基因工程实验指导

基因工程实验指导 （本科生，研究生试用） 谭志远 郭海滨 彭桂香编写 华南农业大学 2005 年 8 月 1 本实验课程是以基因工程基本操作为主线，强调实验方法 的经典性、实用性。实验内容涉及了基因工程的主要过程，以含 Amp＋抗性的质粒 pUC18 为载体，含 GFP（green fluorescent protein）基因的 Amp＋和 Kan＋双抗性的质粒 TOPOGFP 为基因 供体，宿主菌均为 DH5α。经碱法抽提后得到质粒 DNA pUC18 和基因供体质粒 TOPOGFP，分别对其进行浓度及纯度的测定 后。用 EcoR I 酶切 pUC18 为载体，以 TOPOGFP 质粒为模板， 用含 EcoR I 酶切位点的引物扩增 GFP 基因。纯化 EcoR I 酶切 载体 pUC18 和回收 PCR 产物 GFP 基因片段，将载体 pUC18 与 GFP 基因连接，然后进行转化得到重组子，用碱法快速鉴定 重组子。整个实验基本上是一个连续的过程，通过学习， 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 学 生能在原有的相关理论知识基础上，较全面和深入理解基因工程 原理、基本掌握基因工程常用的实验方法，以求为以后的学习和 科研工作打下良好和扎实的基础。此外本课程还兼顾了克隆和诱 导绿色荧光蛋白（GFP）基因，观察外源 DNA 在原核生物中的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达。 2 目 录 基因工程实验注意事项 ............................................................................1 实验 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 参考图 ........................................................................................2 实验一 碱法抽提质粒 DNA...................................................................3 实验二 DNA 电泳检测...........................................................................7 实验三 分光光度计测定 DNA 浓度、纯度及酶切 .......................... 10 实验四 目的基因片段回收与载体连接 ............................................. 13 实验五 感受态细胞制备 ..................................................................... 16 实验六 细菌转化 ................................................................................. 20 实验七 转化克隆的筛选和鉴定 ......................................................... 22 实验八 目的基因在原核细胞中表达 ................................................. 25 实验九 SDS-PAGE 检测表达蛋白..................................................... 26 附录 1：质粒载体 pUC18 的相关资料： ............................................ 30 附录 2：质粒载体 TOPO 相关资料： ................................................. 32 附录 3：Lambda DNA/ PstI Marker................................................... 33 1 基因工程实验注意事项 1. 上实验课的学生每 4 人为一个大组，2 人分为一个小组。 2. 课前要提前预习实验内容，弄懂实验设计的原理，理清实验顺序。 3. 实验课不得无故缺席、迟到或早退。非课表规定的实验时间，应按任课老师 的安排，准时来进行操作。 4. 实验课时，应自觉遵守课堂纪律，保持实验室的安静与清洁卫生，不得大声 谈笑，不得抽烟、随地乱扔纸屑、吐痰等。 5. 实验前清点好仪器、用具与试剂，实验台面应随时保持整洁，仪器、药品摆 放整齐。共用试剂使用完毕，应立即盖严放回原处。勿使试剂、药品洒在实 验台面和地面上。 6. 实验中应严格遵守操作规程进行实验，对任何自己不熟悉的实验仪器都不要 随意操作（尤其是微量移液器！）。在操作的过程中发现任何意外的现象都要 及时向任课教师汇报。细心观察实验现象，并如实记录实验结果。每个实验 完成后，要写实验 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 。 7. 严禁随意动用非当天实验所需使用的仪器和物品，使用仪器应严格按仪器使 用的程序进行，贵重仪器需在任课老师的指导下进行操作。实验过程中如仪 器出现故障，应及时向任课老师汇报情况，如违反使用规定造成的损坏，使 用者将负责修理与赔偿。 8. 使用仪器、药品、试剂和各种其它物品需注意节约。洗涤和使用仪器时，应 小心仔细，防止损坏仪器。 9. 废液可倒入水槽中，同时放水冲走，强酸、强碱等腐蚀性液体，应先用水稀 释后，方可倒入水槽内，并放水冲走。废纸等其它固体废物，不得倒入水槽， 应倒入废物桶内。特别注意对废弃细菌的杀灭和有毒垃圾的定点投放。 10. 实验结束后应清洗好当天所用的器皿和用具，整理好仪器与实验台面，经任 课教师同意方可离开。 11. 值日组的同学最后离开，等待清扫实验室的卫生，关闭门窗水电。经任课教 师检查同意后方可离开。 2 实验流程参考图 （4人，大组） （2人，小组1） （2人，小组2） pUC18 TOPOGFP 实验一 碱法抽提质粒DNA pUC18 TOPOGFP 实验二，三 DNA电泳、分光光度计测定 DNA浓度、纯度及酶切 实验四 目的基因片段回收与载体连接 pUC18+GFP GFP+pUC18 pUC18 GFP by PCR pUC18+GFP+DH5α GFP+pUC18+DH5α 实验五 感受态细胞制备（教师准备） 实验六 细菌转化 蓝、白斑筛选 蓝、白斑筛选 实验七 转化克隆的筛选和鉴定 绿色荧光蛋白基因（GFP） 绿色荧光蛋白基因（GFP） 实验八 目的基因在原核细胞中表达 SDS-PAGE SDS-PAGE 实验九 SDS-PAGE检测表达蛋白（暂不做） 3 实验一 碱法抽提质粒 DNA 1．目的：学会最常用的小量制备质粒 DNA 的碱裂解方法。 2． 原理：利用一定浓度葡萄糖使大肠杆菌细胞充分悬浮，而不会快速沉积到管子的底部， 再加入 NaOH 使大肠杆菌细胞壁裂解释放出质粒 DNA。加入 SDS 及 pH 4.8 的乙酸钾高 盐缓冲液中和并使染色体 DNA 与蛋白质共沉淀，经过离心，蛋白质和大分子 RNA 一起 沉淀下去。用酚/氯仿处理，可去除残留蛋白质; 加入 RNase A 可消除 RNA。 各试剂的具体作用如下： 任何生物化学反应，需要控制好溶液的pH，因此用适当浓度的和适当pH值的Tris-Cl 溶液。50 mmol/L 葡萄糖主要使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。因此， 如果溶液 I 中缺了葡萄糖其实对质粒的抽提本身而言，影响不大（但菌体一定要悬浮均 匀，不能有结块）。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，主要作用是抑制DNase 的活性。在溶液 I 中加入高达 10 mmol/L 的 EDTA，是将大肠杆菌细胞中的所有二价金 属离子都螯合掉。溶液 II 要用新鲜的 0.4 N 的 NaOH 和 2％的 SDS 等体积混合后使用。 主要是为了保证 NaOH 没有吸收空气中的 CO2而减弱了碱性。破细胞壁的主要是碱，而 不是 SDS，所以才叫碱法抽提。事实上 NaOH 是最佳的溶解细胞的试剂，不管是大肠杆 菌还是哺乳动物细胞，碰到了碱都会几乎在瞬间就溶解，这是由于细胞膜发生了从 bilayer（双层膜）结构向 micelle（微囊）结构的相变化所导致。用了不新鲜的 0.4 N NaOH， 即便是有 SDS 也无法有效溶解大肠杆菌，就很难高效率抽提得到质粒。这一步要记住两 点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组 DNA 片断会慢慢断裂；第 二，必须温柔混合，不然基因组 DNA 也会断裂。溶液 III 加入后的沉淀是钾离子置换了 SDS 中的钠离子形成了不溶性的十二烷基硫酸钾（potassium dodecylsulfate, PDS），而高 浓度的盐，使得沉淀更完全。SDS 较易和蛋白质结合，平均两个氨基酸上结合一个 SDS 分子，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基 因组 DNA 也一起被共沉淀了。这个过程不难想象，因为基因组 DNA 太长了，长长的 DNA 自然容易被 PDS 给共沉淀了，尽管 SDS 并不与 DNA 分子结合。其中加入 2 mol/L 的醋酸是为了中和 NaOH，因为长时间的碱性条件会打断 DNA，所以要中和之。基因组 DNA 一旦发生断裂，只要是 50－100 kb 大小的片断，就没有办法再被 PDS 共沉淀了。 所以碱处理的时间要短，而且不得激烈振荡，不然最后得到的质粒上总会有大量的基因 4 组 DNA 混入。溶液 III 加入并混合均匀后在冰上放置，目的是为了 PDS 沉淀更充分一 点。 不要以为 PDS 沉淀的形成就能将所有的蛋白质沉淀了，其实还有很多蛋白质不能 被沉淀，因此要用酚/氯仿/异戊醇进行抽提，然后进行酒精沉淀才能得到质量稳定的质 粒 DNA，不然时间一长就会因为混入的 DNase 而发生降解。酚（Phenol）对蛋白质的 变性作用远大于氯仿，按道理应该用酚来最大程度将蛋白质抽提掉，但是水饱和酚的比 重略比水重，碰到高浓度的盐溶液（比如 4 mol/L 的异硫氰酸胍），离心后酚相会跑到上 层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层， 方便水相的回收；还有一点，酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后会有大量的 酚溶解到水相中，而酚会抑制很多酶反应（比如限制性酶切反应），应此如果单独用酚 抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到 水相中的酚则少得多，微量的酚在乙醇沉淀时就会被除干净而不必担心酶切等反应不能 正常进行。至于异戊醇的添加，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，也 方便了水相的回收。回收后的水相含有足够多的盐，因此只要加入 2 倍体积的乙醇，在 室温放置几分钟后离心就可以将质粒 DNA 沉淀出来。高浓度的盐会水合大量的水分子， 因此 DNA 分子之间就容易形成氢键而发生沉淀。如果感觉发生了盐的沉淀，就用 70％ 的乙醇多洗几次，每次在室温放置一个小时以上，并将沉淀打碎，就能得到好的样品。 得到的质粒样品一般用含 RNase（50 μg/mL）的 TE 缓冲液进行溶解，不然大量未降解 的 RNA 会干扰电泳结果的。琼脂糖电泳进行鉴定质粒 DNA 时，多数情况下你能看到 三条带，有人认为是超螺旋、线性和开环这三条带(超螺旋>线性>开环)。碱法抽提得到 质粒样品中不含线性 DNA，可用 EcoR I 消化质粒后再进行琼脂糖电泳，就会看到线性 质粒 DNA 的位置与这三条带的位置不一样。其实这三条带以电泳速度的快慢而排序， 分别是超螺旋、开环和复制中间体（即没有复制完全的两个质粒连在了一起）。如果你 不小心在溶液 II 加入后过度振荡，会有第四条带，这条带泳动得较慢，远离这三条带， 是 20-100 kb 的大肠杆菌基因组 DNA 的片断。 非常偶然的是，有时候抽提到的质粒会 有 7－10 条带，这是由于特殊的 DNA 序列导致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈数不 同）所致。 3． 器材 超净工作台，接种环，酒精灯，台式离心机，旋涡混合器，微量移液取样器（20 μL， 100 μL，1000 μL），1.5 mL 微量离心管，恒温摇床，摇菌试管，双面微量离心管架， 试管架，标签纸，磁力搅拌机。 5 4． 试剂 LB 培养基 1000 mL（含 100 μg/mL 氨苄青霉素），葡萄糖/Tris/EDTA(GTE)溶液（溶液 I）， NaOH/SDS 溶液(溶液 II)，KAc 溶液（pH4.8）(溶液 III)，RNase A，95%乙醇，70%乙 醇，TE buffer（pH8.0）。DH5α质粒载体菌（带 GFP 基因）。 5． 实验准备 氨苄青霉素储存液（无菌水配制 50 mg/ml，分装后-20°C 保存），配制 LB 培养基（胰化 蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 5 g 加 200 mL 去离子水搅拌完全溶解，用约 200μL 5 N NaOH 调 pH 至 7.0，加去离子水至 1 L，121°C 20min 灭菌）；溶液 I（50 mmol/L 葡 萄糖，25 mmol/L Tris HCl pH 8.0，10mmol/L EDTA，pH 8.0）；溶液 II（0.2 mol/L NaOH， 1% SDS）；溶液 III（60 ml 5 mol/L KAc，加冰乙酸 11.5 ml，补去离子水至 28.5 ml）， 70%乙醇（-20°C 保存），TE buffer（10 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，1 mmol/L EDTA pH 8.0）； 10 mg /ml RNase A（RNA 酶 A 溶于 TE buffer 中）；摇菌试管洗净并盖上棉花塞、1.5 ml 离心管装入铝制饭盒、移液器吸头装入相应的吸头盒，一起高压灭菌（121°C，30min）。 6． 操作步骤 细菌培养（可由老师预备完成）： （1） 配制 LB 液体和固体培养基，并高压灭菌。 （2） 从超低温冰箱中取出保存带 GFP 基因的载体菌（操作完后迅速把菌种放回超低 温冰柜中），在超净工作台上用烧红后冷却的接种环刮一下，再把接种环于 LB 固体平板（含 100 μg/ml 氨苄青霉素）划线，37°C 培养 18－20 h。 （3） 在超净工作台中从平板上挑一单菌落，接种于 5 ml LB＋Amp+的灭菌试管中， 37°C 摇床培养 18－20 h。如需大量提取，可挑取单菌落于 50 ml LB＋Amp+的三 角瓶中，37°C 摇床培养 18－20 h。 DNA 提取（质粒 pUC18, TOPOGFP）： 1) 取 1.4 ml 的菌液于 1.5 ml 离心管中，7000 rpm 离心 2 min（如使用冷冻离心机，可 设为 4°C 预冷），弃上清液（尽量弃干净），留沉淀备用。如想多提取一些 DNA， 再吸取 1.4 ml 菌液至同一离心管中，离心，弃上清液。 2) 在沉淀中加入 100 μl 溶液 I，盖上盖后立即在涡旋混合器上混匀。 3) 加入 200 μl 溶液 II，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中（预先取一个泡沫塑 料盒，装上适量的冰块），放置 5 min。 4) 加入 150 μl 溶液 III，盖上盖后上下颠倒几次混匀，插入冰中，放置 5 min。 6 5) 14000 rpm 离心 5 min，小心吸取上清液（约 450 μl）于另一个干净的 1.5 ml 离心管 中（不要将白色沉淀物带入！）。 6) 加入 450 μl 酚/氯仿溶液，盖上盖后缓慢摇动混匀，14000 rpm 离心 5 min，小心吸 取上清液（约 450 μl）于另一个干净的 1.5 ml 离心管中（不要将白色沉淀物带入！）。 7) 加入 800 μl 95% 乙醇，盖上盖后缓慢摇动混匀，室温下静置 5 min。 8) 14000 rpm 离心 10 min，小心弃掉上清液，加入 500 μl 70% 乙醇，盖上盖后立即在 涡旋混合器上混匀。15000 rpm 离心 10 min，小心弃掉上清液，尽量倒置弃干净 9) 离心管倒置于 37°C 培养箱中（或室温）空气干燥。（管底的沉淀质粒 DNA 用肉眼 几乎看不见！）。 10) 加入 40 μl 无菌蒸馏水+RNaes A (1 ml 无菌蒸馏水+0.5 μl Rnaes A 混合)。用记号笔 标记后放入冰箱中备用。 11) 在剩余的菌液中倒入少许消毒液，待溶液变清亮后随废液和剩余的冰块一起倒入下 水池。清理桌面，清洗仪器， 12) 撰写实验报告 7. 注意事项 ¾ 无菌操作台使用前，开紫外灯灭菌，开紫外灯时勿开鼓风装置。 ¾ 对抗菌素不能用高温灭菌，需待培养基灭菌后冷却 60°C 的时候再加入。 ¾ 为避免细菌污染环境，多余的菌液经煮沸杀灭后方可倒入洗涤槽。 ¾ 加入溶液Ⅱ、溶液Ⅲ摇匀时一定要温和，不能剧烈摇动。 ¾ 在酚/氯仿萃取后，吸取上清液时，应注意勿将下层酚/氯吸入以免带入杂质；但也 不要留下太多上清液，使 DNA 损失较多。 7 实验二 DNA 电泳检测 1．目的 学会常用琼脂糖凝胶电泳分离 DNA 的原理和方法，检测质粒 DNA 的浓度与分子量。 2．原理 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，由两个半乳糖组成的双糖。沸水中溶解，45℃以下 开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。DNA 双螺旋分子骨 架两侧带有含负电荷的磷酸根，在电场中会向正极方向移动。不同长度的 DNA 由于受 到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳 动时，有电荷效应与分子筛效应。琼脂糖凝胶电泳法分离 DNA，主要是利用分子筛效 应，迁移速度与分子量的对数值成反比关系。不同 DNA，其分子量大小及构型不同， 电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。溴化乙锭（EB）为扁平状分子，可渗 入到 DNA 双螺旋结构中, 与 DNA 分子形成 EB-DNA 复合物，在紫外光照射下发射荧 光。发射的荧光强度较游离状态 EB 发射的荧光强度大 10 倍以上，且荧光强度与 DNA 的含量成正比。电泳后的琼脂糖凝胶直接在紫外灯下拍照，只需 5～10 ng DNA，就可 以从照片上比较鉴别。如肉眼观察，可检测 0.05 μg～0.1 μg 的 DNA。质粒 DNA 有环 状超螺旋、开环和线性三种构型，电泳时其迁移率各不同（超螺旋>线性>开环）。 3．仪器 电泳仪，水平凝胶电泳槽和梳子及其制胶模块，250 ml 三角瓶，微波炉，台式离心机， 旋涡混合器，凝胶成像系统，微量移液取样器，1.5 ml 离心管，双面微量离心管架，试 管架等。 4．试剂 上次提取的质粒 DNA，TAE 电泳缓冲液，1000×溴化乙锭储存液，电泳级琼脂糖粉， 10 × loading buffer（加样缓冲液或6×加样缓冲液）， DNA分子量标准（λDNA/Pst I: 11501, 5077, 4749, 4507, 2838, 2556, 2459, 2443, 2140, 1986, 1700, 1159, 1093, 805, 514, 468, 448, 339, 264, 247, 216, 211, 200, 164, 150, 94, 87, 72, 15 bp）。 5．实验准备 配制 TAE 电泳缓冲液（50×储存液，pH 约 8.5：Tris 碱 242g，57.1ml 冰乙酸，37.2g Na2EDTA·2H2O，双蒸水定容至 1L），1000×溴化乙锭储存液（0.5 mg/ml：50 mg 溴化乙 锭溶于 100 ml 双蒸水，4°C 避光储存），10×加样缓冲液（20% Ficoll 400，0.1mol/L 8 Na2EDTA pH8.0，1.0% SDS，0.25%溴酚蓝）；6×加样缓冲液（0.25%溴酚蓝，40%蔗糖 水溶液）；1.5 ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）。 6．操作步骤 （1） 称取 0.5 g 琼脂糖粉，放入三角瓶，加入 50 ml 1×TAE 电泳缓冲液，放入微波炉 中加热至琼脂糖完全溶解（约 1 min）。50 ml 正好倒两块小胶。 （2） 注意观察琼脂糖的溶解，不时取出小心旋转摇动，待琼脂糖完全熔化后停止微波 炉（切不可让胶溶液溢出到微波炉中！）。 （3） 戴上布手套，从微波炉中取出三角瓶，置桌面上冷却致不烫手（约 50-60°C）。 若要快速冷却，可将三角瓶放入冷水中轻轻摇动冷却。（可以加入 0.5 mg/ml 的 溴化乙锭 50 μl，终浓度为 0.5 μg/ml）。 （4） 把梳子插到凝胶灌制模具的正确位置后缓缓倒入胶溶液。胶溶液倒至与模具的矮 边缘相平即可（胶厚 4-6 mm），不要把胶溶液溢到外面。在桌面上静置 10-20 分 钟待胶完全凝固。（剩下的胶溶液封口后留待以后再熔化使用）。 （5） 在水平电泳槽中加满 1×TAE 电泳缓冲液。根据电泳槽的长度把电泳仪的电压调 至 100 V (3-5 V/cm)，注意正负电极的位置连接正确。 （6） 待胶完全凝固后（15-20 分钟），小心拔出梳子。用手指捏住模具两侧的高边缘取 出模具和凝胶放入电泳槽中间的平台上，加电泳缓冲液至液面覆盖凝胶 1~2 mm。 凝胶上有样品孔的一侧要朝向电泳槽的负极。 （7） 剪 1 片光面纸（或封口膜），点 6 μl 蒸馏水、1 μl 10×加样缓冲液，再加入 3 μl 质粒 DNA 溶液制成 10 μl DNA 样品。 （8） 在凝胶上选择相邻的加样孔。用 10 μl 的吸液头分别将管中的样品加入凝胶的加 样孔中（如果需要时，在相邻的加样孔中加入 2-5 μl DNA分子量标准物 λDNA/Pst I）。加样时持移液器的手以肘部固定在桌上，用另一只手扶住这只手的手腕，以 减少移液器的抖动。看到蓝色的样品吸管尖头伸进加样孔后（不能伸得太深，以 免穿破凝胶的底部）缓缓将蓝色样品压入加样孔中。切不可使蓝色样品流到孔外。 （9） 打开电源开关，样品将形成一条蓝色的横带向前(正极)移动（如果发现蓝色向后 〔负极〕移动，立即关闭电源，调换电极）。电泳将进行约 30 min。 （10） 当蓝色的溴酚蓝迁移到距凝胶边缘 1 cm 时，关闭电源。取出模具和凝胶。（把凝 胶小心反扣放入盛有 EB 的搪瓷盒中。放置约 10 分钟后，取出用自来冲洗两次）。 （11） 将电泳好的凝胶置于紫外投射检测仪（或凝胶成像系统中）拍照。带上防护观察 9 罩，打开紫外灯，可见到橙红色核酸条带，根据各带粗细和荧光强度，可粗略估 计该样品 DNA 的浓度。同时根据已知分子量的标准 DNA，通过线性 DNA 条带 的相对位置初步估计样品的分子量。 （12） 清理垃圾。染有 EB 的凝胶要放到专用的垃圾袋中作专门处理，以免污染环境。 （13） 撰写实验报告。 7．注意事项 ¾ 用微波炉煮胶时，胶液的量不应超过三角瓶容量的 1/3，沸腾 2-3 秒就要停止加热， 否则易溢出。 ¾ 倒胶注意厚度（4~6mm），充分凝固后再拔出梳子，以保持齿孔形状完好，也可待 胶稍凝固后，放入 4℃冰箱 10 多分钟，以加速胶的凝固。 ¾ 加样前赶走点样孔中的气泡，点样时吸管头垂直，且勿碰坏凝胶孔壁，以免使带型 不整齐。 ¾ 一般情况下不必每点一个样品都换枪头，吸电泳缓冲液洗几次即可再点下一个样 品。 ¾ 凝胶中含有 EB，且勿直接用手接触胶，废弃胶应集中处理，无乱丢。 10 实验三 分光光度计测定 DNA 浓度、纯度及酶切 1．目的 学习利用紫外分光光度计测定 DNA 溶液浓度、纯度及利用限制性内切酶切割供体和载 体 DNA，为下一步 DNA 连接作准备。 2．原理 DNA 吸收光谱峰在 260 nm 处，据计算，测定此波长下 DNA 溶液的 OD 值，当 OD260=1 时，双链 DNA 含量约为 50 μg/ml，单链 DNA 与 RNA 含量为 40 μg/ml，寡核甘酸的含 量为 33 μg/ml，据此可用紫外分光光度计测定溶液中 DNA 含量。由于蛋白质的吸收峰 在 280 nm 处，在测定 DNA 含量时，还常计算 OD260/ OD280 之值，如该值为 1.8~2.0 时， 认为已达到较高的纯度，如低于此值，表明其内含杂质较多，可能影响酶切反应。纯净 RNA A260/A280 的比值约为 2.0。 A260 读数值×50×稀释倍数 DNA 浓度（μg/μ1）= —————————————— 1000 目前已发现三类不同的限制性内切酶即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。其中 II 型限制性内切酶能 识别双链 DNA 内部的特殊序列并在识别位点处将双链切断，形成粘性末端或齐平末端， 通过电用酶切后的 DNA 混合物能够确认和分离酶切片段。 EcoR I 识别序列： 5′-G↓AATTC-3′ 3′-CTTAA↑G-5′ 酶切反应需 Mg2+及其它一些辅助离子和一定的盐离子浓度，不同内切酶对盐离子有不 同的要求，如盐离子浓度使用不当或甘油含量过高（>5%），会使酶的识别位点发生改 变，产生星活性（star activity）。绝大多数酶的反应温度 37℃，也有个别要求在 50~65 ℃。 3．器材 Eppendorf 分光光度计，恒温培养旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5 ml 微量离心管，双面微量离心管架，水漂，恒温水浴。 4．试剂 供体质粒（TOPOGFP）、载体质粒（pUC18），EcoR I，内切酶缓冲液（10×buffer） 5．实验准备 配制 TAE 电泳缓冲液（50×储存液），1000×溴化乙锭储存液（0.5 mg/ml），10× 加样缓 11 冲液，1.5 ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌） 6．操作步骤 DNA 浓度纯度的测定： 取实验一的 DNA 1.0 μl（约 50~100 ng）至一干净的离心管，加入 99.0 μl 蒸馏水稀释。 先加 50 μl 蒸馏水至比色杯，进行紫外光空白测定，然后弃掉蒸馏水，加入 50 μl 已稀 释的 DNA 溶液，测定 260 nm 及 280 nm 的光吸收值（OD260 及 OD280），计算 OD260/ OD280 比值及 DNA 浓度并记录。 质粒 DNA 酶切（第 1 小组）： (1) 在冰浴中混合下列溶液于一个无菌的 1.5 ml 微量离心管中： 质粒 DNA （pUC18） 30 μL 10×酶切缓冲液（用 EcoR I 的缓冲液） 4 μL 10×BSA 4 μL EcoR I 2 μL 总体积 40 μL （2）先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即插入冰 块中。 （3）用一只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部（以免手指的给酶液加温），另一只手 持微量移液器，小心翼翼地吸取 2 μL 限制性内切酶。 （4）在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（立即把内切酶原液送回冰柜！），轻轻震动 微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机中 1000 rpm 离心 10 秒。取出后插到水漂的 孔中，在推荐的最适酶切温度水浴中温育 1-3 h（一般是 37℃）。然后放入-20℃保存待 用（见实验四：目的基因片段回收与载体连接）。 （4） 清理桌面垃圾，清洗实验仪器。撰写实验报告。 GFP 基因的 PCR 扩增（第 2 小组）： （1） 在冰浴中混合下列溶液于一个无菌的 1.5 ml 微量离心管中： 无菌双蒸水 41.5 μL 10×PCR 缓冲液 5.0 μL 正向引物 GFP1star（50 μM） 0.5 μL 反向引物 GFP1rev（50 μM） 0.5 μL 10 mM dNTPS 0.5 μL 质粒 DNA （TOPOGFP） 0.5 μL Taq polymerase (1 U/μL) 1.5 μL 总体积 50 μL （2） 设计 PCR 反应程序： 12 97°C，预变性 3 min 95°C，变性 50 sec 60°C，复性 50 sec 30 次循环 72°C，延伸 50 sec 72°C，延伸 5 min 4°C，保存备用。 （3） 取 5 μL PCR 产物＋1 μL 10×上样缓冲液，在 1％琼脂糖电泳，检测 PCR 产物的 有无，浓度和大小。 （4） 在 PCR 产物中加入 3M NaAC 5 μL，100 μL 无水乙醇，－20°C 静置 10 min, 14000 rpm 离心 10 min，弃上清，沉淀中加入 70％乙醇 100 μL，混匀，14000 rpm 离 心 10 min，弃上清，风干。 （5） 沉淀中加入 20 μL 无菌双蒸水溶解。 （6） 在冰浴中混合下列溶液于一个无菌的 1.5 ml 微量离心管中： PCR 产物 DNA （GFP 基因） 15 μL 10×酶切缓冲液（用 EcoR I 的缓冲液） 2 μL 10×BSA 2 μL EcoR I 1 μL 总体积 20 μL （7） 先准备一个冰盒并放入一定量的冰块。从-20℃冰柜中取出限制性内切酶，立即 插入冰块中。 （8） 用一只手的手指捏在盛放酶的微量离心管的上部（以免手指的给酶液加温），另 一只手持微量移液器，小心翼翼地吸取 1 μL 限制性内切酶。 （9） 在酶切样品混合液中加入限制性内切酶后（立即把内切酶原液送回冰柜！），轻 轻震动微量离心管使管中的溶液混匀。再在离心机中 1000 rpm 离心 10 秒。取出 后插到水漂的孔中，在推荐的最适酶切温度水浴中温育 1-3 h（一般是 37℃）。 然后 65℃ 10 min, 再放入-20℃保存待用（见实验四：目的基因片段回收与载体 连接）。 7．注意事项： ¾ 酶切的 DNA 应具备一定的纯度，其中不能含迹量的酚、氯仿、SDS 等。 ¾ 反应总体积中甘油的浓度要小于 5%，即内切酶的体积应小于 10%反应总体积（购来的 酶含 50%甘油）。 ¾ 内切酶从-20℃冰箱取出后，应放入冰浴中，在其它试剂加完后最后加。 ¾ 每次取酶必须使用新的灭菌吸管头，1 个吸管头不能反复使用，更不能交叉使用。 ¾ 注意混匀，可用手指轻弹管壁，是酶切体系所有成分混匀，然后短暂离心，是管壁液滴 沉入管底。 13 实验四 目的基因片段回收与载体连接 1．目的 通过本实验，学习掌握从琼脂糖凝胶电泳中回收 DNA 片段的一种方法。同时学习 DNA 片断体外连接技术。 2．原理 DNA 分子经限制性内切酶消化后，产生较小的片段，经过电泳后，按分子量大小 被分开，排列在琼脂糖凝胶中，可以将特定的某条 DNA 带所在的凝胶切下来，加热或 用特殊的试剂熔解凝胶，使 DNA 溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的 DNA 酶切片断。这些片段进一步作亚克隆，或用作探针。回收目的片段的方法有多种， 常用的有冻融法、低熔点琼脂糖法、电泳回收法、玻璃孔回收法、琼脂糖凝胶熔解等。 本实验采用特殊的试剂使琼脂糖凝胶熔解，酚/氯仿抽提，乙醇沉淀回收 DNA 片段。 DNA 连接酶催化两个双链 DNA 片段 5’端磷酸和 3’端羟基之间形成磷酸二酯键。 DNA 连接酶主要有：T4噬菌体 DNA 连接酶和大肠杆菌连接酶两种。T4DNA 连接酶的 底物可为：（1）一条链带有缺口的双链 DNA 分子；（2）两个存在互补粘性末端的双链 DNA 片段；（3）两个存在平末端的 DNA 片段；（4）RNA-DNA 杂合体中，具缺口的 RNA 和 DNA 分子。大肠杆菌 DNA 连接酶适当的底物质只是带有缺口的双链 DNA 分 子和具有同源互补粘性末端的不同DNA片段，它不能催化平末端DNA分子之间的连接。 T4DNA 连接酶催化 DNA 连接的反应分三步进行：（1）辅助因子 ATP 中磷酸基团与 T4DNA 连接酶上的 Leu 残基的 NH2 结合，形成酶-AMP 复合物；（2）酶-AMP 复合物活 化 DNA 链 5’端磷酸基团，形成磷酸-磷酸酯键；（3）DNA 链 3’端羟基活化与 5’端 磷酸根形成磷酸二酯键，释放 AMP，完成 DNA 链间的连接。 大肠杆菌 DNA 连接酶催化 DNA 分子连接的机制及反应过程大致与 T4DNA 连接酶 相同，只是辅助因子为 NAD+。 用于克隆的质粒载体在酶切成线状后，一般需用碱性磷酸酯酶（CIP 或 BAP）进行 去磷酸化处理，以防止载体自身环化，减少不含重组子的菌落产生。在 Mg2+和 ATP 存 在下，T4 DNA 连接酶能催化载体分子的粘性末端与外源 DNA 的相同粘性末端联接成重 组 DNA 分子。 3．器材 恒温水浴锅，低温恒温水浴锅，电泳仪，旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸 14 头，1.5 ml 微量离心管，双面微量离心管架，台式离心机，刀片，干式恒温气浴。 4．试剂 TOPOGFP 质粒载体，pUC18 酶切载体，GFP 插入片断，T4 DNA 连接酶，连接酶缓 冲液，0.8 %琼脂糖，10×TBE 电泳缓冲液，载样缓冲液，无菌蒸馏水。 5．实验准备 1.5 ml 离心管装入饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养基 （含 Amp）。 7． 操作步骤 （1） 用 1×TBE 配制 0.8%琼脂糖凝胶, 选用大型电泳槽及厚梳子，并在低电压下电泳以 提高分辨率。 （2） 在胶上选定两个加样孔，将实验三中-20°C 保存的酶切产物分别加入少量（6 μl） 和大量（34 μl ）DNA 酶切产物，电泳取少量（约 6 μL）与合适的已知分子量的 DNA 对比电泳，以确认切下的片断是否为自己想要的片断。 （3） 电泳结束后用刀片切下含有少量 DNA 酶切产物的泳道（一般选择位于凝胶的边 缘），EB 染色，在紫外灯下找到目的 DNA 带，用刀片切在带的下上下边缘各切 一个小口作为标记。注意：含有大量 DNA 酶切产物的凝胶既不用 EB 染色，也 不用紫外灯照射！ （4） 将做好标记的凝胶条与未染色的凝胶原位对齐，根据小胶条上的标记估计未染色 的大胶上 DNA 酶切产物的位置，用刀片切下大胶中 DNA 产物所在的凝胶（尽量 不要多余的凝胶），转移至一个称量过的干净的 1.5 ml 微量离心管中。再称量后 计算出胶的重量。 （5） 向切割下来的胶块中加入等体积的熔胶剂，65℃水浴 5-15 min 直到胶完全融化。 （6） 向离心管中加入等体积酚/氯仿，充分混匀。 （7） 吸上清液转入另一干净的 1.5 ml 离心管中，加入 2 倍体积的无水乙醇。 （8） －20℃静置 10 min，14000 rpm 离心 10 min，倒上清，沉淀风干。 （9） 加入 10-20 μL 双蒸水 （10） 可取 2 μl-5 μl 回收产物电泳，检测是否有目的 DNA 带。 15 载体连接： （11） 事先将干式恒温仪（或冰盒里的水）温度设定在 14～16°C。 （12） 取一个灭菌的 1.5 ml 微量离心管，加入： 5 μl PCR 产物酶切片断（GFP 基因）或琼脂糖回收 DNA 1 μl pUC 18 载体 0.5 μl T4 DNA 连接酶（1U/μL） 1 μl 连接酶缓冲液 2.5 μl 双蒸水 总量 10 μl 体系 （13） 述混合液轻轻震荡后再短暂离心，然后置于 14°C 水中保温过夜。 （14） 连接后的产物可以立即用来转化感受态细胞或置 4°C 冰箱备用。 （15） 清理桌面，撰写实验报告。 7．注意事项： ¾ 挖含目的 DNA 的凝胶时，尽量减少周围凝胶的带入。 ¾ 克隆用的载体质粒要求较高纯度，使之能用最少的酶和较短的反应时间达到完全的 切断。 ¾ 使用过量的内切酶或 CIP 以及过长时间的反应会使载体末端缺失，产生大量的假 阳性菌落（白色但没有插入子）。 ¾ 2. 使用 T4DNA 连接酶前，应看清楚生产厂家所使用的活性定义单位，以便采用合 适的酶浓度反应条件，不致造成不必要的浪费。 ¾ 3. 目的 DNA 片段与载体 DNA 之间的摩尔浓度比例一般是 3:1~1:1，并且使反映体 系中 DNA 的总末端浓度适于 DNA 分子之间连接，但又不易形成多分子连接的寡 聚物，造成片段多拷贝插入。 16 实验五 感受态细胞制备 1．目的 学会 CaCl2 法制备大肠杆菌感受态细胞。 2．原理 将处于对数生长期的细菌置入 0℃的 CaCl2 低渗溶液中，使细胞膨胀，同时 Ca2+使细胞 膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就 构成了大肠杆菌人工诱导的感受态；此时加入 DNA，Ca2+又与 DNA 结合形成抗脱氧核 糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上；经短暂 42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通 透性增加，DNA 分子便趁机进入细胞内。此外在上述转化过程中，Mg2+的存在对 DNA 的稳定性起很大的作用，MgCl2 与 CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有 独特的协同效应。1983 年，Hanahan 除了用 CaCl2和 MgCl2 处理细胞外，还设计了一套 用二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程 序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆菌、 葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。 3．器材 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，50 ml 微量离心管，1.5 ml 微量离心管， 双面微量离心管架，台式冷冻离心机，制冰机，恒温摇床，分光光度计，超净工作台， 恒温培养箱，摇菌试管，三角烧瓶，接种环。 4．试剂 E. coli DH5α， LB 培养基，0.1 mol/L CaCl2溶液，无菌双蒸水 5．实验准备 1.5 ml 离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；平板培养 基，LB 培养基（灭菌），冰冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液（灭菌），无菌双蒸水，摇菌试管 （灭菌），三角烧瓶（灭菌）。 6．操作步骤 (1) 取一支无菌的摇菌试管，在超净工作台中加入 2ml LB（不含抗菌素！）培养基。 (2) 从超低温冰柜中取出 DH5α 菌种，放置在冰上。在超净工作台中用烧红后冷却的接 种环插入冻结的菌中，然后接入含 2 ml LB 培养基的试管中，37℃摇床培养过夜。 17 (3) 取 0.5 ml 上述菌液转接到含有 50 ml LB 培养基的三角烧瓶中，37℃下 250 r/min 摇 床培养 2∼3h，测定 OD590 为 0.375（<0.4∼0.6，细胞数<108/mL，此为关键参数！）。 以下操作除离心外，都在超净工作台中进行。 (4) 将菌液分装到 1.5 ml 预冷无菌的聚丙烯离心管中，于冰上放置 10 min，然后于 4℃， 5000 rpm 离心 10 min。 (5) 将离心管倒置以倒尽上清液，加入 1 ml 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液，立即在涡旋 混合器上混匀，插入冰中放置 30 min。 (6) 4℃，5000 rpm 离心 10 min，弃上清液后，用 1 ml 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2 溶液垂悬， 插入冰中放置 30 min。 (7) 4℃，5000 rpm 离心 10 min，弃上清液后，用 200 μL 冰冷的 0.1 mol/L CaCl2溶液垂 悬，超净工作台中按每管 100 μL 分装到 1.5 mL 离心管中。可以直接用作转化实验， 或立即放入-80℃超低温冰柜中保藏（可存放数月）。 (8) 在被细菌污染的桌面上喷洒 70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。 7．注意事项： ¾ 菌体收集后，所有操作应在冰浴上完成。 附超感受态细胞制备：（The Inoue Method for Preparation and Transformation of Competent E. Coli: "Ultra-Competent" Cells ） This protocol reproducibly generates competent cultures of E. coli that yield 1 x 108 to 3 x 108 transformed colonies/mg of plasmid DNA. The protocol works optimally when the bacterial culture is grown at 18°C. If a suitable incubator is not available, a standard bacterial shaker can be set up in a 4°C cold room and regulated to 18°C. Media SOB medium for initial growth of culture SOB agar plates containing 20 mM MgSO4 and the appropriate antibiotic SOB medium, for growth of culture to be transformed SOC medium SOB deionized H2O, to 950 ml tryptone, 20 g yeast extract, 5 g NaCl, 0.5 g For solid medium, please see Media Containing Agar or Agarose. Shake until the solutes have dissolved. Add 10 ml of a 250 mM solution of KCl. (This solution is made by dissolving 1.86 g of KCl in 100 ml of deionized H2O.) Adjust the pH of the medium to 7.0 with 5 N NaOH (approx. 0.2 ml). Adjust the volume of the solution to 1 liter 18 with deionized H2O. Sterilize by autoclaving for 20 minutes at 15 psi (1.05 kg/cm 2) on liquid cycle. Just before use, add 5 ml of a sterile solution of 2 M MgCl2. (This solution is made by dissolving 19 g of MgCl2 in 90 ml of deionized H2O. Adjust the volume of the solution to 100 ml with deionized H2O and sterilize by autoclaving for 20 minutes at 15 psi [1.05 kg/cm2] on liquid cycle.) SOC deionized H2O, to 950 ml tryptone, 20 g yeast extract, 5 g NaCl, 0.5 g For solid medium, please see Media Containing Agar or Agarose. SOC medium is identical to SOB medium, except that it contains 20 mM glucose. After the SOB medium has been autoclaved, allow it to