活细胞tRNA，从而直接抑制宿主蛋白质合成，如T4噬菌体编码的蛋白能灭活宿主亮氨酸+RNA，并以噬菌体tRNA代之。③宿主DNA合成的抑制。T-偶数噬菌体编码的内切核酸酶和外切核酸酶逐步降解宿主染色体，使细胞DNA合成因缺乏模板而终终止。另一方面．T-偶数噬菌体也通过抑制细胞核苷酸合成而改变宿主DNA合成代谢。大多数较为简单的噬菌体通常都不破坏细胞DNA。2．宿主限制系统的改变为了抵御宿主限制性酶系统对侵入的病毒DNA所可能造成的损害，噬菌体编码的酶往往能破坏这些系统，使病毒DNA得到保护。例如，T3噬菌体感染时产生的酶能水解S-腺苷甲硫氨酸（SAM）而使某些宿主的依赖SAM的限制酶系统失效。T-偶数噬菌体的基因产物亦可直接抑制宿主抗T-偶数噬菌体的限制性核酸酶的活性。3．噬菌体颗粒释放对细胞的影响fd、M13等丝杆噬菌体的增殖性感染不杀死细胞，细胞继续生长，病毒复制产生的外壳蛋白结合于细胞膜，噬菌体颗粒以分泌方式释放时，病毒单链DNA穿过细胞膜时被壳体蛋白包裹形成杆状颗粒。由于壳体蛋白与细胞膜结合，细胞表面出现病毒特异性抗原，从而改变受染细胞的免疫学性质。大多数噬菌体都是以裂解方式释放，其结果导致受染细胞死亡。以裂解方式释放的噬菌体晚期基因的产物能自动使细胞膜失去稳定，然后细胞壁的肽聚糖网状结构以不同的方式被破坏。如T4噬菌体编码的溶菌酶能分解肽聚糖，λ噬菌体产生的内溶菌素可断裂肽键。许多复杂的噬菌体的基因产物还能通过调节裂解酶的活性而控制裂解过程。4．溶源性感染对细胞的影响溶源菌中的温和噬菌体基因组通常不影响细胞的繁殖功能，但它们可能引起其他的细胞变化。这些变化不但对溶源菌，而且也可能对溶源菌的宿主机体产生深刻的生物学影响。（1）免疫性溶源性细菌对本身所携带的原噬菌体的同源噬菌体有特异性免疫力，这是所有的溶源性细菌都具有的一个重要性质。免疫性是由原噬菌体产生的阻遏蛋白的可扩散性质所决定的。（2）溶源转变溶源转变是原噬菌体引起的溶源性细菌除免疫性外的其他的表型改变，包括溶源菌细胞表面性质的改变和致病性转变。原噬菌体诱发的致病性转变可能是细菌致病机理的一个重要方面，因而具有重要的医学意义。二、病毒感染对真核细胞的影响真核细胞对病毒的感染可呈现不同的反应：①细胞无任何明显变化；②由于病毒的致细胞病变效应，细胞损伤、死亡；③细胞增生，继而或是细胞死亡，或是细胞继续失去生长抑制，转化为癌细胞。相对于植物病毒而言，对于病毒感染动物细胞的过程了解更为详尽，所以主要以动物病毒为例介绍病毒感染对真核细胞的影响。1．病毒感染的致细胞病变效应病毒感染引起的致细胞病变效应或细胞损伤是因病毒的基因产物的毒性作用所引起，或是病毒复制的必需步骤的次级效应，而且以后者更为普遍。例如，腺病毒的五邻体基底蛋白可引起单层细胞脱落，以前认为这是一种机制未明的毒性作用，现在已明确这是病毒内化时，五邻体基底蛋白通过RGD序列与细胞表面的整联蛋白结合的结果。具有强烈致细胞病变效应的病毒最终都会导致细胞死亡。病毒感染引起细胞死亡的原因非常复杂，但至少有两种方式：一是由于病毒对宿主细胞的毒性作用可导致细胞坏死；二是活化了细胞程序性死亡途径导致细胞凋亡。在有些情况下，二者可同时发生。2．病毒感染对宿主大分子合成的影响许多真核生物病毒，特别是杀细胞病毒具有干扰宿主大分子合成的能力。这种影响或是直接由某些病毒功能所引起，或是由病毒对某些宿主功能的作用而间接引起。无致细胞病变效应的病毒，很少抑制宿主细胞大分子合成。还有一些病毒能刺激宿主细胞的大分子合成。（1）宿主细胞转录的抑制许多动物病毒的感染都能抑制宿主细胞基因的转录。对于不依赖宿主细胞RNA多聚酶进行复制的RNA病毒而言，这一活性可为病毒RNA合成提供更多的核糖核苷三磷酸。对于DNA病毒则可使宿主细胞DNA多聚酶II转向病毒基因组的转录，以减少对RNA合成的前体和转录因子的竞争。有些病毒也能抑制宿主细胞RNA的转运和加工，进而抑制细胞的RNA的成熟。流感病毒编码的内切核酸酶切割宿主细胞转录物的5’末端作为病毒mRNA合成的引物，从而阻止了宿主细胞mRNA的成熟。（2）宿主细胞翻译的抑制许多病毒感染细胞后都会抑制宿主细胞mRNA的翻译，其结果是为病毒蛋白质合成提供更多的核糖体亚单位、翻译起始因子、tRNA和氨基酸前体。病毒感染抑制宿主翻译的方式包括：①降解宿主的mRNA；②因大量的病毒mRNA竞争有限的核糖体或病毒mRNA较细胞mRNA对核糖体有更高的亲合力，从而抑制细胞mRNA翻译；③改变宿主翻译装置的特异性。（3）宿主细胞DNA复制的抑制主要有以下原因：①为病毒DNA合成提供前体；②为病毒DNA合成提供宿主细胞结构和/或复制蛋白；③细胞蛋白质合成被抑制的次级效应。DNA病毒和RNA病毒都可能抑制宿主细胞DNA合成，其可能的机制包括细胞DNA从其正常的复制位点被取代；细胞DNA复制蛋白转向病毒DNA合成；细胞DNA被降解体；以及由于宿主DNA复制所必需的宿主蛋白质和/或RNA合成被抑制的间接影响等。但是，有些病毒，特别是依赖宿主细胞DNA复制的DNA肿瘤病毒，如乳多空病毒能够刺激细胞的DNA合成，诱导处于G0期的宿主细胞进人S期。3．病毒对细胞结构的影响无致细胞病变效应或致细胞病变效应弱的病毒感染对宿主细胞结构几乎无任何影响，而致细胞病变效应很强的病毒则可能对宿主细胞膜、细胞骨架等结构造成严重影响。（1）病毒对宿主细胞膜的影响一些具有有融合活性的表面蛋白的有包膜病毒能够启动细胞之间的融合，形成多核细胞。由病毒引起的细胞融合有两种类型：一种是从外部融合，这是病毒以高感染复数感染时，由毒粒表面具有融合活性的糖蛋白引起未受病毒感染细胞之间的融合；另一种融合是从内部融合，这是因受染细胞内表达的病毒糖蛋白结合于细胞表面而导致的受染细胞与相邻细胞的融合。某些病毒的感染还能增加宿主细胞质膜的离子通透性，例如细胞内钠离子的流入增加。由于病毒mRNA的翻译较细胞mRNA对高钠离子浓度有更强的抵抗能力，所以膜通透性的增加可能有利于病mRNA的翻译。此外，病毒感染还可能引起受染细胞对抗生素和毒素的通透性增加。细胞质膜通透性的改变据认为是由于病毒蛋白质的插入所引起。（2）病毒对细胞骨架的影响许多病毒的感染会导致细胞骨架纤维系统的瓦解，如水泡性口炎病毒、痘苗病毒、SV40、犬瘟热病毒、蛙病毒3型和HSV等感染细胞都会引起含肌动蛋白的微丝减少。其中HSV、犬瘟热病毒和蛙病毒3型等还能引起微管解聚。由于细胞骨架在维持细胞形态中起一定作用，所以病毒引起细胞骨架的改变是受染细胞结构变化的原因之一。细胞骨架的变化是病毒感染的间接效应，如细胞大分子合成的抑制即可导致细胞骨架的改变。在受染细胞的细胞质或细胞核内，常有称之为“病毒工厂”或包涵体的病毒核酸合成和毒粒装配的新结构形成。有证据表明，特异性的细胞骨架组分结合到细胞质包涵体中。电镜研究显示包涵体含有微管和5-8nm的结状微丝，从而证明病毒的感染可以利用细胞结构成分构建病毒复制工厂。（3）包涵体病毒复制复合物、转录复合物、复制和装配中间体、核壳和毒粒经常累积在宿主细胞的特定区域而形成病毒工厂或包涵体结构，这些结构在细胞质和/或细胞核的定位反映了—种特定病毒的复制位点。不同病毒所形成的包涵体各具特异性的染色性质，即有的嗜酸性染料、有的嗜碱性染料，并且不同病毒的包涵体的大小、形态以及数量都有所区别，所以包涵体在病毒的实验诊断中具有一定意义。在包涵体中由于累积有结晶排列的壳体或核壳，这些新结构的装配可以改变或取代宿主细胞组分，并成为细胞病变的一种形式。（4）细胞凋亡许多病毒能够诱发细胞凋亡，其机制较为复杂且各不相同。通常病毒感染细胞后通过关闭或干扰宿主细胞正常合成代谢诱发细胞凋亡，或者由病毒编码的蛋白因子直接作用于细胞与凋亡有关的因子及蛋白水解酶而诱发细胞凋亡。越来越多的资料表明病毒感染与细胞凋亡有着密切的联系，许多病毒的致细胞病变效应往往是诱发细胞凋亡的结果。细胞凋亡可能是宿主在细胞水平抵御病毒感染的一种机制，通过局部受染细胞的凋亡可限制病毒的繁殖与传播以拯救整个器官和个体。另一方面，为了生长与繁衍，有些病毒进化获得凋亡抑制基因，它们在感染早期即开始表达，抑制宿主细胞凋亡，使病毒顺利完成复制周期。在这种情况下，病毒诱发的细胞亡和凋亡抑制同时存在于受染细胞，它们相互作用协调着病毒与细胞的关系，使病毒在细胞内能够顺利复制。三、机体的病毒感染对于动物、植物的机体而言，病毒感染的意义与细胞的病毒感染有很大的区别，这是一个更为复杂且不断变化着的过程，是病毒与机体相互作用所产生的各种现象的总和。1．机体病毒感染的类型机体的病毒感染可按不同的形式进行分类。根据感染症状的明显程度，可分为显性感染和隐性感染（非显性感染）。根据感染过程，症状和病理变化发生的主要部位，可分为局部感染和系统感染。根据病毒在机体内存留时间的长短以及病毒与宿主相互作用的方式，可分为急性感染和持续性感染。2．构成机体病毒感染的因素机体内病毒感染的表现形式和结果由病毒、机体和环境条件三者的综合作用决定。（1）病毒病毒的特征，即病毒的致病性和毒力直接影响病毒感染的表现与结果。病毒的致病性是特定的病毒种引起感染过程的潜在能力，是病毒种的特征。但是同一种病毒的不同毒株的致病性可能存在很大差别，特定的毒株致病性的强弱就是病毒的毒力，毒力是病毒株的特征。引起病毒感染的另一个必要条件是病毒的数量，它与病毒的毒力以及机体对病毒的敏感性有关。病毒的毒力越强，引起机体感染所需的病毒剂量越低；机体对病毒的抵抗力越强，引起感染所需的病毒剂量越高。近年来，在一些复杂病毒，如痘病毒、疱疹病毒中发现病毒编码受体和病毒因子，这些病毒基因组编码的产物能以不同方式影响病毒的感染过程。病毒因子是病毒编码的，与机体的免疫调节因子或效应因子结构相似的蛋白质，如痘病毒编码的生长因子，它们可刺激感染灶邻近细胞的代谢，使其成为病毒感染的靶细胞，促进病毒进一步繁殖；病毒编码受体是病毒编码的，可与免疫效应因子或调节因子结合的细胞受体类似物，其主要作用是阻断和抑制细胞因子与其受体结合，从而抑制宿主的免疫反应，使病毒自身得到保护。（2）机体病毒侵入机体后，病毒在细胞内的活性，病毒在体内的传播以及病毒感染的表现和结果，不仅取决于病毒的质和量，同时亦取决于机体的防御结构和防御功能状态。对病毒感染的免疫和抵抗是完整机体的一种生理功能，以保护机体免于感染或严重感染。此外，机体的年龄、激素分泌水平、生理状态、营养状况、中枢神经活动以及非免疫抵抗的遗传因素等一系列十分复杂的因素，都影响机体的病毒感染过程。（3）环境条件机体生存所处的生态环境、气候条件中所可能存在的多种生物或非生物因子，以及诸如人的生活方式、动物的饲养管理方式和植物的栽培方式等因素，均能作用于病毒和/或机体而间接影响病毒的感染过程。第七节亚病毒因子亚病毒因子包括卫星病毒、卫星RNA、类病毒和朊病毒。在亚病毒因子中，仅有类病毒和朊病毒能独立复制，朊病毒颗粒不具有基因组核酸。卫星病毒与卫星RNA都具有核酸基因组，它们与DI颗粒类似，必须依赖辅助病毒进行复制，与DI颗粒不同的是，它们与其辅助病毒没有核酸序列同源性。卫星病毒、卫星RNA、类病毒和DI颗粒的性质比较于表7-4中。一、卫星病毒除前已述及的AAV和P4噬菌体外，另有一些卫星病毒被归在亚病毒之列，如卫星烟草坏死病毒（Satellitetobacconeorosisvirus，STNV）、卫星烟草花叶病毒（Satellitetobaccomoscirevirus，STMV）、丁型肝炎病毒（HepatitisDvirus，HDV）等。1．植物卫星病毒卫星病毒首先是在植物中发现，已知的植物卫星病毒包括STNV、STMV、卫星稷子花叶病毒和卫星玉米白线花叶病毒等。它们都依赖辅助病毒提供复制酶进行复制，并且都编码有壳体蛋白。植物卫星病毒对辅助病毒的依赖性相当专一。例如除烟草坏死病毒（Tobacconeorosisvirus，TNV）外，其他的植物病毒都不能辅助STNV的复制，而且STNV的不同毒株必须依赖一定的TNV毒株进行复制。2．丁型肝炎病毒丁型肝炎病毒（HDV）是亚病毒感染因子中的δ病毒属的代表成员，1977年在意大利的乙型肝炎病毒携带者中发现。HDV是一种缺损病毒，它必须利用乙型肝炎病毒的包膜蛋白才能完成自身的复制循环，而且土拨鼠肝炎病毒亦能辅助其复制。HDV的单链环状RNA基因组与植物类病毒类似、呈杆状二级结构，但其大小与类病毒不同，而且它具有编码蛋白能力。HDV的反基因组RNA含有一个开放阅读框，依靠特异性的RNA编辑功能可产生称之为“δ抗原”的两种RNA结合蛋白，它们分别参与基因组复制和颗粒装配。HDV和类病毒一样，利用宿主的依赖DNA的RNA聚合酶以正意和负意RNA为模板，通过滚环机制复制，产生的多聚体RNA链经过自我位点特异性的切割和连接（核酶活性）形成子代共价闭合环状分子。二、卫星RNA卫星RNA是指一些必须依赖辅助病毒进行复制的小分子单链RNA片段，它们被包装在辅助病毒的壳体中，本身对于辅助病毒的复制不是必需的，且它们与辅助病毒的基因组无明显的同源性。1．基因组结构卫星RNA大小可分为两类。大者如番茄黑环病毒的卫星RNA长1372-1376个核苷酸，大小与卫星病毒基因组类似，但多数都在300个核苷酸左右，如烟草环斑病毒的卫星RNA、黄瓜花叶病毒的卫星RNA。许多卫星RNA的5’端有帽子结构，3’端无poly（A），而是类似tRNA的结构，并且卫星RNA通过分子内部碱基配对形成复杂的二级结构。较大的卫星RNA具有长开放阅读框并能够表达，而较小的卫星RNA似乎不具有mRNA功能。许多卫星RNA都能以线状和环状两种形式存在于被感染的组织中，但是在辅助病毒颗粒中仅有线状形式存在。2．复制除了大小和蛋白质编码能力的区别外，不同的卫星RNA的复制方式也不同。一些较小的卫星RNA，如绒毛烟斑驳病毒卫星RNA是以对称的滚环方式复制（图7-15）。复制过程中产生的正链和负链的RNA多聚体都要经过自发的自我切割产生线状的单体分子，线状的负链RNA环化后作为合成子代正链的模板。正链和负链的切割都与其内部的核酶活性结构有关。包括一些较小的和大的另一类卫星RNA复制时不能自我切割，复制方式与辅助病毒一致。3．卫星RNA的生物活性许多卫星RNA能显著影响其辅助病毒在宿主中所产生的症状，如南芥菜花叶病毒卫星RNA能加重ArMV所引起的花叶和褪绿症状，但TobRSV卫星RNA能明显减轻TobRSV在烟草上所引起的环斑症状。有的病毒的不同毒株的卫星RNA对辅助病毒在宿主上引起的症状有不同的影响，而且同一种卫星RNA在不同宿主内对辅助病毒引起的症状的影响也不相同。卫星RNA对辅助病毒所引起的症状的修饰作用，与卫星RNA的核苷酸序列、空间结构和复制特征有关。由于很多卫星RNA能减轻辅助病毒所引起的宿主症状，所以它们已被用来防治植物病毒病害，将卫星RNA的cDNA转入植物所构建的抗病毒的转基因植物亦早已获得成功。三、类病毒1971年Diener首次报道，引起马铃薯纺锤形块茎病的病原体是一种低相对分子质量RNA，它没有蛋白质外壳，在其感染的植物组织中也未发现病毒样颗粒。这种小分子RNA能在敏感细胞内自我复制，并不需要辅助病毒。由于其结构和性质都与己知的病毒不同，故Diener等把它称做类病毒。迄今已鉴定的类病毒达20多种，根据它们是否含有中央保守区和核酶结构分为两个科，马铃薯纺锤形块茎类病毒科含中央保守区，不含核酶保守序列；而鳄梨白斑类病毒科没有中央保守区，但有核酶保守序列，能够自我切割。1．类病毒的分子结构类病毒为含246-375个核苷酸的单链环状RNA分子。所有的类病毒RNA均无mRNA活性，不能编码蛋白质。大多数类病毒RNA都呈高度碱基配对的双链区与单链环状区相间排列的杆状构型。各种类病毒之间序列有较大的同源性，有几种类病毒，如唇膏蔓蔷薇隐性类病毒等可能是相关的类病毒之间重组产生的嵌合分子。2．类病毒的复制由于类病毒RNA没有编码功能，其复制必然是完全利用宿主细胞酶，包括依赖DNA的RNA聚合酶II等。由于类病毒为环状单链RNA分子，对称或非对称的滚环复制机制均适合于类病毒（图7-15）。鳄梨白斑类病毒（Avocadesunblotchviriod，ASBVd）可能是利用对称的滚环复制方式复制，而马铃薯纺锤形块茎类病毒（Potatospindletuberviroid，PSTVd）及其相关的类病毒则可能是以非对称的滚环复制方式复制，即由滚环复制产生的多聚体负链RNA直接拷贝出多聚体正链RNA，然后经剪切环化，形成子代类病毒。3．类病毒的致病性类病毒的致病性与其RNA内部的致病变结构城（P区）的序列与构型有关，不同的PSTVd分离株其P区几个碱基的变化，可分别引起宿主植物温和症状、严重症状和死亡。类病毒变异最为频繁的可变区（V区）亦与致病性有关。柑桔裂皮类病毒A株在番茄上引起严重的矮化及偏上生长，而其DE26株仅引起温和症状，二者仅有27个核苷酸的差别，其中大部分在P区和V区。但是，有些类病毒，如ASBVd并不存在明显的致病区，它们的致病机理还有待阐明。四、朊病毒朊肮病毒是一类能引起哺乳动物的亚急性海绵样脑病的病原因子，这些疾病包括人的库鲁病（Kuru）、克雅氏病（Creutsfeldt-Jakobdisease，CJD）、格-史氏综合症（Gerstmann-Strausslersyndrome，GSS）和致死性家族失眼病（fatalfamilialinsomnia，FFI），发生于动物中的羊搔痒症、貂的传染性脑病、黑尾鹿与糜鹿的慢性消耗病以及牛海绵状脑病。由于这类病原因子能引起人与动物的致死性中枢神经系统疾病，并且它们具有不同于病毒的生物学性质和理化性质，故一直引起人们的极大的兴趣，并以羊搔痒病为模型进行了大量的研究。1．朊病毒的理化性质羊搔痒病因子无免疫原性；对紫外线、辐射、非离子型去污剂、蛋白酶等能使病毒灭活的理化因子有较强的抗性；高温、核酸酶，如羟胺、亚硝酸之类的核酸变性剂都不能破坏其感染性；SDS、尿素、苯酚之类的蛋白质变性剂都能使之失活。由于迄今未能证明它含有核酸，故多数人认为羊搔痒病因子的化学本质是蛋白质。Prusiner（1982）提出它们是一种蛋白质侵染颗粒，并将之称做Prion或Virino，即朊病毒。2．朊病毒的结构从羊搔痒病因子实验感染的仓鼠脑组织中分离到一种相对分子质量为2.7×10’4-3.0×10’4的蛋白质。由于这种蛋白质可与搔痒病因子共纯化；其浓度与搔痒病因子的传染性正相关；这种蛋白纯化后具有传染性；并且其感染性可被中和抗体中和，故将这种蛋白称做朊病毒蛋白（Prionprotein，PrP）。由于该蛋白来源于羊搔痒病，故以PrPsc表示。根据PrPsc的氨基末端的序列合成寡核苷酸探针进行检测的结果发现，在正常的人和动物的细胞DNA中有编码PrP的基因，且无论感染搔痒病因子与否，宿主细胞PrPmRNA水平无变化，说明PrP是细胞组成型基因表达的产物。这种细胞的PrP称做PrPc，为相对分子质量3.3×10’4-3.5×10’4的膜糖蛋白。正常细胞表达的PrPc与羊搔痒病的PrPsc为同分异构体。它们的一级结构相同，但PrPc具有43％的α螺旋和3％的β折叠，PrPsc约有34％的α螺旋和43％的β折叠。多个β折叠使PrPsc溶解度降低，对蛋白酶抗性增强。关于PrPsc的来源，Prusiner等认为，PrPsc来源于PrPc，并且PrPsc的形成是翻译后的加工过程，而不是蛋白内共价键的修饰。3．朊病毒的增殖关于PrPc如何转变为PrPsc尚待阐明。有人认为PrPsc进入细胞后与PrPc结合，形成PrPsc-PrPc复合体，导致PrPc构型发生改变，转变为PrPsc，这样产生的两个PrPsc分子，再分别与PrPc分子结合，产生4个PrPsc。如此周而复始，导致PrPsc数目呈指数增加。朊病毒的研究已取得很大进展，大量证据都支持Prusiner等提出的朊病毒仅由蛋白质组成，且系由细胞蛋白PrPc经翻译后修饰而转变为折叠异常的病理形态PrPsc这一假说。但迄今为止仍有人认为朊病毒含有很少量的核酸，所以对朊病毒的本质，朊病毒的繁殖，朊病毒的传播方式及其致病机理等问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 还有待进一步阐明。小结病毒是一类结构极其简单，具有特殊的繁殖方式的绝对细胞内寄生物。病毒具有细胞外相和细胞内相两种生命形态，前者以感染性毒粒形态存在，后者以繁殖性基因形式存在。毒粒具有确定的形态结构、生物学特性和理化性质。毒粒的基本结构是核壳，壳体的基本对称形式是螺旋对称和二十面体对称，有的病毒核壳外还有包膜。毒粒的基本化学组成是核酸和蛋白质。核酸是病毒的遗传物质，病毒基因组核酸有dsDNA、ssDNA、dsRNA和ssRNA四种基本类型，病毒DNA基因组有线状形式和环状形式，单链RNA基因组有正意和负意之分。构成毒粒的病毒结构蛋白分为壳体蛋白、包膜蛋白和毒粒酶，它们各具不同的功能。病毒的非增殖性感染有流产感染、限制性感染和潜伏感染三种类型，病毒的繁殖是以复制方式进行。病毒的复制循环包括吸附、侵人、脱壳、病毒大分子的合成和装配与释放等阶段。不同病毒的毒粒形态结构、基因组核酸类型和结构特征各不相同，因此它们各具不同的复制策赂。病毒感染非允许细胞或者缺损病毒感染允许细胞和非允许细胞都可能导致非增殖性感染发生。病毒感染宿主细胞，通过病毒与宿主的相互作用，一方面病毒得以繁衍、进化，另一方面病毒给宿主细胞和机体带来种种不同的影响，这些影响不仅具有重要的生物学意义，而且可能具有重要的医学意义或经济意义。包括卫星因子（卫星病毒和卫星RNA）、类病毒和朊病毒在内的亚病毒因子是—些比经典意义病毒更为简单的病原因子。亚病毒具有许多不同于病毒的特征，亚病毒研究不仅扩展了病毒学研究范围，而且可能更新病毒的定义，深化人们对病毒的起源与进化，乃至生命本质的认识。思考题1．病毒区别于其他生物的特点是什么？根据你的理解，病毒应如何定义？2．病毒的分类原则和病毒命名规则最主要包括哪些？3．病毒学研究的基本方法有哪些，这些方法的基本原理分别是什么？4．病毒壳体结构有哪几种对称形式？毒粒的主要结构类型有哪些？5．病毒核酸有哪些类型和结构特征？各类病毒基因组的复制策略有何区别？6．病毒复制循环可分为哪几个阶段？各个阶段的主要过程如何？7．病毒的非增殖性感染有哪几类？引起病毒非增殖性感染的原因是什么？8．噬菌体是如何感染宿主细胞的，叙述它与宿主细胞间的相互关系。9．某发酵工厂生产菌株经常因噬菌体“感染”而不能正常生产，在排除了外部感染的可能性后有人认为是由于溶源性菌裂解所致，你的看法如何？并请设计一实验证明。10．亚病毒有哪几类？各自有何特点？11．查阅有关文献资料，结合本节所进述的有关内容，写一篇短文论述病毒感染与细胞凋亡的关系。生命科学与技术学院袁明雄微生物与人类关系的重要性，我们怎么强调都不过分。微生物是一把典型的双刃剑，它们在给人类带来巨大利益的同时也带来“残忍”的破坏；它给人类带来的利益不仅是享受，而且实际上涉及到人类的生存。可以这么说，微生物既是人类的敌人又是人类的朋友。第一节微生物与人类以下我们从几个大的方面体会一下微生物与人类的关系，看看微生物作为敌人的“面孔”和作为朋友的“模样”。1.人类健康病原体、抗生素2.工业产品腐败、发酵产品3.生物工程学（发酵、遗传、细胞、酶、生物发应器）工程→生物工程学4.农业农产品霉变、农业栽培、生物农药化妆生命科学与技术学院袁明雄5.环境环境污染、物质循环、环境保护第一节微生物与人类6.生命科学基础理论研究生物中心法则、核酸的变性、复性和杂交、糖酵解、发酵、TCA循环、EMP途径、生物膜的流动镶嵌模型、呼吸链、氧化磷酸化、DNA的半保留复制、操纵子、生物代谢调节的方式、氨基酸的分解代谢途径等。微生物确乎是一把明晃晃的双刃剑。化妆生命科学与技术学院袁明雄1.一个难以认识的微生物世界（1）个体过于微小大多数微生物的个体在几m-几十m，在显微镜发明之前仅靠肉眼难以发现和辨认。二、微生物学的发展史（2）群体外貌不显微生物的个体看不见，形成的群体（菌落或菌苔）虽然可见，一般也平淡无奇，不引人注意。（3）种间杂居混生自然状态下杂居混生，在发明各种微生物的分离、培养技术之前，无法知道其真正的作用。（4）形态与作用因果难联微生物的生长繁殖快，代谢活跃，传染病早期并不引人注意，即便事态严重，往往也没有意识到是微生物的活动。就是许多非病原微生物的生长活动所引起的各种生化变化（发酵、腐败）等，也是如此。生命科学与技术学院袁明雄2.微生物学的发展史整个微生物学的发展史是一部逐步克服上述认识微生物的4个障碍不断探究它们的生活规律，开发利用有益微生物和控制有害微生物的历史。（如显微镜的发明、无菌技术的应用、纯种分离和培养技术的建立等。）（1）史前期（8000年前-1676年）这一时期的特点：低水平的应用阶段。以下一段话可以反映这一时期的特点：视而不见、嗅而不闻、触而不觉、食而不察、得其益而不感其好、受其害而不知其恶。我们根据划时代意义的事件扼要将微生物学的发展史分为5个时期。二、微生物学的发展史生命科学与技术学院袁明雄在史前期，世界各国人民在自己的生产实践中都积累了许多利用有益微生物和防治有害微生物的经验。例如发面、天然果酒和啤酒酿造、牛乳和乳制品的发酵以及利用霉菌来治疗一些疾病等，但当时应用水平最高并独树一帜的应用应该首推我国人民在制曲酿酒方面的伟大创造。①酿酒②农业③医学（2）初创期（1676年-1861年）这一时期的特点：形态描述和分门别类的阶段。荷兰商人安东.列文虎克（AntonyvanLeeuwenhoek，1632-1723），是真正看见并描述微生物的第一个人。他的最大贡献是利用自制的显微镜发现了微生物世界（当时被称之为微小动物）。显微镜构造简单，仅一个透镜安装在两片金属薄片的中间，在透镜前面有一根金属短棒，在棒的尖端搁上需要观察的样品，通过调焦螺旋调节焦距。二、微生物学的发展史生命科学与技术学院袁明雄AntonyvanLeeuwenhoek列文虎克和他的显微镜二、微生物学的发展史生命科学与技术学院袁明雄a.显微镜b.描述的细菌列文虎克的显微镜和描述的细菌二、微生物学的发展史生命科学与技术学院袁明雄实际上，列文虎克是清楚地看见了细菌和原生动物，首次向世人揭示了一个崭新的生物世界——微生物世界。由于列文虎克的划时代贡献，他在1680年被选为英国皇家学会会员。（3）奠基期（1861年-1897年）十九世纪中期，以法国的巴斯德和德国的柯赫为代表的科学家揭示了微生物才是造成腐败发酵和人畜疾病的原因，并建立了分离、培养、接种和灭菌等一系列独特的微生物技术，从而奠定了微生物学的基础，同时开辟了医学和工业微生物等分支学科。巴斯德和柯赫是微生物学的奠基人。这一时期的特点：从形态描述推进到生理水平的研究阶段。①巴斯德（LouisPasteur，1822-1895）巴斯德原来是化学家，在化学领域中作出过重要的贡献，后来又转向于微生物学的研究领域，所做的工作为微生物学的建立和发展作出了卓越的贡献。二、微生物学的发展史生命科学与技术学院袁明雄A.彻底否定了“自生说”学说a.“自生说”b.曲颈瓶试验二、微生物学的发展史生命科学与技术学院袁明雄B.免疫学——预防接种a.Jenner种痘法可预防天花，但未能阐明免疫机制C.证实发酵是由微生物引起的b.减毒疫苗——鸡霍乱病、牛、羊炭疽病、狂犬病D.其他贡献（巴斯德消毒、巴斯德效应）②柯赫（1843-1910）柯赫是著名的细菌学家，由于他曾经是一名医生，因此对病原细菌的研究作出了突出的贡献。RobertKochA.具体证实了炭疽病菌是炭疽病的病原菌；B.发现了肺结核病的病原菌，这是当时死亡率极高的传染性疾病，因此柯赫获得了诺贝尔奖；C.提出了证明某种微生物是否为某种疾病病原体的基本原则——柯赫法则。二、微生物学的发展史生命科学与技术学院袁明雄柯赫法则示意图二、微生物学的发展史生命科学与技术学院袁明雄柯赫在病原菌研究方面的开创性工作，自19世纪70年代至20世纪20年代成了发现病原菌的黄金时代。柯赫除了在病原菌研究方面的伟大成就外，在微生物基本操作技术方面的贡献更是为微生物学的发展奠定了技术基础，这些技术包括：A.用固体培养基分离纯化微生物的技术，这是进行微生物学研究的基本前提，这项技术一直沿用至今；B.配制培养基，也是当今微生物学研究的基本技术之一。这两项技术不仅是具有微生物学研究特色的重要技术，而且也为当今动植物细胞的培养作出了十分重要的贡献。由于巴斯德和柯赫的杰出工作，微生物学作为一门独立的学科开始形成，并且出现以他们为代表而建立的各分支学科。细菌学（巴斯德、柯赫等）消毒外科技术（J.Lister）免疫学（巴斯德、Metchnikoff、Behring、Ehrlich等）二、微生物学的发展史生命科学与技术学院袁明雄病毒学（Ivanowsky、Beijerinck等）植物病理学和真菌学（Bary、Berkeley等）酿造学（Hensen、Jorgensen等）化学治疗法（Ehrlish等）微生物学的研究内容日趋丰富，使微生物学的发展更加迅速。（4）发展期（1897年-1953年）1897年，德国科学家E.Buchner用无细胞酵母菌压榨汁中的“酒化酶”对葡萄糖进行酒精发酵成功，从而开创了微生物生化研究的新时代。此后，微生物生理代谢研究就蓬勃地开展起来了。E.Buchner这一时期的特点如下：A.进入了微生物生化水平的研究；B.应用微生物的分支学科更为扩大；C.出现了寻找有益微生物代谢产物的热潮；二、微生物学的发展史生命科学与技术学院袁明雄D.普通微生物学开始形成；E.相关学科相互渗透促进了微生物学的发展。整个生命科学进入了分子生物学研究的新阶段，同样也是微生物学发展史上成熟期到来的标志。（5）成熟期（1953年-至今）1953年2月28日，Watson和Crick建立了DNA双螺旋结构理论，奠定了现代分子生物学的基础，整个生命科学由此展开了新的一页。他们俩因此获得了诺贝尔奖。这是迄今为止分量最重的一项诺贝尔奖，“是诺贝尔奖中的诺贝尔奖”。本时期的特点为：A.微生物学从一门在生命科学中较为孤立的应用为主的学科迅速成为一门十分热门的前沿基础学科；二、微生物学的发展史生命科学与技术学院袁明雄B.在基础理论研究方面，逐步进入到分子水平的研究，微生物迅速成为分子生物学研究中的主要对象；C.在应用研究方面，微生物已成为新兴的生物工程中的主角。微生物学的发展史是一部认识微生物的历史、开发利用有益微生物的历史、控制和消灭有害微生物的历史。二、微生物学的发展史3.微生物学发展过程中的重大事件1890，VonBehring制备抗毒素治疗白喉和破伤风；1892，Ivanovsky提供烟草花叶病是由病毒引起的证据；1928，Griffith发现细菌转化；1929，Fleming发现青霉素；1944，Avery等证实转化过程中DNA是遗传信息的载体；1953，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构；1970-1972，Arber、Smith和Nathans发现并提纯了DNA限制性内切酶；生命科学与技术学院袁明雄1977，Woese提出古生菌是不同于细菌和真核生物的特殊类群；二、微生物学的发展史Sanger首次对Ф×174噬菌体DNA进行了全序列分析；1982-1983，Prusiner发现朊病毒（prion）；1983-1984,Mullis建立PCR技术；1995，第一个独立生活的细菌（流感嗜血杆菌）全基团组序列测定完成；1996，第一个自养生活的古生菌基因组测定完成；1997，第一个真核生物（啤酒酵母）基因组测序完成。生命科学与技术学院袁明雄1.什么是微生物微生物（microorganism，microbe）是一切肉眼看不见或看不清的微小生物的总称，它们是一些个体微小（一般小于0.1mm）、结构简单的低等生物，必须借助于显微仪器才能看得见的生物。第三节微生物的类群及特点微生物包括哪些类群呢？生命科学与技术学院袁明雄第三节微生物的类群及特点注意：微生物、酵母、霉菌、蕈菌都不是生物分类学中的名词。生命科学与技术学院袁明雄最小的细菌：纳米细菌（nanobacteria），直径仅50nm。第三节微生物的类群及特点最大的细菌：“纳米比亚硫磺珍珠”（Thiomargaritanamibiensis），有些可达0.75mm。2.微生物的特点微生物由于体形微小，因而导致了一系列与之密切相关的5个重要共性。（1）体积小、面积大——比表面积大生命科学与技术学院袁明雄第三节微生物的类群及特点对1cm3固体作10倍系列三维分割后的比面值变化 边长 立方体数 总表面积 比面值 近似对象 1.0cm 1 6cm2 6 豌豆 1.0mm 103 60cm2 60 细小药丸 0.1mm 106 600cm2 600 滑石粉粒 0.01mm 109 6,000cm2 6,000 变形虫 1.0um 1012 6m2 60,000 球菌 0.1um 1015 60m2 600,000 大胶粒 0.01um 1018 600m2 6,000,000 大分子 1.0nm 1021 6,000cm2 60,000,000 分子生命科学与技术学院袁明雄第三节微生物的类群及特点由于微生物是一个如此突出的小体积大面积系统，从而赋予它们具有不同于一切大生物的五个共性，因为一个小体积大面积系统，必然有一个巨大的营养物质吸收面、代谢废物的排泄面和环境信息的交流面。由此，产生其余4个共性。（2）吸收多、转化快大肠杆菌（Escherichiacoli）每小时可分解自身重量1,000-10,000倍的乳糖。产朊假丝酵母（Candidautilis）合成蛋白质的能力比大豆强100倍，比食用公牛强10万倍，故有单细胞蛋白（singlecellprotein，SCP）的生产。一些微生物的呼吸速率比高等动、植物的组织强数十倍至数百倍。这个特性为微生物的高速生长繁殖和合成大量代谢产物提供了充分的物质基础，从而使微生物能在自然界和人类实践中更好的发挥其超小型“活的化工厂”的作用。生命科学与技术学院袁明雄（3）生长旺、繁殖快E.coli：12.5-20min分裂一次。如果以20min/次计算，请计算每天可产生多少子细胞？第三节微生物的类群及特点4,722,366,500万亿个后代，总量约4,722吨。液体培养物细菌浓度一般仅为108-109细胞/mL，为什么？这一特性对于发酵工业的实践意义在于生产效率高和发酵周期短。（4）适应强、易变异微生物具有极其灵活的适应性或代谢调节机制，这是任何高等动植物所无法企及的。E.coli细胞中能容纳20万-30万蛋白质分子，2000-3000种执行不同生理功能的蛋白质，若每种功能平均分配约100个蛋白质分子，他们仍能保证这一物种在复杂的外界环境中长期存在和进化。极端环境的适应力惊人：高温、高酸、高盐、高辐射、高压、低温、高碱、高毒等环境中能生长繁殖。生命科学与技术学院袁明雄微生物的突变频率很低（一般为10-5-10-10），但由于其繁殖快、数量多、受外界环境影响大等特点，相对而言容易发生变异。第三节微生物的类群及特点有关青霉素有易变异正、反两个方面的例子。青霉素的使用剂量：1940年：10万单位/次1980年：输液80万单位/次2000年：输液800万-1000万单位/次（5）分布广、种类多微生物到处传播，“无孔不入”，条件合适，即“随遇而安”。青霉素生产菌的发酵水平：1940年：每毫升20单位2000年每毫升10万单位微生物的种类多主要体现在以下几个方面：①物种的多样性生命科学与技术学院袁明雄据估计，微生物的总数在50万-60万中之间，其中已记载过的仅20万种（1995年），包括原核生物3,500种，病毒4,000种，真菌9万种，原生动物和藻类10万种，且这些数字还会急剧增加。还会发现多少种？第三节微生物的类群及特点②生理代谢类型的多样性A.分解地球贮量最丰富的初级有机物——天然气、石油、纤维素等B.多样的产能方式——光合作用、化能自养作用、厌氧产能等C.生物固氮D.次生代谢产生复杂有机物E.对复杂有机物的生物转化③代谢产物的多样性微生物的分布广、种类多这一特点，为人类在新世纪中进一步开发利用微生物资源提供了无限广阔的前景——微生物资源学。⑤生态类型的多样性④遗传基因的多样性生命科学与技术学院袁明雄Diversityinspecies虽然目前已定种的微生物只有大约10万种，远较动植物为少，但一般认为目前为人类所发现的微生物还不到自然界中微生物总数的1%生命科学与技术学院袁明雄 人体体表及体内存在大量的微生物：皮肤表面：平均10万个细菌/平方厘米；口腔：细菌种类超过500种；肠道：微生物总量达100万亿，粪便干重的1/3是细菌，每克粪便的细菌总数为：1000亿个；微生物无处不在，我们无时不生活在“微生物的海洋”中 细菌数亿/g土壤，土壤中的细菌总重量估计为：10034×1012吨 每张纸币带细菌：900万个； 每个喷嚏的飞沫含4500-150000个细菌，重感冒患者为8500万生命科学与技术学院袁明雄 强酸、强碱、高热的极端环境； 数十公里的高空（最高为离地85公里，须用火箭采样）； 几千米的地下； 常年封冻的冰川人迹可到之处，微生物的分布必然很多，而人迹不到的地方，也有大量的微生物存在！生命科学与技术学院袁明雄从永冻冰层分离微生物生命科学与技术学院袁明雄南极Vostok湖冰芯样品中的微生物生命科学与技术学院袁明雄1.什么是微生物学（microbiology）微生物学是一门在细胞、分子或群体水平上研究微生物的形态构造、生理代谢、遗传变异、生态分布和分类进化等生命活动的基本规律，并将其应用于工业发酵、医药卫生、生物工程和环境保护等实践领域的科学。第四节微生物学及其分科2.微生物学的根本任务微生物学的根本任务是发掘、利用、改善和保护有益微生物，控制、消灭和改造有害微生物，为人类社会的进步服务。3.微生物学的分科微生物学已经经历了一个多世纪的发展，已分化出大量的分支学科，而且还会不断地形成新的学科和研究领域。生命科学与技术学院袁明雄第四节微生物学及其分科生命科学与技术学院袁明雄20世纪的微生物学走过了辉煌的历程，面对新的21世纪，展望她的未来，将是—幅更加绚丽多彩的立体画卷，在这画卷上也可能会出现我们目前预想不到的闪光点。因此，我们在这里只能是勾勒一下21世纪微生物学发展的趋势。第五节微生物学研究现状和发展1.微生物基因组学目前已经完成基因组测序的微生物主要是模式微生物、特殊微生物及医用微生物，而随着基因组作图测序方法的不断进步与完善，基因组研究将成为一种常规的研究方法，为从本质上认识微生物自身以及利用和改造微生物将产生质的飞跃，并将带动分子微生物学等基础研究学科的发展。2.微生物蛋白质组学我们知道，遗传的中心法则为：DNA→RNA→protein。通过研究微生物蛋白质组学，研究蛋白质的结构和功能，更好地充分利用和改造微生物。生命科学与技术学院袁明雄3.微生物生态学以了解微生物之间、微生物与其他生物、微生物与环境的相互作用为研究内容的微生物生态学、环境微生物学、细胞微生物学等，将在基因组信息的基础上获得长足发展，为人类的生存和健康发挥积极的作用。第五节微生物学研究现状和发展4.微生物生命现象的特性和共性微生物生命现象的特性和共性可概括为：①微生物具有其他生物不具备的生物学特性，例如可在其他生物无法生存的极端环境下生存和繁殖，具有其他生物不具备的代谢途径和功能，如化能营养、厌氧生活、生物固氮和不释放氧的光合作用等，反映了微生物极其丰富的多样性；②微生物具有其他生物共有的基本生物学特性：生长、繁殖、代谢、共用一套遗传密码等，甚至其基因组上含有与高等生物同源的基因，充分反映了生物高度的统一性；生命科学与技术学院袁明雄③微生物个体小、结构简单、生长周期短，易大量培养，易变异，重复性强等优势，十分易于操作。微生物具备生命现象的特性和共性，将是21世纪进一步解决生物学重大理论问题如生命起源与进化，物质运动的基本规律等和实际应用问题如新的微生物资源的开发利用等。第五节微生物学研究现状和发展5.微生物学与其他学科的交叉20世纪微生物学、生物化学和遗传学的交叉形成了分子生物学；21世纪的微生物基因组学则是数、理、化、信息、计算机等多种学科交叉的结果；随着各学科的迅速发展和人类社会的实际需要，各学科之间的交叉和渗透将是必然的发展趋势。21世纪的微生物学又将进一步向地质、海洋、大气、太空渗透，使更多的边缘学科得到发展，如微生物地球化学、海洋微生物学、大气微生物学、以及极端环境微生物学等。微生物与能源、信息、材料、计算机的结合也将开辟新的研究和应用领域。微生物学的研究技术和方法也将会在吸收其他学科的先进技术的基础上，向自动化、定向化和定量化发展。生命科学与技术学院袁明雄6.微生物产业微生物从发现到现在的短短的300年间，特别是20世纪中期以后，已在人类的生活和生产实践中得到广泛的应用，并形成了继动、植物两大生物产业后的第三大产业。这是以微生物的代谢产物和菌体本身为生产对象的生物产业，所用的微生物主要是从自然界筛选或选育的自然菌种。第五节微生物学研究现状和发展21世纪，微生物产业除了更广泛地利用和挖掘不同生境（包括极端环境）的自然资源微生物外，基因工程菌将形成一大批强大的工业生产菌，生产外源基因表达的产物，特别是药物的生产将出现前所未有的新局面，结合基因组学在药物设计上的新策略将出现以核酸（DNA或RNA）为靶标的新药物（如反义寡核苷酸、肽核酸、DNA疫苗等）的大量生产，人类将完全征服癌症、艾滋病以及其他疾病。此外，微生物工业将生产各种各样的新产品，例如降解性塑料、DNA芯片、生物能源等，在21世纪将出现一批崭新的微生物工业，为全世界的经济和社会发展作出更大贡献。生命科学与技术学院袁明雄1.沈萍.微生物学.高等教育出版社,2006.52.周德庆.微生物学教程（第二版）.高等教育出版社3.MichaelT,etal.“Brock'sBiologyofMicroorganism12th”.PrenticeHall，2008,34.M.T马迪根等，微生物生物学（第七版），科学出版社，20015.网络资源：Science、Nature、ASM等期刊杂志等Microbiologyworld,Fungi.com等附：教材与参考文献生命科学与技术学院袁明雄1.用具体事例说明人类与微生物的关系，为什么说微生物既是人类的敌人，更是我们的朋友？2.为什么微生物能成为生命科学研究的“明星”?3.为什么说巴斯德和柯赫是微生物学的奠基人?4.你对微生物学感兴趣吗，怎样理解微生物学的分科？5.你希望微生物课怎样上？附：思考题第七章病毒自19世纪末Ivanowski和Beijerinck分别发现烟草花叶病毒（Tobaccomosaicvirus，TMV）以来，研究病毒的本质及其与宿主的相互作用的病毒学（virology）得到飞速发展，并成为微生物学的重要分支。病毒学研究极大地丰富了微生物学乃至现代生物学的理论与技术，同时，病毒学研究对于有效地控制和消灭人及有益生物的病毒病害，利用病毒对有害生物、特别是害虫进行生物防治，保护人类的健康和人类的经济活动以及人类赖以生存的环境，发展以基因工程为中心的生物高新技术产业，具有特别重要的意义。第一节概述同所有其他生物—样，病毒是一类具有基因、复制、进化、并占据着一定的生态学地位的生物实体，是一类体积非常微小、结构极其简单、性质十分特殊的生命形式。一、病毒的特点和定义病毒在细胞外环境以形态成熟的颗粒形式，即毒粒存在。毒粒具有一定的大小、形态、化学组成和理化性质，甚至可以结晶纯化，如同化学大分子一般不表现任何生命特征。但是毒粒具有感染性，即具有在一定条件下进入宿主细胞的能力。一旦病毒进入细胞，毒粒便会解体，释放出的病毒基因组具有繁殖性，能利用宿主细胞的大分子合成装置进行复制表达，从而导致病毒的繁殖，并随之表现出遗传、变异等一系列生命特征。由此可见，病毒是一类既具有化学大分子属性，又具有生物体基本特征；既具有细胞外的感染性颗粒形式，又具有细胞内的繁殖性基因形式的独特生物类群。病毒以其结构简单、特殊的繁殖方式以及绝对的细胞内寄生，显著区别于其他生物（表7-1）。病毒不具有细胞结构，一些简单的病毒仅由核酸和蛋白质外壳构成，故可把它们视为核蛋白分子。一种病毒的毒粒内通常只含有一种核酸，DNA或者RNA，而且病毒不具有完整的酶系统和能量合成系统，也不具有核糖体。病毒没有生长，也不能以分裂方式进行繁殖。病毒感染敏感宿主细胞后，病毒核酸进入细胞，通过其复制与表达产生子代病毒基因组和新的蛋白质，然后由这些新合成的病毒组分装配成子代毒粒，并以一定方式释放到细胞外。病毒的这种特殊繁殖方式称做复制。病毒是严格的细胞内寄生物。在生活的细胞内，病毒核酸提供遗传信息，利用宿主细胞的酶、能量合成系统、核糖体、细胞因子以及大分子合成的前体来完成自身的生命活动，病毒的寄生是基因水平的寄生。为概括病毒的本质，病毒学工作者一直试图给“病毒”一个科学而严谨的定义，但迄今仍无定论。Luria等（1968）指出：病毒是一种生物实体，其基因组是能利用细胞的合成系统在活细胞内复制，并合成能将病毒基因组转移到其他细胞中去的特殊颗粒的核酸分子（DNA或RNA）。Fields等则于1990年定义病毒为具有独立于其宿主的进化史的绝对细胞内寄生物，它的DNA或RNA基因组被其所编码的蛋白质壳体化。在病毒学研究工作中，还发现类病毒、卫星RNA和朊病毒等更为简单的感染性因子，并将之归在亚病毒因子之列，因此，现在病毒有真病毒与亚病毒之分，真病毒系前所指经典意义的病毒。二、病毒的宿主范围病毒的宿主范围是病毒能够感染并在其中复制的宿主种类和组织细胞种类。病毒几乎可以感染所有的细胞生物。另—方面，病毒又具有宿主特异性，即就某一种病毒而言，它仅能感染—定种类的微生物、植物或动物。因此，根据病毒的宿主范围可将之分为噬菌体、植物病毒和动物病毒等。从原核生物中分离到的病毒统称为噬菌体，它们包括感染细菌的噬菌体，感染蓝-绿藻的噬蓝（绿）藻体以及感染柔膜细菌（支原体和螺旋体）的支原体噬菌体等。已经鉴定的植物病毒达1000多种，其中以种子植物为宿主的植物病毒最为普遍。在藻类植物和真菌中都发现有病毒存在，它们分别称做噬藻体和真菌噬菌体或称真菌病毒。广义的动物病毒包括原生动物病毒、无脊椎动物病毒和脊椎动物病毒。无脊椎动物病毒以昆虫病毒最为常见。在脊椎动物病毒中，能感染人并引起人类疾病的病毒被归为医学病毒范畴。有些病毒有较宽的宿主谱，如虫媒病毒能在吸血的蚊、蠓、白蛉等节肢动物中繁殖，并以它们为介体在哺乳类和禽类等脊椎动物中广泛传播。三、病毒的分类与命名对已发现的病毒进行有序的分类并给以科学的名称，无论是在病毒的起源与进化研究方面，还是在病毒的鉴定与病毒性疾病防治方面都具有重要的意义。1．病毒的分类原则病毒主要依据包括病毒形态、毒粒结构、基因组性质以及生物学性质进行分类。2．病毒的命名规则由于历史的原因，至今仍在沿用的病毒命名仍十分混乱，很多病毒是以地名、症状或疾病、毒粒形态、人名、缩拼字以及字母或数字命名，完全不能反映病毒的种属特征。为求统一，在已有的工作基础上，国际病毒分类委员会（InternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV）于1996年在第10届国际病毒大会上提出了38条新的病毒命名规则，主要内容如下：病毒分类系统依次采用目（order）、科（family）、属（genus）、种（species）为分类等级，在未设立病毒目的情况下，科则为最高的病毒分类等级。病毒“种”是构成—个复制系，占据特定的生态环境并具有多原则分类特征（包括基因组、毒粒结构、理化特性和血清学性质等）的病毒。病毒种的命名应用少而有实意的词组成。种名与病毒株名一起应有明确含义，不涉及属或科名。已经广泛使用的数字、字母及其组合可以作为种名的形容语，但新提出的数字、字母及其组合不再被接受：病毒“属”是一群具有某些共同特征的种，属名的词尾是“virus”，承认一个新属必须同时承认一个代表种。病毒“科”是一群具有某些共同特征的属，科名的词尾是“viridae”，承认一个新科必须同时承认一个代表属。科与属之间可设或不设亚科，亚科的词尾是“virinae”。病毒目是一群具有某些共同特征的科，目名的词尾是“virales”。3．病毒分类系统在1995年发表的ICTV的病毒分类与命名第六次报告中共报道了4000余种病毒，分别划归为49个病毒科。经过以后的几次修改和补充，现在的分类系统将已发现的病毒分为dsDNA病毒、ssDNA病毒、DNA和RNA逆转录病毒、dsRNA病毒、负意ssRNA病毒、正意ssRNA病毒和亚病毒因子等7大类、62个病毒科，其中有少数病毒科已分别划归于有尾噬菌体目、单组分负意RNA病毒目和成套病毒目中，并且一些真核生物的逆转录转座子，如酵母的Ty，果蝇的copia，gypsy现在分别归于DNA和RNA逆转录病毒类的假病毒科和转座病毒科。另外将卫星、类病毒和朊病毒归在亚病毒因子类，其中类病毒科的词尾为“viroidae”、属名词尾是“viroid”。表7-2概括了一些重要的病毒科及其主要特征。第二节病毒学研究的基本方法同微生物学其他学科分支一样，病毒学的进步完全得益于研究方法和技术手段的发展。一、病毒的分离与纯化通过病毒的分离与纯化获得纯化的、有感染性的病毒制备物是病毒学研究和实践的基本技术。1．病毒的分离病毒的分离是将疑有病毒而待分离的标本（如微生物发酵的倒罐液，可疑病毒感染患者的体液、血液、粪便等临床标本）经处理后，接种于敏感的实验宿主、鸡胚或细胞培养，经过一段时间孵育后，通过检查病毒特异性病理表现或用其他方法来肯定病毒的存在。（1）标本的采集与处理用于分离病毒的标本应含有足够量的活病毒，因此必须根据病毒的生物学性质、病毒感染的特征、流行病学规律以及机体的免疫保护机制，来选择所需要采集标本的种类，确定最适采集时间和标本处理的方法。为了避免细菌污染，标本一般都应加人抗菌素除菌，亦可用离心和过滤方法处理。为了使细胞内的病毒充分释放出来，往往还须以研磨或超声波处理破碎细胞。由于大多数病毒对热不稳定，所以标本经处理后一般部应立即接种。若需运送或保存，数小时内可置50％中性甘油内4℃保存，对需较长时间保存标本最好置-20℃以下或干冰保存。（2）标本接种与感染表现标本接种于何种实验宿主（动物、植物、细菌）、鸡胚或细胞以及选择何种接种途径主要取决于病毒的宿主范围和组织嗜性，同时应考虑操作简单、易于培养、所产生的感染结果容易判定等要求。噬菌体标本可接种于生长在培养液或营养琼脂平板中的细菌培养物，噬菌体的存在表现为细菌培养液变清亮或细菌平板成为残迹平板。若是噬菌体标本经过适当稀释再接种细菌平板，经过一定时间培养，在细菌菌苔上可形成圆形局部透明区域，即噬菌斑。动物病毒标本可接种于实验动物、鸡胚和多种细胞培养。嗜神经病毒主要采取脑内接种；嗜呼吸道病毒可进行鼻腔接种、或鸡胚的尿囊腔或羊膜腔接种；嗜皮肤病毒可接种动物皮下、皮内或鸡胚绒毛尿囊膜。由于组织培养生长的细胞对病毒的敏感性较体内成熟细胞高，没有特异性抗体和一些非特异性病毒抑制物的影响，培养和接种方法简单，条件易于控制，成本低，所以现在多数动物病毒都利用细胞培养进行分离。接种于细胞培养的标本主要以细胞病变作为病毒感染的指标。大多数动物病毒感染敏感细胞培养都能引起其显微表现的改变，即产生致细胞病变效应，例如细胞聚集成团、肿大、圆缩、脱落、细胞融合形成多核细胞，细胞内出现包涵体，乃至细胞裂解等。若标本经过适当稀释进行接种并辅以染色处理，病毒可在培养的细胞单层上形成肉眼可见的局部病损区域，即蚀斑或称空斑。与之类似，植物病毒接种敏感植物叶片可产生坏死斑，或称枯斑。若经第一次接种而未出现症状时，往往需要进行重复接种，进行盲传。即将取自经接种而未出现感染症状的宿主或细胞培养的材料，再接种传递给新的宿主或细胞培养，以提高病毒的毒力或效价。如果标本中有病毒存在，经重复传代，其效价或毒力提高，必定会在新的宿主或细胞培养中产生感染症状。相反，在盲传二代后若仍无感染症状出现，便可否定标本中有病毒存在。2．病毒纯化由于病毒只能在活细胞内繁殖，所以用于病毒制备的起始材料只能是病毒感染的宿主机体、组织或细胞经破碎后的抽提物，或病毒感染的宿主的体液、血液和分泌物，或病毒感染的细胞培养物的培养液等。在这些材料中不可避免地混杂有大量的组织成细胞成分、培养基成分、可能污染的其他微生物与杂质。为了得到纯净的病毒材料，必须利用—切可能的方法将这些杂质成分除去，这就是病毒的纯化。（1）病毒纯化的标准病毒纯化有如下二个标准：第一，由于病毒是有感染性的生物体，所以纯化的病毒制备物应保持其感染性。纯化过程中的各种纯化方法对病毒感染性的影响，以及最终获得的纯化制备物是否符合标准，都可利用病毒的感染性测定进行定量分析，第二，由于病毒具有化学大分子的属性，病毒毒粒具有均一的理化性质，所以纯化的病毒制备物的毒粒大小、形态、密度、化学组成及抗原性质应当具有均一性表现。（2）病毒纯化的方法用于病毒纯化的方法很多。不同的病毒有不同的纯化方法，即使同一种病毒．若在不同的宿主系统中其纯化方法也可能不同。但无论是哪种纯化方法，都是根据病毒的基本理化性质建立：第一，毒粒的主要化学组成是蛋白质，鉴于病毒的高蛋白含量，故可利用蛋白质提纯方法来纯化病毒，如盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀、凝胶层析、离子交换等；第二，毒粒具有一定的大小、形状和密度，一般可在10000-100000g的离心场中1-2h沉降，特别是由于毒粒是由许多大分子（蛋白质、核酸等）组成，离心时它们比细胞蛋白沉降更快，而且许多病毒都有较高的浮密度，所以超速离心技术广泛地用于病毒纯化。二、病毒的测定病毒的测定是病毒的定量分析。病毒既能根据其理化性质或免疫学性质进行定量，亦能够根据它们与宿主或宿主细胞的相互作用进行测定。运用不同的方法所进行的测定，具有迥然不同的意义。1．病毒的物理颗粒计数利用一定方法，可以在电镜下直接计算病毒颗粒数目。在动物病毒中，—些裸露病毒的壳体蛋白，特别是许多有包膜的病毒的包膜蛋白能够在一定条件下凝集一定种类的脊椎动物红血球细胞，并且所能凝集血细胞的量与病毒浓度成正比，根据这一原理所设计的血细胞凝集试验亦能用于病毒定量。此外，根据病毒的抗原性质，可以用免疫沉淀试验、酶联免疫吸附试验等方法对病毒进行定量，利用分光光度法也可对病毒定量，但这些方法灵敏性相对较低．多在—些特殊情况下使用。以上所有方法测定的是病毒物理颗粒的数目，即有活力的病毒与无活力病毒数量的总和。而且除电镜计数外，其他方法所测定的是样品中病毒颗粒的相对数量。2．病毒的感染性测定有感染性病毒颗粒数量的测定称做病毒感染性测定，它测定的是因感染所引起宿主或细胞培养某一特异性病理反应的病毒数量。由于病毒的繁殖所引起的宿主反应扩增，以至无论最初接种病毒量的多少，最终所产生的症状可能完全相似，所以用任何感染性测定方法所测得的都不是有感染性病毒颗粒的绝对数量，而是能够引起宿主或宿主细胞—定特异性反应的最小剂量，即病毒的感染单位（infectiousunits，IU）。待测样品中所含病毒的数量，通常以单位体积（ml）病毒悬液的感染单位数目来表示（IU/ml），称作病毒的效价。例如，鼠经鼻孔滴注流感病毒悬液会患肺炎，如果使鼠患肺炎的病毒最小剂量是0.1ml10-6病毒悬液，那么这种流感病毒悬液的感染效价为10’7，即每毫升病毒悬液中有10’7个感染单位的病毒。（1）噬（蚀）斑测定噬斑测定方法最先为噬菌体的感染性测定所建立，以后为动物病毒与植物病毒的测定所借鉴。噬菌体的噬斑测定一般采用琼脂叠层法，一定量的经序列稀释的噬菌体悬液分别与高浓度的敏感细菌悬液以及半固体营养琼脂均匀混合后，涂布在已铺有较高浓度的营养琼脂的平板上，经过孵育后，在延伸成片的细菌菌苔上出现分散的单个噬班，因噬斑数目与加入样品中的有感染性的噬菌体颗粒数量成正比，统计噬斑数目后可计算出噬菌体悬液效价，并以噬斑形成单位（plaqueformingunits，PFU）/毫升表示。动物病毒的蚀斑测定方法与噬菌体的噬斑计数类似，不同的是以生长在固体支持物（培养容器）上的单层细胞代替了生长在营养琼脂平板上的细菌。由于动物病毒在单层细胞培养上所产生的蚀斑表现不同，故有空斑测定、合胞体计数、转化测定和吸附蚀斑测定等不同方法，通过这些方法测定的动物病毒效价以蚀斑形成单位（PFU）表示。植物病毒最为简单的感染性测定方法是坏死斑测定，亦称枯斑测定，即用如金刚砂之类能破坏植物表皮与细胞壁的粉末状物质与一定量的植物病毒混合摩擦植物叶片进行接种，以产生坏死斑的数目来测定病毒样品的效价。（2）终点法对于那些不能用蚀斑法或坏死斑法测定的动、植物病毒可用终点法定量。其方法是取等体积的经10倍或2倍稀释的病毒系列稀释液分别接种同样的实验单元（如某种动物或植物、鸡胚或细胞培养），经过一致时间孵育后，以试验单元群体中的半数（50％）个体出现某一感染反应所需的病毒剂量来确定病毒样品的效价，称做半数效应剂量，并以使50％试验单元出现感染反应的病毒稀释液的稀释度的倒数的对数值表示。根据试验单元的性质及感染反应的性质，半数效应剂量也有不同的表示：如使半数试验宿主死亡的病毒剂量称做半数致死剂量（50％1ethaldose，LD50）；使半数试验宿主发生感染的剂量称做半数感染剂量（50％infectivedose，ID50）；使半数组织培养物遭受感染发生细胞病变的病毒剂量称做半数组织培养感染剂量（50％tissuecultureinfectivedose，TCID50）等。目前，诸如竞争性聚合酶链式反应（PCR）或是竞争性逆转录聚合酶链反应（cRT-PCR）等分子生物学定量方法亦广泛用于病毒研究中。这些方法对于那些体外培养困难的病毒或者病毒含量极微的样品定量分析具有特别的意义。三、病毒的鉴定以物理、化学、生物学乃至分子生物学方法鉴别病毒的性质，描述其特征是病毒分类的前提。另一方面，病毒鉴定是诊断病毒性疾病的可靠方法。1．根据病毒感染的宿主范围及感染表现的鉴定大多数病毒都有相当专一的宿主范围，因而病毒的宿主谱可以作为病毒初步鉴定的指标。病毒感染宿主机体所引起的疾病症状．在鸡胚绒毛尿囊膜上所形成的痘疮的形态，以及在单层细胞培养上所产生的致细胞病变效应表现都有—定特异性，根据病毒这些特征性的表现亦可对其进行初步的鉴定。2．病毒的理化性质鉴定利用电镜技术、分析超速离心技术以及热、紫外线、化学药物、脂溶剂等理化因子对病毒感染性的作用可检查毒粒的大小和形态，测定病毒及其组分的沉降系数、浮力密度和相对分子质量，鉴定病毒的核酸类型，确定病毒对不同理化因子的敏感性。3．血细胞凝集性质鉴定许多病毒能吸附于一定种类的哺乳动物或禽类的红血球细胞表面产生凝集现象。不同的病毒所凝集的血细胞种类以及发生凝集所要求的温度、pH条件可能不同，这些性质给病毒鉴定提供了重要依据。4．病毒的血清学鉴定建立在抗原与抗体特异性反应基础上的免疫学方法是一类非常重要的病毒鉴定方法。免疫沉淀反应、凝集反应、酶联免疫吸附测定、血凝抑制试验、中和试验、免疫荧光、免疫电镜、放射免疫以及单克隆抗体等技术都广泛用于病毒鉴定工作。在这些血清学方法中，利用病毒的性质来检测抗原-抗体反应的方法有血凝抑制试验和中和试验。前者是根据特异性的病毒抗体与病毒表面有血凝活性的蛋白结合，可抑制血细胞凝集发生这一性质设计的；后者则是建立在病毒中和作用的基础上，即某些特异性病毒抗体与毒粒作用，能够使其失去感染性，抑制病毒繁殖，这类病毒抗体称做中和抗体，一种病毒的感染性只能被特异性的中和抗体中和，而且中和一定量病毒的感染性必须有一定效价的病毒抗血清。血清学方法所进行的病毒抗原分析可使病毒鉴定更为难确、精细。它们对于病毒的最终鉴定，乃至区分同型病毒的不同毒株，了解病毒的亲缘关系以及病毒性疾病的诊断都是至关重要的。5．病毒鉴定的分子生物学方法运用变性或不变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳、蛋白质的肽图与N末端氨基酸分析、核酸的酶切图谱和寡核苷酸图谱分析、分子杂交、序列测定、多聚酶链式反应等生物化学与分子生物学方法鉴定病毒核酸、蛋白质等组分的性质，为在分子水平上阐明病毒的性质，对其进行准确的分类鉴定提供了更为直接可靠的证据，而且对于病毒性疾病的实验诊断也具有特殊的意义。例如，至今尚不能在细胞培养中增殖的人乳头瘤病毒的检测主要是用各种类型的核酸杂交方法。其分型亦是根据基因组的序列同源性，分型界限是50％的同源性，超过50％的同源性则为亚型，若仅有几个酶切位点的区别则称做变异株。第三节毒粒的性质毒粒是病毒的细胞外颗粒形式，也是病毒的感染性形式。Dulbacco等（1985）指出：病毒颗粒或毒粒是一团能够自主复制的遗传物质，它们被蛋白质外壳所包围，有的还具有包膜，以保护遗传物质免遭环境破坏，并作为将遗传物质从一个宿主细胞传递给另一个宿主细胞的载体。本节将着重介绍毒粒的形态结构，化学组成以及理化性质。一、毒粒的形态结构毒粒具有一定的大小，形状和结构组成，这些特征为病毒的分离纯化、分类鉴定、病毒的进化和遗传功能研究提供了可靠的依据。1．病毒的大小和形状不同病毒的毒粒大小差别很大，最小者如植物的双粒病毒直径仅18-20nm，最大者如动物的痘病毒的大小达300-450nm×170-260nm。尽管已发现的病毒达数千种。但毒粒的形状大致可分球形颗粒（或称拟球形颗粒）、杆状颗粒和复杂形状颗粒（如蝌蚪状，卵形）等少数几类。另外有的病毒毒粒呈多形性，如流感病毒新分离的毒株常呈丝状，在细胞内稳定传代后则为直径约100nm的拟球形颗粒。2．毒粒的壳体结构病毒毒粒的基本结构是包围着病毒核酸的蛋白质外壳，即壳体或称衣壳。壳体是由大量的同一的壳体蛋白单体分子，即蛋白质亚基以次级键结合形成的，蛋白质亚基又称原体根据相对简单的几何学原理，病毒的壳体主要有两种结构类型。（1）螺旋对称壳体病毒壳体呈螺旋对称，即蛋白质亚基有规律地沿着中心轴呈螺旋排列，进而形成高度有序、对称的稳定结构（图7-1）。病毒的螺旋壳体的特征可以用以下参数描述：螺旋长度、螺旋直径、轴孔直径、螺距及每一螺转上的蛋白质亚基数目等。螺旋壳体的直径是由蛋白质亚基的特征决定的，其长度则是由与壳体结合的病毒核酸分子的长度所决定。在螺旋对称壳体中，病毒核酸以多个弱键与蛋白质亚基相结合，不仅可能控制螺旋排列的形式、壳体的长度，而且核酸与壳体的相互作用还增加了壳体结构的稳定性。（2）二十面体对称壳体构成对称结构壳体的第二种方式是蛋白质亚基围绕具立方对称的正多面体的角或边排列，进而形成一个封闭的蛋白质的鞘。几何学中的立方对称结构实体包括正四面体、正六面体、正八面体、正十二面体和正二十面体。在这些拓扑等价多面体中，若以一定数目的亚基排列成具有一定表面积的立方对称实体，以二十面体容积为最大，能包装更多的病毒核酸，所以病毒壳体多取二十面体对称结构。在病毒的二十面体壳体构成中，一定数目的蛋白质亚基以特殊方式聚集形成在电镜下可见的壳粒，壳粒也称形态学单位。在二十面体壳体形成时，若干个蛋白质亚基聚集形成壳粒，若干个壳粒结合构成壳体。壳粒通常都是由5个或6个蛋白质亚基聚集形成（图7-2），因而它们分别称做五聚体和六聚体。因为五聚体和六聚体各与5个和6个其他的壳粒相邻，所以又分别称做五邻体和六邻体，二十面体壳体也存在其他的构成方式，如SV40的二十面壳体仅由72个中心凹陷的圆筒状的五聚体构成。12个五聚体占据二十面体的顶并分别与5个相邻的五聚体结合，60个非顶五聚体分别与6个相邻的五聚体结合。在二十面体壳体中，病毒核酸盘绕折叠在壳体的有限空间内。在病毒二十面体壳体制备物中，常发现不具有核酸的空壳体存在，这表明核酸对于二十面体壳体的形成并非必需，然而空壳体较完整的病毒颗粒更容易降解，所以核酸的结合有助于增加二十面壳体的稳定性。（3）双对称结构病毒壳体除螺旋对称和二十面体对称两种主要结构类型外，亦有少数病毒壳体为双对称结构。具有双对称结构的典型例子是有尾噬菌体，其壳体由头部和尾部组成。包装有病毒核酸的头部通常呈二十面体对称，尾部呈螺旋对称。图7-3所示的是T4噬菌体的壳体结构。3．病毒的包膜结构病毒的壳体与核心一起构成的复合物为核壳。一些简单的病毒，如烟草花叶病毒、脊髓灰质炎病毒等的毒粒就是—个核壳结构。这类毒粒也称做裸露毒粒。而—些复杂的病毒的核壳外还覆盖着一层称做包膜的脂蛋白膜。包膜是病毒以出芽方式成熟时，由细胞膜衍生而来的。病毒包膜的基本结构与生物膜相似，是脂双层膜。在包膜形成时，细胞膜蛋白被病毒的包膜糖蛋白取代。包膜糖蛋白靠一跨膜固着肽附着于脂双层，其主要的结构域凸出在包膜外侧，形成在电镜下可识别的包膜突起，另有—较小的结构域在包膜内侧。一些无包膜的病毒表面也有一些向外凸出的突起，如腺病毒二十面体核壳的顶上的五邻体纤维，这些突起与病毒的包膜突起一起称做刺突。病毒包膜有维系毒粒结构，保护病毒核壳的作用。特别是病毒的包膜糖蛋白，具有多种生物学活性，是启动病毒感染所必需的。4．毒粒的结构类型根据病毒毒粒有无包膜以及壳体的对称形式，可以将毒粒分为四种主要结构类型（图7-4）：裸露的二十面体毒粒；裸露的螺旋毒粒；有包膜的二十面体毒粒；有包膜的螺旋毒粒。在以上4种结构类型中，不同病毒的毒粒结构复杂程度有很大的区别。还有些病毒，如有尾噬菌体、痘病毒等结构更为复杂，不能包括在这些结构类型之内。二、毒粒的化学组成毒粒的基本化学组成是核酸合蛋白质。有包膜的病毒和某些无包膜的病毒除核酸外，还含有脂类和糖类。有的病毒还含有聚胺类化合物，无机阳离子等组分。1．病毒的核酸核酸是病毒的遗传物质。—种病毒的毒粒只含有一种核酸，DNA或是RNA。除逆转录病毒基因组为二倍体外，其他病毒的基因组都是单倍体。（1）病毒核酸的类型病毒核酸存在单链DNA（ssDNA）、双链DNA（dsDNA）、单链RNA（ssRNA）和双链RNA（dsRNA）4种主要类型。除双链RNA外，其他各类核酸又有线状形式和环状形式，表7-3列举了病毒的主要核酸类型。单链病毒核酸（主要是RNA）能够按照它的极性或意义进行分类。如果病毒ssRNA可以作为mRNA直接进行翻译，则规定它为正极性（+意义），称为正链RNA（+RNA）。如果病毒ssRNA核苷酸序列与其mRNA序列互补，即规定它为负极性（-意义），称为负链RNA（-RNA）。也有某些病毒的RNA是双意，即部分为正极性、部分为负极性。对于病毒的单链DNA，如果与其mRNA序列相同，即为正极性，称正链DNA（+DNA）。如果其核苷酸序列与mRNA互补，即为负极性，即负链DNA（-DNA）。根据病毒核酸转染的结果，即将从病毒毒粒或病毒感染的细胞抽提分离的病毒核酸实验性地导人细胞，若能启动病毒复制循环，产生子代毒粒，则此种病毒核酸为感染性核酸，否则为非感染性核酸。（2）核酸的结构特征不同病毒的核酸均可能具有各自不同的结构特征，主要包括：粘性末端、循环排列和末端重复序列等。分段基因组，即有些病毒基因组是由数个不同的核酸分子构成。许多真核生物的正链RNA病毒的基因组同真核细胞mRNA一样，5’末端有帽子结构，3’末端有聚腺苷酸即poly（A）结构。2．病毒的蛋白质病毒蛋白质根据其是否存在于毒粒中分为结构蛋白和非结构蛋白两类：前者系指构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质，包括壳体蛋白、包膜蛋白和存在于毒粒中的酶等；后者系指由病毒基因组编码的，在病毒复制过程中产生并具有一定功能，但不结合于毒粒中的蛋白质。在此主要介绍病毒的结构蛋白。（1）壳体蛋白壳体蛋白是构成病毒壳体结构的蛋白质，由一条或多条多肽链折叠形成的蛋白质亚基是构成壳体蛋白的最小单位。—些简单的病毒的壳体蛋白仅由一种或少数几种蛋白质构成，而一些复数病毒则可多达20余种。亚基的组成和数目的不同是区别不同的壳体蛋白的标志。壳体蛋白的功能是构成病毒的壳体，保护病毒的核酸。无包膜病毒的壳体蛋白参与病毒的吸附、进入、决定病毒的宿主嗜性，同时它们还是病毒的表面抗原，并还可能有其他的功能活性。（2）包膜蛋白构成病毒包膜结构的病毒蛋白质包括包膜糖蛋白和基质蛋白两类。包膜糖蛋白是由多肽链骨架与寡糖侧链．通过β-N-t糖苷键将糖链的N-乙酰葡萄糖胺与肽链的天冬酰胺残基连结形成。根据寡糖链中单糖残基组成的区别，包膜糖蛋白又分为简单型糖蛋白和复合型糖蛋白两类。除通常的N-糖苷键外，有的病毒包膜糖蛋白，如鼠冠状病毒E1糖蛋白是通过O-糖苷键，在丝氨酸或苏氨酸残基糖基化。包膜糖蛋白是病毒的主要表面抗原，包膜糖蛋白多为病毒吸附蛋白，它们与细胞受体相互作用启动病毒感染发生，有些病毒的包脂糖蛋白还介导病毒的进入，此外它们还可能具有凝集脊椎动物红血球细胞、细胞融合以及酶等活性。有些有包膜病毒，如正粘病毒、副粘病毒等的包膜结构中，还含有一种非糖基化的基质蛋白或称内膜蛋白。基质蛋白构成膜脂双层与核壳之间的亚膜结构。具有支撑包膜，维持病毒结构的作用。更重要的是它介导核壳与包膜糖蛋白之间的识别，在病毒出芽成熟过程中发挥重要作用。（3）毒粒酶参与病毒感染复制的酶有三个来源：—是宿主细胞酶或经病毒修饰改变了的宿主细胞酶；二是病毒的一些非结构蛋白，如正链RNA病毒在复制时产生的依赖于RNA的RNA聚合酶；三是存在于毒粒内的酶即毒粒酶。毒粒酶根据其功能大致可分为两类：一类是参与病毒进入，释放等过程的酶，如T4噬菌体的溶菌酶、流感病毒的神经氨酸酶等；另一类是参与病毒的大分子合成的酶，如逆转录病毒、嗜肝DNA病毒的逆转录酶，所有dsRNA病毒、负链RNA病毒以及—些dsDNA病毒毒粒中存在的转录酶等。一些复杂的病毒，如在细胞质内复制的痘病毒还具有许多参与RNA转录物加工和DNA复制的酶。除以上所述结构蛋白外、在某些病毒的毒粒中还有其他病毒蛋白质，甚至有宿主的蛋白质。例如，腺病毒基因组dsDNA和脊髓灰质炎病毒基因组+RNA的5’端都结合有蛋白质。在乳多空病毒中有细胞组蛋白与病毒DNA结合形成染色体祥复合物。3．病毒的脂类有包膜病毒的包膜内含有来源于细胞的脂类化台物。其中50％-60％为磷脂，余下的多为胆固醇。由于病毒包膜的脂类来源于细胞，所以其种类与含量均具有宿主细胞特异性。脂类构成了病毒包膜的脂双层结构。此外，在少数无包膜病毒，如T系噬菌体、λ噬菌体以及虹彩病毒科的某些成员的毒粒中也发现脂类的存在。4．病毒的糖类有些病毒、其中绝大多数是有包膜病毒含有少量的糖类。它们主要是以寡糖侧链存在于病毒糖蛋白和糖脂中，或以粘多糖形式存在。除了有包膜病毒的糖蛋白突起外，某些复杂病毒的毒粒还含有内部糖蛋白或者糖基化的壳体蛋白。由于这些糖类通常是由细胞合成的，所以它们的组成与宿主细胞相关。5．其他组成在一些动物病毒、植物病毒和噬菌体的毒粒内，存在—些如丁二胺、亚精胺、精胺等阳离子化合物。在某些植物病毒中还发现有金属阳离子存在。这些含量极微的有机阳离子或无机阳离子与病毒核酸呈无规则的结合，并对核酸的构型产生一定的影响。它们的结合量仅与环境中相关离子浓度有关，是病毒装配时从环境中获得的不恒定成分。第四节病毒的复制病毒是严格细胞内寄生物，它只能在活细胞内繁殖。病毒进入细胞后，具有感染性的毒粒消失，存在于细胞内的是有繁殖性的病毒基因组。病毒的繁殖是病毒基因组复制与表达的结果，这是一种完全不同于其他生物的繁殖方式。一、病毒的复制周期1．一步生长曲线一步生长曲线是研究病毒复制的—个经典试验，最初是为研究噬菌体的复制而建立，以后推广到动物病毒和植物病毒的复制研究中。基本方法是以适量的病毒接种于标准培养的高浓度的敏感细胞，待病毒吸附后，或高倍稀释病毒-细胞培养物，或以抗病毒抗血清处理病毒-细胞培养物以建立同步感染，然后继续培养，定时取样测定培养物中的病毒效价，并以感染时间为横坐标，病毒的感染效价为纵坐标，绘制出病毒特征性的繁殖曲线，即一步生长曲线（图7-5）。从一步生长曲线中，可以获得病毒繁殖的两个特征性数据：潜伏期和裂解量。潜伏期是毒粒吸附于细胞到受染细胞释放出子代毒粒所需的最短时间，不同病毒的潜伏期长短不同，噬菌体以分钟计，动物病毒和植物病毒以小时或天计。裂解量是每个受染细胞所产生的子代病毒颗粒的平均数目，其值等于潜伏期受染细胞的数目除以稳定期受染细胞所释放的全部子代病毒数目，即等于稳定期病毒效价与潜伏期病毒效价之比。通过一步生长曲线测定，噬菌体的裂解量—般为几十到上百个，植物病毒和动物病毒可达数百乃至上万个。2．隐蔽期一步生长曲线反映了病毒在细胞培养物中复制的动力学性质。运用成熟前裂解方法，研究病毒在细胞内的复制动态发现，在潜伏期的前—段，受染细胞内检测不到感染性病毒，后一阶段，感染性病毒在受染细胞内的数量急剧增加，自病毒在受染细胞内消失到细胞内出现新的感染性病毒的时间为隐蔽期。不同病毒的隐蔽期长短不同，例如，DNA动物病毒的隐蔽期为5-20h，RNA动物病毒为2-10h。隐蔽期病毒在细胞内存在的动力学曲线呈线性函数，而非指数关系．从而证明子代病毒颗粒是由新合成的病毒基因组与蛋白质经装配成熟，而不是通过双分裂方式产生。3．病毒的复制周期病毒的复制过程概括于图7-6中。病毒感染敏感的宿主细胞，首先是毒粒表面的吸附蛋白与细胞表面的病毒受体结合，病毒以一定方式进入细胞。经过脱壳，释放出病毒基因组。然后病毒基因组在细胞核和/或细胞质中，进行病毒大分子的生物合成：一方面病毒基因组进行表达，产生：①参与病毒基因组复制的蛋白质；②包装病毒基因组成为病毒颗粒的蛋白质；③改变受染细胞结构和/或功能的蛋白质。另一方面病毒基因组进行复制产生子代核酸，并装配成病毒核壳。若是无包膜病毒，装配成熟的核壳就是子代毒粒，并以—定方式释放到细胞外；若是有包膜病毒，核壳通过与细胞膜的相互作用以出芽方式释放，并在此过程中获得包膜。这样—个自病毒吸附于细胞开始，到子代病毒从感染细胞释放到细胞外的病毒复制过程称为病毒的复制周期或称复制循环。病毒的复制周期依其所发生的事件顺序分为以下五个阶段：①吸附；②侵入；③脱壳；④病毒大分子的合成，包括病毒基因组的表达与复制；⑤装配与释放。病毒的吸附、侵入和脱壳又称做病毒感染的起始。二、病毒感染的起始病毒感染细胞，毒粒必须吸附于细胞表面，并进入细胞，经脱壳释放病毒基因组。1．吸附吸附是病毒表面蛋白与细胞受体特异性的结合，导致病毒附着于细胞的表面，这是启动病毒感染的第一阶段。（1）病毒吸附蛋白病毒吸附蛋白（viralattachmentprotein，VAP）是能够特异性地识别细胞受体并与之结合的毒粒表面的结构蛋白分子，亦称做反受体。无包膜毒粒的VAP往往是核壳的组成部分，有包膜病毒的VAP为包膜糖蛋白，如T-偶数噬菌体的尾丝蛋白，流感病毒包膜表面的血凝素糖蛋白等。—些复杂的病毒，如痘苗病毒、单纯疱疹病毒有数种反受体分子，而且反受体可能有几个功能结构域，各与不同的受体作用。编码反受体的基因的突变，能够灭活或破坏反受体的蛋白水解酶、β-糖苷酶及中和抗体等均可导致反受体与受体相互作用能力的丧失，进而影响病毒的感染性。（2）细胞受体病毒的细胞受体亦称病毒受体，系指能被病毒吸附蛋白特异性地识别并与之结合，介导病毒进入细胞，启动感染发生的细胞表面组分。现在已知病毒受体是细胞的功能性物质，为细胞正常生长代谢所必需，而非病毒专一性的成分，例如，狂犬病毒的受体是细胞表面的乙酰胆碱受体，单纯疱疹病毒的受体是硫酸乙酰肝素。不同种系的细胞具有不同病毒的细胞受体，病毒受体的细胞种系特异性决定了病毒的宿主范围。最近还发现人免疫缺陷病毒（Humanimmunodeficiencyvirus，HIV）等的感染需要辅助受体的参与。这种稍后与病毒结合并引发病毒穿入或膜融合的细胞组分又称为第二受体。但至今仍未发现植物病毒的细胞受体存在。（3）病毒的吸附过程病毒吸附蛋白与细胞受体间的结合力来源于空间结构的互补性，相互间的电荷、氢键、疏水性相互作用及范德华力。不同病毒的吸附速率常数有很大差别。而且影响细胞受体和病毒吸附蛋白的活性的因素，如细胞代谢抑制物、蛋白酶、糖苷酶、脂溶剂、抗体等，以及包括温度、离子浓度和pH在内的环境因素均可影响病毒的吸附反应。2．侵入侵入又称病毒内化，它是一个病毒吸附后几乎立即发生，依赖于能量的感染步骤。不同的病毒-宿主系统的病毒侵入机制不同。有伸缩尾的T-偶数噬菌体采取注射方式将噬菌体核酸注入细胞，其过程如图7-7所示。动物病毒能以下列不同的机制进入细胞：①完整病毒穿过细胞膜的移位方式；②利用细胞的内吞功能进入细胞，这种侵入方式又称病毒入胞，以内吞方式进入的病毒颗粒累积在细胞质小泡内，还须以一定方式释放到细胞质中；③毒粒包膜与细胞质膜的融合，病毒的内部组分释放到细胞质中。无包膜病毒以前两种机制侵入细胞。以内吞方式进人的有包膜病毒亦需要通过包膜与小泡膜的融合将内部组分释放入细胞质中。病毒包膜与细胞膜的融合皆需要病毒包膜中有融合活性的包膜蛋白与细胞膜中特定的蛋白组分相互作用。植物有角质化或腊质化的表皮和坚硬的细胞壁，所以植物病毒只能通过因人为地或自然的机械损伤所形成的微伤口进入细胞；或者靠携带有病毒的媒介，主要是靠有吮吸式口器的昆虫取食将病毒带入细胞。植物病毒一旦进入细胞后，增殖产生的子代病毒或病毒核酸可通过病毒编码的运动蛋白与胞间连丝的相互作用从受染细胞进入邻近细胞。3．脱壳脱壳是病毒侵入后，病毒的包膜和/或壳体除去而释放出病毒核酸的过程，它是病毒基因组进行功能表达所必需的感染事件。至今对于病毒脱壳的机制和细节仍缺乏了解，但病毒与细胞受体的作用对于病毒脱壳是至关重要的。T-偶数噬菌体脱壳与侵入是一起发生的，仅有病毒核酸及结合蛋白进入细胞，壳体留在细胞外。动物病毒存在不同的结构类型和不同的侵入方式，其脱壳过程也较复杂。许多病毒（如正粘病毒、副粘病毒、小RNA病毒）的保护性包膜或壳体在病毒进入受染细胞时除去。疱疹病毒、乳多空病毒和腺病毒感染时，壳体沿着细胞骨架从进入位点移到核孔，很可能因细胞因子激活病毒功能，释放病毒DNA或DNA-蛋白质复合物进入核内，空壳最后降解。呼肠孤病毒的壳体仅部分除去。而所有负链RNA病毒的基因组都不完全从壳体释放。痘病毒分两阶段脱壳：首先外壳由宿主细胞酶除去，然后在感染后合成的病毒脱壳酶的作用下，病毒DNA从核心中释放。三、病毒大分子的合成病毒大分子的合成是通过病毒基因组的表达与复制完成的，在这一过程中所发生的各种病毒复制事件存在着强烈的时序性。病毒复制的时序性主要表现为基因组转录的时间组织，即病毒基因组的转录是分期进行的。发生在病毒核酸复制以前的转录为早期转录，所转录的基因称作早期基因，早期基因编码的早期蛋白主要是参与病毒核酸复制、调节病毒基因组表达，以及改变或抑制宿主细胞大分子合成的蛋白质。在病毒核酸复制开始或复制后所进行的转录为晚期转录，所转录的基因称作晚期基因，晚期基因编码的晚期蛋白主要是构成子代毒粒所需的结构蛋白。一些复杂的病毒基因组转录的时间组织分得更细，如T4噬菌体的转录分为立即早期、迟早期、中期和晚期。根据病毒大分子合成过程中所发生事件的时间顺序，可以将此过程划分为三个连续的阶段：①病毒早期基因的表达；②病毒基因组的复制；③病毒晚期基因的表达。1．噬菌体的大分子合成除光滑噬菌体科等少数例外，绝大多数噬菌体都是DNA噬菌体，且除微噬菌体科和丝杆噬菌体科外，其余的都是双链DNA噬菌体。（1）dsDNA噬菌体研究得最为充分的T4噬菌体的大分子合成如图7-8所示。T4噬菌体早期mRNA由大肠杆菌RNA多聚酶完成，早期基因编码的蛋白质参与宿主控制，病毒DNA复制和晚期基因表达的调节，某些早期病毒特异性酶也能降解宿主DNA，从而停止宿主基因表达并为病毒DNA合成提供前体。噬菌体编码的某些早期蛋白质还可取代σ因子与宿主转录酶结合，从而改变了转录酶的启动子特异性，使之自噬菌体晚期启动子起始转录。同时，晚期转录也需要噬菌体DNA的复制，只有正在复制、结构发生改变的病毒DNA才能作为晚期转录的模板。早期基因与晚期基因定位于不同的DNA链上，它们的转录分别以不同方向进行。与T4噬菌体不同，T7噬菌体的晚期转录由病毒早期基因编码的转录酶完成，且其所有的mRNA都是从右向链转录。图7-9表示T7噬菌体的基因组和基因合成蛋白质的顺序。T4DNA复制有两个特点：一是由于T4DNA中胞嘧啶被羟甲基胞嘧啶取代，所以在其DNA复制开始前，必须由噬菌体编码的酶合成羟甲基胞嘧啶，并且在T4DNA合成后，羟甲基胞嘧啶被葡萄糖基化，以保护T4DNA免遭大肠杆菌核酸酶降解，类似的例子亦见于其他的噬菌体DNA，如λ噬菌体DNA合成后腺嘌呤和胞嘧啶被甲基化；二是在T4DNA复制过程中，由6-8个DNA拷贝结合形成非常长的DNA链，这些由数个单位长度DNA以相同方向连结形成的DNA复制分子称做多连体。T7噬菌体DNA和λ噬菌体DNA复制时也有多连体形成。（2）ssDNA噬菌体属于微噬菌体科的噬菌体由φX174基因组为环状正链DNA。由φX174DNA进入细胞后，在宿主的DNA多聚酶作用下形成双链DNA，这种病毒单链核酸复制产生的双链复制分子称做复制型（replicativeform，RF），然后以复制型为模板进行复制和转录、产生更多的复制型、mRNA和子代+DNA基因组（图7-10）。（3）RNA噬菌体大多数RNA噬菌体都是正链RNA噬菌体，属光滑噬菌体科，如噬菌体Qβ、MS2、R17等。其基因组RNA可作为mRNA指导噬菌体蛋白质的合成，其中一种蛋白质产物是病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶。在此复制酶作用下，以基因组+RNA为模板产生双链复制型，然后复制酶利用复制型的负链为模板，合成数千个+RNA拷贝。这些+RNA或是作为模板合成RF，以进一步复制更多的+RNA；或是作为mRNA进行病毒蛋白质合成。最后新合成的+RNA基因组结合于壳体中，产生成熟的病毒颗粒（图7-11）。2．动物病毒的大分子合成动物病毒基因组的结构类型多种多样，每一种都有其独特的复制方式和表达策略（图7-12）。此外，不同病毒的大分子合成位点亦有所不同。DNA病毒的基因组复制与转录在细胞核中进行，但嗜肝DNA病毒的基因组复制以及痘病毒的基因组复制与转录是在细胞质中进行。RNA病毒基因组的复制与转录都在细胞质中进行，而正粘病毒基因组的复制在细胞核内进行，逆转录病毒基因组的复制在细胞质和细胞核中进行。**割裂基因（splitgene）的发现20世纪70年代以前，人们关于基因的概念主要源于细菌遗传学研究，对于真核生物基因结构与表达调控所知甚少。1976年，美国冷泉港实验室罗伯特（RichardRoberts）领导的研究小组发现，起始于相同的11个核苷的腺病毒的几种mRNA在与腺病毒DNA杂交时，这11个核苷不能与DNA链结合。该实验室的研究者还发现，腺病毒基因组一个片段可与来自另一不同区域的mRNA杂交。这些发现开始彻底动摇由细菌研究得来的连续基因的概念。正当这些富有魅力的现象激起罗伯特等更大兴趣之时，麻省理工学院夏普（Phillipsharp）领导的研究小组也获得关于腺病毒基因的类似重大发现。罗伯特与本实验室的电镜专家及时进行了讨论，由他们精心设计了腺病毒DNA与mRNA杂交的实验。所获得的电镜结果显示，含11个核苷的mRNA起始区未与mRNA的其余部分相连，而是结合到DNA链另一区段。更令人感兴趣的是在与mRNA结合的DNA链上，有两个未与mRNA杂交的向外突出的DNA环。根据这些发现，罗伯特等作出革命性结论，真核生物DNA编码的遗传信息是不连续的，即真核基因与原核基因不同，是割裂基因。与此同时，夏普根据其发现亦得出同样的结论。在1977年6月的冷泉港会议上他们报告了这些结果，并在生物学界引起轰动。罗伯特和夏普的发现不但完全革新了传统的基因概念，而且对真核生物基因的表达调控和进化研究以及生物技术产生了巨大的影响，因此他们分享了1993年诺贝尔生理和医学奖。获奖时他们曾风趣地回顾说，当他们观察腺病毒DNA与其mRNA形成的不连续杂交分子图像时，他们便意识到诺贝尔已带着他的遗产敲开了他们的心扉。（1）DNA动物病毒与真核细胞相同，DNA动物病毒的转录与翻译不互相偶联，因此，转录和转录后的加工、修饰以及转运是病毒mRNA合成的突出特征。动物病毒基因组DNA转录产生的初始转录物要经过包括：①3’末端腺苷化；②5’末端加上帽子结构；③甲基化；④拼接等加工修饰才能成熟为功能性mRNA。大多数DNA动物病毒至少早期基因的转录是利用宿主转录酶进行的，但痘病毒早期mRNA由结合于毒粒核心的病毒转录酶合成。动物病毒DNA的复制也和噬菌体一样，依赖于病毒早期蛋白的功能。—些小型DNA病毒依靠宿主细胞DNA聚合酶进行DNA复制，如细小病毒DNA仅能在处于S期的细胞核内复制，而像疱疹病毒和痘病毒等大型DNA病毒的DNA复制都需要病毒编码的DNA聚合酶。乙型肝炎病毒（HepatitisBvirus，HBV）DNA在受染细胞的核内利用宿主RNA聚合酶进行转录并产生几种mRNA，其中最大的3.4kbRNA称做前基因组（progenome），然后RNA前基因组与DNA聚合酶和核心蛋白结合形成未成熟的核心壳粒，继而逆转录酶利用蛋白质为引物，以前基因组+RNA为模板转录产生-DNA，前基因组RNA几乎全部被RnaseH降解，余下的RNA片段再作为DNA聚合酶的引物拷贝-DNA，产生子代dsDNA。（2）RNA动物病毒与DNA动物病毒相比较，RNA动物病毒之间的复制策略存在更大的差别。基于它的基因组复制和转录的模式，可将其分为4个主要类型。①正链RNA病毒如小RNA病毒、黄病毒之类的正链RNA病毒的基因组RNA具有mRNA活性，可直接翻译成聚蛋白，再经宿主和病毒编码的蛋白酶切割产生不同的病毒蛋白质。病毒RNA复制是由新合成的病毒复制酶以基因组+RNA为模板合成-RNA，再以-RNA为模板合成新的+RNA病毒基因组。在复制过程中，有双链形式的复制分子产生。②负链RNA病毒由于负链RNA病毒基因组与其mRNA序列互补，所以它们必须利用结合于毒粒的病毒转录酶合成mRNA。病毒RNA的复制与正链RNA病毒类似。③双链RNA病毒呼肠孤病毒的分段双链RNA基因组的每个节段编码一种mRNA，mRNA的合成是在部分脱壳的颗粒中利用毒粒携带的转录酶转录基因组的负链完成；④二倍体正链RNA病毒逆转录病毒的+RNA基因组由毒粒携带的逆转录酶以细胞的tRNA为引物，逆转录产生-DNA，形成RNA-DNA杂交体。然后+RNA被逆转录酶的RnaseH组分降解，逆转录酶以余下的-DNA为模板复制产生称做前病毒（provirus）的双链DNA。前病毒DNA环化后整合于宿主染色体，并在宿主的RNA聚合酶作用下转录产生mRNA和新的+RNA基因组。另外，布尼亚病毒科白蛉热病毒属成员和沙粒病毒科的成员基因组的S节段是双意RNA，其中的正意部分可直接进行翻译，负意部分则须由毒粒携带的转录酶转录。3．植物病毒的大分子合成以TMV为代表的大多数植物病毒都含有正链RNA基因组。病毒基因组正链RNA的复制与其它的正链RNA病毒类似，包括利用亲代RNA为模板复制负链，然后再以负链为模板合成子代正链这两个步骤。大多数植物都含有依赖RNA的RNA聚合酶，并且这些正常的细胞酶可能参与病毒RNA复制。然而已有证据表明芜菁黄化病毒、豇豆花叶病毒、烟草花叶病毒等可能都是依靠病毒特异性的RNA复制酶进行复制。正链RNA植物病毒亦与其他正链RNA病毒类似，其基因组RNA具有mRNA活性，可直接进行翻译。但是不同的植物正链RNA病毒发展了不同的基因组策略来促进和/或调节基因的表达。这些策略包括合成亚基因组mRNA，翻译的通读和读框移动，产生聚蛋白以及多分基因组等。例如许多植物正链RNA病毒，无论是单分基因组还是多分基因组，定位在基因组RNA3’端的壳体蛋白基因往往不能直接表达，壳体蛋白多是通过与基因组3’端序列相同的亚基因组mRNA翻泽产生。四、病毒的装配与释放在病毒感染的细胞内，新合成的毒粒结构组分以一定的方式结合，组装成完整的病毒颗粒，这一过程称做病毒的装配，亦称成熟或形态发生。成熟的子代病毒颗粒然后依—定途径释放到细胞外，病毒的释放标志病毒复制周期结束。对于有些病毒，特别是有包膜病毒而言，这两个过程有着十分密切的联系。1．噬菌体的装配与释放T4噬菌体的装配过程已作详细研究，这是一个极为复杂的自我装配的过程（图7-13）。这一过程包括4个完全独立的亚装配途径：无尾丝的尾部装配；头部的装配；尾部与头部自发结合；单独装配的尾丝与前已装配好的颗粒相连。以上各个装配步骤通过一系列绝对有序的装配反应进行，其中每一种结构蛋白在装配时都发生了构型的改变，为后一种蛋白质的结合提供了可识别位点。而且前壳体的装配还需脚手架蛋白的参与，这些蛋白质在结构完成后被除去。包括T4噬菌体、单链DNA噬菌体由ΦX174等大多数噬菌体都是以裂解细胞方式释放。丝杆噬菌体不杀死细胞，子代毒粒以分泌方式不断从受染细胞中释放，这是一种病毒与宿主细菌的共生关系，2．动物病毒的装配与释放裸露的、有包膜的和复杂的动物病毒的形态结构都不相同，它们的成熟和释放过程也各有特点，而且，病毒形态发生的部位也因病毒而异。与噬菌体一样，动物病毒晚期基因编码的壳体蛋白自我装配形成壳体。裸露的二十面体病毒首先装配成空的前壳体，然后与核酸结合成熟为完整的病毒颗粒。有包膜动物病毒包括所有具螺旋对称壳体和某些具二十面体壳体的病毒。这些病毒的装配首先是形成核壳，然后再包装上包膜，而且这一过程往往与病毒释放同时发生。有些病毒是在从宿主细胞核出芽的过程中从核膜上获得包膜（图7-14a），如疱疹病毒；有的则是在从宿主细胞质膜出芽的过程中裹上包膜（图7-14b），如流感病毒。3．植物病毒的装配与释放烟草花叶病毒的装配是病毒自我装配的经典范例。TMV壳体蛋白质亚基首先形成20S的双层园盘，然后园盘与靠近TMVRNA基因组3’端的特异性装配起始序列结合，RNA穿过螺旋的中心孔并在生长端形成—个可移动的环。随着蛋白质亚基不断加入，螺旋壳体首先向RNA5’端生长，5’端包装完成后，再向3’端延伸至核壳成熟。植物病毒通过植物的维管进行长距离运动，它们在细胞之间的运动则通过胞间连丝进行，这一过程需要病毒编码的运动蛋白的参与。有些植物病毒的运动蛋白与胞间连丝结合可增大胞间连丝的孔径，以允许病毒颗粒或病毒核酸通过胞间连丝在细胞间扩散；有的植物病毒的运动蛋白可取代胞间连丝，形成利于病毒在细胞间扩散的管状结构。第五节病毒的非增殖性感染病毒对敏感细胞的感染并不一定都能导致病毒繁殖，产生有感染性的病毒子代。因最终的感染结果，敏感细胞的感染可分为两类：一类是增殖性感染，这类感染发生在病毒能在其内完成复制循环的允许细胞内，并以有感染性病毒子代产生为特征；另—类是非增殖性感染，这类感染由于病毒或是细胞的原因，致使病毒的复制在病毒进入敏感细胞后的某—阶段受阻，结果导致病毒感染的不完全循环。在此过程中，由于病毒与细胞的相互作用，虽然亦可能导致细胞发生某些变化，甚至产生细胞病变，但在受染细胞内，不产生有感染性的病毒子代。一、非增殖性感染的类型病毒的非增殖性感染有三种类型：流产感染、限制性感染和潜伏感染。1．流产感染这是一类普遍发生的非增殖性感染。依其发生原因。可以将之分为依赖于细胞的流产感染和依赖于病毒的流产感染两类。（1）依赖于细胞的流产感染如果病毒感染的细胞是病毒不能复制的非允许细胞，将导致流产感染。在非允许细胞内，往往仅有少数病毒基因表达，病毒不能完成复制循环。其原因，可能与这些细胞缺失某些参与病毒复制的酶、tRNA或细胞因子有关。允许细胞与非允许细胞的划分是相对于某—特定的病毒而言的，一种病毒的允许细胞可能是另一种病毒的非允许细胞，反之亦然。例如，猴肾细胞是SV40的允许细胞，但人腺病毒感染猴肾细胞则会导致流产感染发生。（2）依赖于病毒的流产感染这类流产感染系因基因组不完整的缺损病毒引起。这类病毒因一个或多个病毒复制必需基因有缺损，丧失了其功能，所以它们无论是感染允许细胞还是非允许细胞，都不能完成复制循环。2．限制性感染这类感染系因细胞的瞬时允许性产生，其结果或是病毒持续存在于受染细胞内不能复制、直到细胞成为允许性细胞，病毒才能繁殖；或是一个细胞群体中仅有少数细胞产生病毒子代。例如，人乳头瘤病毒可感染上皮细胞，并且其早期基因的转录可在受染的各分化期的上皮细胞中进行。但是由于晚期基因转录仅能在分化成熟的鳞状上皮细胞中进行，所以只有进入终末分化的鳞状上皮细胞才有病毒增殖。3．潜伏感染这类感染的显著特征是在受染细胞内有病毒基因组持续存在，但并无感染性病毒颗粒产生，而且受染细胞也不会被破坏，这种携带有病毒基因组但不产生有感染性病毒的细胞称做病毒基因性细胞。潜伏感染的另—个极端情况是由于病毒基因的功能表达导致宿主基因表达的改变，以致正常细胞转化为恶性细胞。二、缺损病毒从某种意义而言，所有的病毒都是缺损的，因为它们都只能寄生于活细胞内进行复制。然而缺损病毒的复制还需要其他病毒基因组或病毒基因的辅助活性，否则即使在活细胞内也不能复制。不同的缺损病毒的来源和基因组的缺损表现都不相同，而且病毒基因组往往可能因严重缺损而丧失全部生物学功能。有生物活性的缺损病毒包括四类：干扰缺损病毒或称干扰缺损颗粒（defectiveinterferingparticles，DI颗粒）、卫星病毒、条件缺损病毒和整合的病毒基因组。1．干扰缺损颗粒DI颗粒是病毒复制时产生的一类亚基因组的缺失突变体。现在己知无论是动物病毒，还是植物病毒和噬菌体在自然感染或实验感染时，都可能产生各自相关的DI颗粒。特别是在高感染复数（multiplicityofinfection，m.o.i）时，DI颗粒能以较高的频率产生。由于DI颗粒基因组有缺损，故不能完成复制循环，而必须依赖于其同源的完全病毒才能复制。同时，由于DI基因组较其完全病毒小、复制更为迅速，在与其完全病毒共感染时更易占据优势，从而干扰其复制。在病毒感染时普遍产生的DI颗粒能污染病毒制备物，并给病毒的生物学活性带来深刻且通常是有害的影响。DI颗粒干扰标准病毒的复制可能是某些病毒分离和培养困难的原因之一。DI颗粒在病毒持续性感染的形成中也可能起着重要作用。2．卫星病毒卫星病毒是寄生于与之无关的辅助病毒的基因产物的病毒。与DI颗粒类似，卫星病毒的基因组是缺损的，它必须依赖于辅助病毒才能复制。与DI颗粒不同的是，它们不是由其辅助病毒的基因缺失产生的，而是存在于自然界中的一种绝对缺损病毒，而且它们的形态结构和抗原性都与辅助病毒不同，其基因组与辅助病毒的基因组也很少有同源性。细小病毒科中的腺联病毒（Adeno-zssociatedvirus，AAV）是一种卫星病毒。这种小型的二十面体病毒含单链DNA基因组。AAV只能在同时有腺病毒或疱疹病毒感染的细胞核内复制，并且它还可干扰腺病毒的复制以及腺病毒引起的细胞转化。若是AAV单独感染细胞，则会导致流产感染发生，并且AAV的基因组整合在宿主细胞DNA中。大肠杆菌噬菌体P4是一种更为复杂的卫星病毒，属肌尾噬菌体科。若无非缺损的辅助病毒大肠杆菌噬菌体P2的同时感染，它不能复制产生成熟的噬菌体颗粒。其原因是P2缺乏编码壳体蛋白的结构基因，它必须依赖P2合成的壳体蛋白装配成仅有P2壳体大小1/3的P4壳体，这样的壳体适于包装较小的P4DNA。除腺联病毒和P4噬菌体外，卫星烟草坏死病毒，丁型肝炎病毒这些原来未归属于相应的病毒科或属的卫星病毒现在划归在亚病毒因子的卫星病毒之中。3．条件缺损病毒条件缺损病毒是一类基因组发生了突变的病毒条件致死突变体．它们在允许条件下能够正常繁殖，在非允许条件或称限制条件下导致流产感染发生。某些条件缺损病毒也能干扰野生型病毒复制，它们的许多生物学行为与DI颗粒相似。4．整合的病毒基因组某些温和噬菌体和肿瘤病毒感染宿主细胞后，因病毒与细胞的性质，病毒基因组整合于宿主染色体，并随细胞分裂传递给子代细胞，这类感染称之为整合感染。除非缺损的外源性RNA肿瘤病毒外，病毒整合感染的细胞没有感染性的病毒产生。只有在—定条件下，整合在宿主染色体的病毒基因组才能转入复制循环，产生有感染性的病毒颗粒。（1）温和噬菌体的溶源性反应大多数噬菌体感染宿主细胞，都能在细胞内正常复制并最终杀死细胞，这类噬菌体的裂解循环一般都是由烈性噬菌体引起。而另有一些噬菌体除能以裂解循环在宿主细胞内生长外，还能以溶源状态存在。以溶源状态存在的噬菌体不能完成复制循环，噬菌体基因组长期存在于宿主细胞内，没有成熟噬菌体产生，这一现象称做溶源性现象。能够导致溶源性发生的噬菌体称做温和噬菌体或称溶源性噬菌体。在大多数情况下，温和噬菌体的基因组都整合于宿主染色体中（如λ噬菌体），亦有少数是以质粒形成存在（如P1噬菌体）。整合于细菌染色体或以质粒形成存在的温和噬菌体基因组称做原噬菌体。在原噬菌体阶段，噬菌体的复制被抑制，宿主细胞正常地生长繁殖，而噬菌体基因组与宿主细菌染色体同步复制，并随细胞分裂传递给子代细胞。细胞中含有以原噬菌体状态存在的温和噬菌体基因组的细菌称做溶源性细菌。处于溶源性细菌细胞中的噬菌体DNA在一定条件下亦可启动裂解循环，产生成熟的病毒颗粒。自然情况下的溶源性细菌的裂解称为自发裂解，但裂解量较少。若经紫外线、氮芥、环氧化物等理化因子处理，可产生大量的裂解，此称为诱发裂解。溶源性反应是一种比裂解反应更有利于病毒持续和传播的病毒生存方式。处于这种最适应于它们所处环境中的噬菌体不会迅速杀死细胞，从而丧失传播的机会，所以，这也被认为一种原始的分化方式。（2）动物病毒的整合感染在动物病毒中，许多DNA肿瘤病毒（如SV40、乙型肝炎病毒等）和RNA肿瘤病毒都能引起整合感染。在这些病毒感染的细胞中，病毒的基因组DNA或前病毒DNA整合到宿主细胞染色体中。除慢性RNA肿瘤病毒和非复制缺损型的急性RNA肿瘤病毒外，受染细胞内没有病毒繁殖。只有在—定条件下，整合在细胞染色体上的病毒基因组才能转入复制循环，产生子代病毒颗粒。属于逆转录病毒科RNA肿瘤病毒的基因组通过逆转录产生DNA中间体，然后整合到宿主染色体。这一过程是病毒复制的必经阶段。整合到宿主染色体的病毒dsDNA中间体称做前病毒。RNA肿瘤病毒感染细胞后能否繁殖和引起细胞转化取决于病毒和受染细胞的性质。除Rous肉瘤病毒外，所有的急性RNA肿瘤病毒都是缺损病毒，由于其复制必需基因缺损，所以都不能独立复制。另外还有一类内源性病毒，这类RNA肿瘤病毒的基因组普遍存在于许多动物的DNA中，但不转化细胞，也不产生病毒。内源性前病毒与原噬菌体类似，亦可自发或经诱导转入复制循环，产生有感染性的病毒。第六节病毒与宿主的相互作用病毒必须进入细胞并利用宿主细胞大分子合成机制和能量装置进行复制，因此在许多方面，病毒复制研究就是病毒与其宿主相互作用的研究。这一研究不仅有助于阐明病毒感染和致病的生物学和分子生物学机理，而且对于病毒感染的诊断与控制具有重要的意义。一、噬菌体感染对原核细胞的影响不同的噬菌体感染对宿主细胞的生物学效应有很大差别。有些噬菌体，如单链DNA噬菌体fd、f1等的感染对受染细胞影响很小，子代病毒以非致死的分泌方式释放，这是一种非杀细胞感染。这类噬菌体正因为具有这一特点，故在最近发展起来的噬菌体显示技术（phagedisplaytechniques）中被用于构建噬菌体表达载体。然而，许多噬菌体的感染都可能给细胞造成巨大的影响，最终细胞被杀死和/或裂解，这类感染常称作杀细胞感染或裂解感染。温和性噬菌体感染机制已进化到能够控制自身的复制和对细胞的破坏的地步，以致它们仍能够维持相对稳定，以原噬菌体这样一种变化了的生命形式长期与宿主细胞结合在一起，并在一定条件下转入复制，结果噬菌体增殖、细胞裂解。1．抑制宿主细胞大分子合成许多噬菌体感染时都能产生关闭蛋白，这些蛋白质能以不同的方式抑制宿主细胞的大分子分成：①抑制宿主基因的转录。T4噬菌体的某些早期蛋白质结合于宿主转录酶或引起宿主转录酶的磷酸化和腺苷化，改变其启动子识别特异性，使之由细胞mRNA合成转向噬菌体mRNA合成。T7噬菌体基因2编码的蛋白还能结合宿主转录酶并导致其失活，从而抑制宿主细胞mRNA合成。②抑制宿主蛋白质合成。除了因宿主转录的抑制间接影响其蛋白质合成外，有些噬菌体蛋白质能灭活细胞tRNA，从而直接抑制宿主蛋白质合成，如T4噬菌体编码的蛋白能灭活宿主亮氨酸+RNA，并以噬菌体tRNA代之。③宿主DNA合成的抑制。T-偶数噬菌体编码的内切核酸酶和外切核酸酶逐步降解宿主染色体，使细胞DNA合成因缺乏模板而终终止。另一方面．T-偶数噬菌体也通过抑制细胞核苷酸合成而改变宿主DNA合成代谢。大多数较为简单的噬菌体通常都不破坏细胞DNA。2．宿主限制系统的改变为了抵御宿主限制性酶系统对侵入的病毒DNA所可能造成的损害，噬菌体编码的酶往往能破坏这些系统，使病毒DNA得到保护。例如，T3噬菌体感染时产生的酶能水解S-腺苷甲硫氨酸（SAM）而使某些宿主的依赖SAM的限制酶系统失效。T-偶数噬菌体的基因产物亦可直接抑制宿主抗T-偶数噬菌体的限制性核酸酶的活性。3．噬菌体颗粒释放对细胞的影响fd、M13等丝杆噬菌体的增殖性感染不杀死细胞，细胞继续生长，病毒复制产生的外壳蛋白结合于细胞膜，噬菌体颗粒以分泌方式释放时，病毒单链DNA穿过细胞膜时被壳体蛋白包裹形成杆状颗粒。由于壳体蛋白与细胞膜结合，细胞表面出现病毒特异性抗原，从而改变受染细胞的免疫学性质。大多数噬菌体都是以裂解方式释放，其结果导致受染细胞死亡。以裂解方式释放的噬菌体晚期基因的产物能自动使细胞膜失去稳定，然后细胞壁的肽聚糖网状结构以不同的方式被破坏。如T4噬菌体编码的溶菌酶能分解肽聚糖，λ噬菌体产生的内溶菌素可断裂肽键。许多复杂的噬菌体的基因产物还能通过调节裂解酶的活性而控制裂解过程。4．溶源性感染对细胞的影响溶源菌中的温和噬菌体基因组通常不影响细胞的繁殖功能，但它们可能引起其他的细胞变化。这些变化不但对溶源菌，而且也可能对溶源菌的宿主机体产生深刻的生物学影响。（1）免疫性溶源性细菌对本身所携带的原噬菌体的同源噬菌体有特异性免疫力，这是所有的溶源性细菌都具有的一个重要性质。免疫性是由原噬菌体产生的阻遏蛋白的可扩散性质所决定的。（2）溶源转变溶源转变是原噬菌体引起的溶源性细菌除免疫性外的其他的表型改变，包括溶源菌细胞表面性质的改变和致病性转变。原噬菌体诱发的致病性转变可能是细菌致病机理的一个重要方面，因而具有重要的医学意义。二、病毒感染对真核细胞的影响真核细胞对病毒的感染可呈现不同的反应：①细胞无任何明显变化；②由于病毒的致细胞病变效应，细胞损伤、死亡；③细胞增生，继而或是细胞死亡，或是细胞继续失去生长抑制，转化为癌细胞。相对于植物病毒而言，对于病毒感染动物细胞的过程了解更为详尽，所以主要以动物病毒为例介绍病毒感染对真核细胞的影响。1．病毒感染的致细胞病变效应病毒感染引起的致细胞病变效应或细胞损伤是因病毒的基因产物的毒性作用所引起，或是病毒复制的必需步骤的次级效应，而且以后者更为普遍。例如，腺病毒的五邻体基底蛋白可引起单层细胞脱落，以前认为这是一种机制未明的毒性作用，现在已明确这是病毒内化时，五邻体基底蛋白通过RGD序列与细胞表面的整联蛋白结合的结果。具有强烈致细胞病变效应的病毒最终都会导致细胞死亡。病毒感染引起细胞死亡的原因非常复杂，但至少有两种方式：一是由于病毒对宿主细胞的毒性作用可导致细胞坏死；二是活化了细胞程序性死亡途径导致细胞凋亡。在有些情况下，二者可同时发生。2．病毒感染对宿主大分子合成的影响许多真核生物病毒，特别是杀细胞病毒具有干扰宿主大分子合成的能力。这种影响或是直接由某些病毒功能所引起，或是由病毒对某些宿主功能的作用而间接引起。无致细胞病变效应的病毒，很少抑制宿主细胞大分子合成。还有一些病毒能刺激宿主细胞的大分子合成。（1）宿主细胞转录的抑制许多动物病毒的感染都能抑制宿主细胞基因的转录。对于不依赖宿主细胞RNA多聚酶进行复制的RNA病毒而言，这一活性可为病毒RNA合成提供更多的核糖核苷三磷酸。对于DNA病毒则可使宿主细胞DNA多聚酶II转向病毒基因组的转录，以减少对RNA合成的前体和转录因子的竞争。有些病毒也能抑制宿主细胞RNA的转运和加工，进而抑制细胞的RNA的成熟。流感病毒编码的内切核酸酶切割宿主细胞转录物的5’末端作为病毒mRNA合成的引物，从而阻止了宿主细胞mRNA的成熟。（2）宿主细胞翻译的抑制许多病毒感染细胞后都会抑制宿主细胞mRNA的翻译，其结果是为病毒蛋白质合成提供更多的核糖体亚单位、翻译起始因子、tRNA和氨基酸前体。病毒感染抑制宿主翻译的方式包括：①降解宿主的mRNA；②因大量的病毒mRNA竞争有限的核糖体或病毒mRNA较细胞mRNA对核糖体有更高的亲合力，从而抑制细胞mRNA翻译；③改变宿主翻译装置的特异性。（3）宿主细胞DNA复制的抑制主要有以下原因：①为病毒DNA合成提供前体；②为病毒DNA合成提供宿主细胞结构和/或复制蛋白；③细胞蛋白质合成被抑制的次级效应。DNA病毒和RNA病毒都可能抑制宿主细胞DNA合成，其可能的机制包括细胞DNA从其正常的复制位点被取代；细胞DNA复制蛋白转向病毒DNA合成；细胞DNA被降解体；以及由于宿主DNA复制所必需的宿主蛋白质和/或RNA合成被抑制的间接影响等。但是，有些病毒，特别是依赖宿主细胞DNA复制的DNA肿瘤病毒，如乳多空病毒能够刺激细胞的DNA合成，诱导处于G0期的宿主细胞进人S期。3．病毒对细胞结构的影响无致细胞病变效应或致细胞病变效应弱的病毒感染对宿主细胞结构几乎无任何影响，而致细胞病变效应很强的病毒则可能对宿主细胞膜、细胞骨架等结构造成严重影响。（1）病毒对宿主细胞膜的影响一些具有有融合活性的表面蛋白的有包膜病毒能够启动细胞之间的融合，形成多核细胞。由病毒引起的细胞融合有两种类型：一种是从外部融合，这是病毒以高感染复数感染时，由毒粒表面具有融合活性的糖蛋白引起未受病毒感染细胞之间的融合；另一种融合是从内部融合，这是因受染细胞内表达的病毒糖蛋白结合于细胞表面而导致的受染细胞与相邻细胞的融合。某些病毒的感染还能增加宿主细胞质膜的离子通透性，例如细胞内钠离子的流入增加。由于病毒mRNA的翻译较细胞mRNA对高钠离子浓度有更强的抵抗能力，所以膜通透性的增加可能有利于病mRNA的翻译。此外，病毒感染还可能引起受染细胞对抗生素和毒素的通透性增加。细胞质膜通透性的改变据认为是由于病毒蛋白质的插入所引起。（2）病毒对细胞骨架的影响许多病毒的感染会导致细胞骨架纤维系统的瓦解，如水泡性口炎病毒、痘苗病毒、SV40、犬瘟热病毒、蛙病毒3型和HSV等感染细胞都会引起含肌动蛋白的微丝减少。其中HSV、犬瘟热病毒和蛙病毒3型等还能引起微管解聚。由于细胞骨架在维持细胞形态中起一定作用，所以病毒引起细胞骨架的改变是受染细胞结构变化的原因之一。细胞骨架的变化是病毒感染的间接效应，如细胞大分子合成的抑制即可导致细胞骨架的改变。在受染细胞的细胞质或细胞核内，常有称之为“病毒工厂”或包涵体的病毒核酸合成和毒粒装配的新结构形成。有证据表明，特异性的细胞骨架组分结合到细胞质包涵体中。电镜研究显示包涵体含有微管和5-8nm的结状微丝，从而证明病毒的感染可以利用细胞结构成分构建病毒复制工厂。（3）包涵体病毒复制复合物、转录复合物、复制和装配中间体、核壳和毒粒经常累积在宿主细胞的特定区域而形成病毒工厂或包涵体结构，这些结构在细胞质和/或细胞核的定位反映了—种特定病毒的复制位点。不同病毒所形成的包涵体各具特异性的染色性质，即有的嗜酸性染料、有的嗜碱性染料，并且不同病毒的包涵体的大小、形态以及数量都有所区别，所以包涵体在病毒的实验诊断中具有一定意义。在包涵体中由于累积有结晶排列的壳体或核壳，这些新结构的装配可以改变或取代宿主细胞组分，并成为细胞病变的一种形式。（4）细胞凋亡许多病毒能够诱发细胞凋亡，其机制较为复杂且各不相同。通常病毒感染细胞后通过关闭或干扰宿主细胞正常合成代谢诱发细胞凋亡，或者由病毒编码的蛋白因子直接作用于细胞与凋亡有关的因子及蛋白水解酶而诱发细胞凋亡。越来越多的资料表明病毒感染与细胞凋亡有着密切的联系，许多病毒的致细胞病变效应往往是诱发细胞凋亡的结果。细胞凋亡可能是宿主在细胞水平抵御病毒感染的一种机制，通过局部受染细胞的凋亡可限制病毒的繁殖与传播以拯救整个器官和个体。另一方面，为了生长与繁衍，有些病毒进化获得凋亡抑制基因，它们在感染早期即开始表达，抑制宿主细胞凋亡，使病毒顺利完成复制周期。在这种情况下，病毒诱发的细胞亡和凋亡抑制同时存在于受染细胞，它们相互作用协调着病毒与细胞的关系，使病毒在细胞内能够顺利复制。三、机体的病毒感染对于动物、植物的机体而言，病毒感染的意义与细胞的病毒感染有很大的区别，这是一个更为复杂且不断变化着的过程，是病毒与机体相互作用所产生的各种现象的总和。1．机体病毒感染的类型机体的病毒感染可按不同的形式进行分类。根据感染症状的明显程度，可分为显性感染和隐性感染（非显性感染）。根据感染过程，症状和病理变化发生的主要部位，可分为局部感染和系统感染。根据病毒在机体内存留时间的长短以及病毒与宿主相互作用的方式，可分为急性感染和持续性感染。2．构成机体病毒感染的因素机体内病毒感染的表现形式和结果由病毒、机体和环境条件三者的综合作用决定。（1）病毒病毒的特征，即病毒的致病性和毒力直接影响病毒感染的表现与结果。病毒的致病性是特定的病毒种引起感染过程的潜在能力，是病毒种的特征。但是同一种病毒的不同毒株的致病性可能存在很大差别，特定的毒株致病性的强弱就是病毒的毒力，毒力是病毒株的特征。引起病毒感染的另一个必要条件是病毒的数量，它与病毒的毒力以及机体对病毒的敏感性有关。病毒的毒力越强，引起机体感染所需的病毒剂量越低；机体对病毒的抵抗力越强，引起感染所需的病毒剂量越高。近年来，在一些复杂病毒，如痘病毒、疱疹病毒中发现病毒编码受体和病毒因子，这些病毒基因组编码的产物能以不同方式影响病毒的感染过程。病毒因子是病毒编码的，与机体的免疫调节因子或效应因子结构相似的蛋白质，如痘病毒编码的生长因子，它们可刺激感染灶邻近细胞的代谢，使其成为病毒感染的靶细胞，促进病毒进一步繁殖；病毒编码受体是病毒编码的，可与免疫效应因子或调节因子结合的细胞受体类似物，其主要作用是阻断和抑制细胞因子与其受体结合，从而抑制宿主的免疫反应，使病毒自身得到保护。（2）机体病毒侵入机体后，病毒在细胞内的活性，病毒在体内的传播以及病毒感染的表现和结果，不仅取决于病毒的质和量，同时亦取决于机体的防御结构和防御功能状态。对病毒感染的免疫和抵抗是完整机体的一种生理功能，以保护机体免于感染或严重感染。此外，机体的年龄、激素分泌水平、生理状态、营养状况、中枢神经活动以及非免疫抵抗的遗传因素等一系列十分复杂的因素，都影响机体的病毒感染过程。（3）环境条件机体生存所处的生态环境、气候条件中所可能存在的多种生物或非生物因子，以及诸如人的生活方式、动物的饲养管理方式和植物的栽培方式等因素，均能作用于病毒和/或机体而间接影响病毒的感染过程。第七节亚病毒因子亚病毒因子包括卫星病毒、卫星RNA、类病毒和朊病毒。在亚病毒因子中，仅有类病毒和朊病毒能独立复制，朊病毒颗粒不具有基因组核酸。卫星病毒与卫星RNA都具有核酸基因组，它们与DI颗粒类似，必须依赖辅助病毒进行复制，与DI颗粒不同的是，它们与其辅助病毒没有核酸序列同源性。卫星病毒、卫星RNA、类病毒和DI颗粒的性质比较于表7-4中。一、卫星病毒除前已述及的AAV和P4噬菌体外，另有一些卫星病毒被归在亚病毒之列，如卫星烟草坏死病毒（Satellitetobacconeorosisvirus，STNV）、卫星烟草花叶病毒（Satellitetobaccomoscirevirus，STMV）、丁型肝炎病毒（HepatitisDvirus，HDV）等。1．植物卫星病毒卫星病毒首先是在植物中发现，已知的植物卫星病毒包括STNV、STMV、卫星稷子花叶病毒和卫星玉米白线花叶病毒等。它们都依赖辅助病毒提供复制酶进行复制，并且都编码有壳体蛋白。植物卫星病毒对辅助病毒的依赖性相当专一。例如除烟草坏死病毒（Tobacconeorosisvirus，TNV）外，其他的植物病毒都不能辅助STNV的复制，而且STNV的不同毒株必须依赖一定的TNV毒株进行复制。2．丁型肝炎病毒丁型肝炎病毒（HDV）是亚病毒感染因子中的δ病毒属的代表成员，1977年在意大利的乙型肝炎病毒携带者中发现。HDV是一种缺损病毒，它必须利用乙型肝炎病毒的包膜蛋白才能完成自身的复制循环，而且土拨鼠肝炎病毒亦能辅助其复制。HDV的单链环状RNA基因组与植物类病毒类似、呈杆状二级结构，但其大小与类病毒不同，而且它具有编码蛋白能力。HDV的反基因组RNA含有一个开放阅读框，依靠特异性的RNA编辑功能可产生称之为“δ抗原”的两种RNA结合蛋白，它们分别参与基因组复制和颗粒装配。HDV和类病毒一样，利用宿主的依赖DNA的RNA聚合酶以正意和负意RNA为模板，通过滚环机制复制，产生的多聚体RNA链经过自我位点特异性的切割和连接（核酶活性）形成子代共价闭合环状分子。二、卫星RNA卫星RNA是指一些必须依赖辅助病毒进行复制的小分子单链RNA片段，它们被包装在辅助病毒的壳体中，本身对于辅助病毒的复制不是必需的，且它们与辅助病毒的基因组无明显的同源性。1．基因组结构卫星RNA大小可分为两类。大者如番茄黑环病毒的卫星RNA长1372-1376个核苷酸，大小与卫星病毒基因组类似，但多数都在300个核苷酸左右，如烟草环斑病毒的卫星RNA、黄瓜花叶病毒的卫星RNA。许多卫星RNA的5’端有帽子结构，3’端无poly（A），而是类似tRNA的结构，并且卫星RNA通过分子内部碱基配对形成复杂的二级结构。较大的卫星RNA具有长开放阅读框并能够表达，而较小的卫星RNA似乎不具有mRNA功能。许多卫星RNA都能以线状和环状两种形式存在于被感染的组织中，但是在辅助病毒颗粒中仅有线状形式存在。2．复制除了大小和蛋白质编码能力的区别外，不同的卫星RNA的复制方式也不同。一些较小的卫星RNA，如绒毛烟斑驳病毒卫星RNA是以对称的滚环方式复制（图7-15）。复制过程中产生的正链和负链的RNA多聚体都要经过自发的自我切割产生线状的单体分子，线状的负链RNA环化后作为合成子代正链的模板。正链和负链的切割都与其内部的核酶活性结构有关。包括一些较小的和大的另一类卫星RNA复制时不能自我切割，复制方式与辅助病毒一致。3．卫星RNA的生物活性许多卫星RNA能显著影响其辅助病毒在宿主中所产生的症状，如南芥菜花叶病毒卫星RNA能加重ArMV所引起的花叶和褪绿症状，但TobRSV卫星RNA能明显减轻TobRSV在烟草上所引起的环斑症状。有的病毒的不同毒株的卫星RNA对辅助病毒在宿主上引起的症状有不同的影响，而且同一种卫星RNA在不同宿主内对辅助病毒引起的症状的影响也不相同。卫星RNA对辅助病毒所引起的症状的修饰作用，与卫星RNA的核苷酸序列、空间结构和复制特征有关。由于很多卫星RNA能减轻辅助病毒所引起的宿主症状，所以它们已被用来防治植物病毒病害，将卫星RNA的cDNA转入植物所构建的抗病毒的转基因植物亦早已获得成功。三、类病毒1971年Diener首次报道，引起马铃薯纺锤形块茎病的病原体是一种低相对分子质量RNA，它没有蛋白质外壳，在其感染的植物组织中也未发现病毒样颗粒。这种小分子RNA能在敏感细胞内自我复制，并不需要辅助病毒。由于其结构和性质都与己知的病毒不同，故Diener等把它称做类病毒。迄今已鉴定的类病毒达20多种，根据它们是否含有中央保守区和核酶结构分为两个科，马铃薯纺锤形块茎类病毒科含中央保守区，不含核酶保守序列；而鳄梨白斑类病毒科没有中央保守区，但有核酶保守序列，能够自我切割。1．类病毒的分子结构类病毒为含246-375个核苷酸的单链环状RNA分子。所有的类病毒RNA均无mRNA活性，不能编码蛋白质。大多数类病毒RNA都呈高度碱基配对的双链区与单链环状区相间排列的杆状构型。各种类病毒之间序列有较大的同源性，有几种类病毒，如唇膏蔓蔷薇隐性类病毒等可能是相关的类病毒之间重组产生的嵌合分子。2．类病毒的复制由于类病毒RNA没有编码功能，其复制必然是完全利用宿主细胞酶，包括依赖DNA的RNA聚合酶II等。由于类病毒为环状单链RNA分子，对称或非对称的滚环复制机制均适合于类病毒（图7-15）。鳄梨白斑类病毒（Avocadesunblotchviriod，ASBVd）可能是利用对称的滚环复制方式复制，而马铃薯纺锤形块茎类病毒（Potatospindletuberviroid，PSTVd）及其相关的类病毒则可能是以非对称的滚环复制方式复制，即由滚环复制产生的多聚体负链RNA直接拷贝出多聚体正链RNA，然后经剪切环化，形成子代类病毒。3．类病毒的致病性类病毒的致病性与其RNA内部的致病变结构城（P区）的序列与构型有关，不同的PSTVd分离株其P区几个碱基的变化，可分别引起宿主植物温和症状、严重症状和死亡。类病毒变异最为频繁的可变区（V区）亦与致病性有关。柑桔裂皮类病毒A株在番茄上引起严重的矮化及偏上生长，而其DE26株仅引起温和症状，二者仅有27个核苷酸的差别，其中大部分在P区和V区。但是，有些类病毒，如ASBVd并不存在明显的致病区，它们的致病机理还有待阐明。四、朊病毒朊肮病毒是一类能引起哺乳动物的亚急性海绵样脑病的病原因子，这些疾病包括人的库鲁病（Kuru）、克雅氏病（Creutsfeldt-Jakobdisease，CJD）、格-史氏综合症（Gerstmann-Strausslersyndrome，GSS）和致死性家族失眼病（fatalfamilialinsomnia，FFI），发生于动物中的羊搔痒症、貂的传染性脑病、黑尾鹿与糜鹿的慢性消耗病以及牛海绵状脑病。由于这类病原因子能引起人与动物的致死性中枢神经系统疾病，并且它们具有不同于病毒的生物学性质和理化性质，故一直引起人们的极大的兴趣，并以羊搔痒病为模型进行了大量的研究。1．朊病毒的理化性质羊搔痒病因子无免疫原性；对紫外线、辐射、非离子型去污剂、蛋白酶等能使病毒灭活的理化因子有较强的抗性；高温、核酸酶，如羟胺、亚硝酸之类的核酸变性剂都不能破坏其感染性；SDS、尿素、苯酚之类的蛋白质变性剂都能使之失活。由于迄今未能证明它含有核酸，故多数人认为羊搔痒病因子的化学本质是蛋白质。Prusiner（1982）提出它们是一种蛋白质侵染颗粒，并将之称做Prion或Virino，即朊病毒。2．朊病毒的结构从羊搔痒病因子实验感染的仓鼠脑组织中分离到一种相对分子质量为2.7×10’4-3.0×10’4的蛋白质。由于这种蛋白质可与搔痒病因子共纯化；其浓度与搔痒病因子的传染性正相关；这种蛋白纯化后具有传染性；并且其感染性可被中和抗体中和，故将这种蛋白称做朊病毒蛋白（Prionprotein，PrP）。由于该蛋白来源于羊搔痒病，故以PrPsc表示。根据PrPsc的氨基末端的序列合成寡核苷酸探针进行检测的结果发现，在正常的人和动物的细胞DNA中有编码PrP的基因，且无论感染搔痒病因子与否，宿主细胞PrPmRNA水平无变化，说明PrP是细胞组成型基因表达的产物。这种细胞的PrP称做PrPc，为相对分子质量3.3×10’4-3.5×10’4的膜糖蛋白。正常细胞表达的PrPc与羊搔痒病的PrPsc为同分异构体。它们的一级结构相同，但PrPc具有43％的α螺旋和3％的β折叠，PrPsc约有34％的α螺旋和43％的β折叠。多个β折叠使PrPsc溶解度降低，对蛋白酶抗性增强。关于PrPsc的来源，Prusiner等认为，PrPsc来源于PrPc，并且PrPsc的形成是翻译后的加工过程，而不是蛋白内共价键的修饰。3．朊病毒的增殖关于PrPc如何转变为PrPsc尚待阐明。有人认为PrPsc进入细胞后与PrPc结合，形成PrPsc-PrPc复合体，导致PrPc构型发生改变，转变为PrPsc，这样产生的两个PrPsc分子，再分别与PrPc分子结合，产生4个PrPsc。如此周而复始，导致PrPsc数目呈指数增加。朊病毒的研究已取得很大进展，大量证据都支持Prusiner等提出的朊病毒仅由蛋白质组成，且系由细胞蛋白PrPc经翻译后修饰而转变为折叠异常的病理形态PrPsc这一假说。但迄今为止仍有人认为朊病毒含有很少量的核酸，所以对朊病毒的本质，朊病毒的繁殖，朊病毒的传播方式及其致病机理等问题还有待进一步阐明。小结病毒是一类结构极其简单，具有特殊的繁殖方式的绝对细胞内寄生物。病毒具有细胞外相和细胞内相两种生命形态，前者以感染性毒粒形态存在，后者以繁殖性基因形式存在。毒粒具有确定的形态结构、生物学特性和理化性质。毒粒的基本结构是核壳，壳体的基本对称形式是螺旋对称和二十面体对称，有的病毒核壳外还有包膜。毒粒的基本化学组成是核酸和蛋白质。核酸是病毒的遗传物质，病毒基因组核酸有dsDNA、ssDNA、dsRNA和ssRNA四种基本类型，病毒DNA基因组有线状形式和环状形式，单链RNA基因组有正意和负意之分。构成毒粒的病毒结构蛋白分为壳体蛋白、包膜蛋白和毒粒酶，它们各具不同的功能。病毒的非增殖性感染有流产感染、限制性感染和潜伏感染三种类型，病毒的繁殖是以复制方式进行。病毒的复制循环包括吸附、侵人、脱壳、病毒大分子的合成和装配与释放等阶段。不同病毒的毒粒形态结构、基因组核酸类型和结构特征各不相同，因此它们各具不同的复制策赂。病毒感染非允许细胞或者缺损病毒感染允许细胞和非允许细胞都可能导致非增殖性感染发生。病毒感染宿主细胞，通过病毒与宿主的相互作用，一方面病毒得以繁衍、进化，另一方面病毒给宿主细胞和机体带来种种不同的影响，这些影响不仅具有重要的生物学意义，而且可能具有重要的医学意义或经济意义。包括卫星因子（卫星病毒和卫星RNA）、类病毒和朊病毒在内的亚病毒因子是—些比经典意义病毒更为简单的病原因子。亚病毒具有许多不同于病毒的特征，亚病毒研究不仅扩展了病毒学研究范围，而且可能更新病毒的定义，深化人们对病毒的起源与进化，乃至生命本质的认识。思考题1．病毒区别于其他生物的特点是什么？根据你的理解，病毒应如何定义？2．病毒的分类原则和病毒命名规则最主要包括哪些？3．病毒学研究的基本方法有哪些，这些方法的基本原理分别是什么？4．病毒壳体结构有哪几种对称形式？毒粒的主要结构类型有哪些？5．病毒核酸有哪些类型和结构特征？各类病毒基因组的复制策略有何区别？6．病毒复制循环可分为哪几个阶段？各个阶段的主要过程如何？7．病毒的非增殖性感染有哪几类？引起病毒非增殖性感染的原因是什么？8．噬菌体是如何感染宿主细胞的，叙述它与宿主细胞间的相互关系。9．某发酵工厂生产菌株经常因噬菌体“感染”而不能正常生产，在排除了外部感染的可能性后有人认为是由于溶源性菌裂解所致，你的看法如何？并请设计一实验证明。10．亚病毒有哪几类？各自有何特点？11．查阅有关文献资料，结合本节所进述的有关内容，写一篇短文论述病毒感染与细胞凋亡的关系。