CRISPR_Cas9介导的基因组定点编辑技术_方锐

CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术 * 方 锐 畅 飞 孙照霖 李 宁 孟庆勇 ** (中国农业大学农业生物技术国家重点，北京 100193) 摘要 Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas)9系统成功被改造为第三代人 工核酸内切酶，与锌指核酸内切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和类转录激活因子效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALEN)一样可用于各种复杂基因组的编辑．目前该技术成功应用于人类细胞、斑马鱼和小鼠以及细菌的 基因组精确修饰，修饰类型包括基因定点 InDel突变、基因定点敲入、两位点同时突变和小片段的缺失．由于其突变效率 高、制作简单及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具．本文从 CRISPR/Cas的研究历 史、分类、作用机理以及基因定点修饰应用等方面进行简单介绍，希望能够为在这一领域的科研工作者提供参考． 关键词 人工核酸内切酶，基因编辑，CRISPR，基因打靶，CRISPR/Cas 学科分类号 Q7 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2013.00215 生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biophysics 2013, 40(8): 691~702 www.pibb.ac.cn *现代农业产业技术体系建设专项资助项目 (CARS-37). **通讯联系人. Tel: 010-62731142, E-mail: qingyong.meng@gmail.com 收稿日期：2013-05-19，接受日期：2013-07-29 基因定点修饰是研究基因功能的重要手段之 一，也可被用于人类遗传性疾病的治疗，因此这类 技术成为现代分子生物学的研究热点．早期仅基于 同源重组的基因打靶技术效率极低，应用受到限 制．直到人工核酸内切酶(engineered endonuclease， EEN)出现，将这一现状彻底改变． 锌指核酸内切酶 (zinc finger endonuclease， ZFN)是第一代人工核酸内切酶．锌指是一类能够 结合 DNA的蛋白质，人类细胞的转录因子中大约 有一半含有锌指结构，ZFN是将锌指蛋白与核酸 内切酶 Fok玉融合形成的核酸内切酶[1]，利用它可 以在各种复杂基因组的特定位置制造 DNA的双链 切口． 到目前为止，ZFN已经成功应用于黑长尾 猴、大鼠、小鼠、中国仓鼠、斑马鱼、果蝇、海 胆、家蚕、拟南芥、烟草、玉米、猪、牛、人类 iPS细胞[2]．更令人振奋的是已经有用于治疗 HIV 的 ZFN(破坏人 CCR 基因表达)药物进入二期临床 试验[3]．但是，ZFN制备复杂，成本昂贵，而且其 技术专利被少数几家商业公司控制．很快，第二代 人工核酸酶———类转录激活因子效应物核酸酶 (transcription activator-like effector nuclease， TALEN)的出现在很大程度上替代了 ZFN．2009 年，科学家将一种水稻的致病菌(Xanthamonas)编码 的类转录激活因子效应物(transcription activator-like effector，TALE)与 DNA的碱基对应关系解密[4-6]． 2010年，首次报道 TALEN 蛋白在酵母中应用成 功[7]，之后，在植物、人类细胞、小鼠、斑马鱼、 猪、牛中得到迅速的应用 [8]．TALEN 可以和 ZFN 一样对复杂的基因组进行精细的修饰，同时其构建 较为简单，特异性更高，因此受到了科研工作者的 青睐．2012年，TALEN被《科学》(Science)杂志评 为十大科学突破之一[9]．无论是 ZFN还是 TALEN， 这两种人工核酸酶的原理是一样的，都是由 DNA 结合蛋白与核酸内切酶 Fok玉融合而成． 2013年 初，一种全新的人工核酸内切酶 clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/ CRISPR-associated(Cas)9出现，它主要是基于细菌 的一种获得性免疫系统改造而成，其特点是制作简 单、成本低、作用高效[10]．本文主要从 CRISPR研 究历史、作用机理以及 CRISPR/Cas在定点修饰中 的应用等方面介绍 CRISPR/Cas9的研究进展． 网络出版时间：2013-09-12 02:47 网络出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/11.2161.Q.20130912.0247.008.html 生物化学与生物物理进展 Prog. Biochem. Biophys. 2013; 40 (8) 2 CRISPR研究历史 1987年，日本课题组在 K12大肠杆菌的碱性 磷酸酶基因附近发现串联间隔重复序列[11]，随后的 研究发现这种间隔重复序列广泛存在于细菌和古细 菌的基因组中，2002年，科学家将其正式命名为 clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)[12-14]．因为缺乏病毒和质粒的序列 信息，初期对 CRISPR的研究进展缓慢，其行使的 确切功能一直未能阐明．2005年，三个研究小组 均发现 CRISPR 的间隔序列(spacer)与宿主菌的染 色体外的遗传物质高度同源，推测其功能可能与细 菌抵抗外源遗传物质入侵的免疫系统有关 [15-17]． 2006 年，美国研究小组通过生物信息分析预测， CRISPR系统可能以类似于真核生物的 RNAi方式 Fig. 1 Schematic of CRISPR/Cas9 mediated DNA double鄄strand break 图 1 产脓链球菌 CRISPR/Cas9干扰噬菌体或外源质粒入侵示意图 TracrRNA、RNase芋和 Cas9介导前体 pre-RNA成熟；TracrRNA、crRNA和 Cas9形成的核糖核蛋白复合物介导外源遗传物质切割． RNase芋 间隔序列 Pre-crRNA Cas9 tracrRNA 正向重复序列 tracrRNA Cas9 Cas1 Cas2Csn2 引导序列 CRISPR 入侵的病毒或质粒 DNA PAM 1 CRISPR/Cas的基因座结构 CRISPR/Cas的基因座结构相对简单(图 1)．以 产脓链球菌 (Streptococcus pyogenes SF370)的典型 Type域 CRISPR/Cas为例，其基因座结构可分别三 部分，5'端为 tracrRNA 基因，中间为一系列 Cas 蛋白编码基 因，包括 Cas9、 Cas1、 Cas2 和 Csn2，3'端为 CRISPR基因座，由启动子区域和众 多的间隔序列(spacers)和重复序列(direct repeats)顺 序排列组成． 5' 3' 692· · 方锐, 等：CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术2013; 40 (8) 行使其免疫功能[18]．但这些都只是假设．2007年， Barrangou 等 [19]首次发现并 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 细菌可能利用 CRSPR 系统对抵抗噬菌体入侵 ．2008 年， Marraffini 等[20]又发现细菌 CRISPR 系统能阻止外 源质粒的转移，首次利用实验验证了 CRISPR系统 的功能，由此科学家们揭开了研究 CRISPR系统作 用机制的序幕．之后研究人员很快发现 CRISPR系 统在食品发酵工业和医学中的潜在价值，使其成为 研究的热点． 3 CRISPR的分布与分类 CRISPRdb和 CRISPI是两个专门收录 CRISPR 信息的数据库，CRISPRdb中包括一些识别和分析 CRSPR的软件工具，数据库由巴黎大学维护(http： //crispr.upsud.fr) [21-22]．CRSPI 中含有 Cas 蛋白和 CRISPRs的数据，补充了 CPRISPRdb的数据(http： //crispi.geneouest.org/)．通过对数据库中的 CRISPR 序列信息分析发现，接近 90%的古细菌和 40%的 细菌的基因组或是质粒中至少存在一个 CRISPR基 因座[23]．CRISPR中的高度可变间隔序列主要来源 于噬菌体或是质粒，长度范围在 21～72 bp，不同 的 CRISPR 基因座包含的间隔序列的数量差异很 大，从几个到几百个不等．目前发现间隔序列数量 最多的 CRISPR 存在于一种黏液细菌(Haliangium ochraceum DSM 14365)中，包含 587 个间隔序 列 [24]．CRISPR 中的重复序列长度范围在 21～ 48 bp，序列并非严格保守，甚至在同一个细菌内 的不同 CRISPR基因座的重复序列也有不同，但它 的 5' 端和 3' 端部分为保守序列，分别为 GTTT/g 和 GAAAC．重复序列里还包含部分回文结构，转 录出的 RNA能形成稳定且保守的二级结构，可能 在与 Cas蛋白结合形成核糖核蛋白复合物的过程中 发挥重要作用[14, 24-26]．通常在临近 CRISPR 基因座 的区域还包含一组保守的蛋白编码基因，被称为 Cas 基因，它们编码的蛋白包含核酸酶、聚合酶、 解旋酶以及与核糖核酸结合的结构域[27]．这些 Cas 蛋白与 CRISPR转录出的 RNA结合形成核糖核蛋 白复合物协同行使 CRISPR/Cas系统的免疫功能． 一般认为临近区域有 Cas基因的 CRISPR基因座是 有活性的，反之被认为是无活性的 CRISPR 基因 座．但这种现象并不是绝对的，如果同一个细菌基 因组中有多个 CRISPR基因座，即使部分 CRISPR 基因座附近不包含有 Cas 基因，它也能够被转录并 与基因组其他位点的 Cas 基因编码蛋白结合，所以 依然可以发挥功能[26, 28-29]． 因为 Cas 基因多样性异常丰富，简单的分类很 难区分那些同源但功能并不相关的 Cas蛋白[30]．多 个研究小组共同提议，考虑多个因素，包括保守性 的 Cas蛋白之间的进化关系及 Cas 基因操纵子的组 成方式等，将 CRISPR/Cas的免疫机制分为相对独 立的层次：第一个层次主要是对外来信息的处理和 加工，形成免疫记忆，也就是新的间隔序列的获 得，主要由通用的核心蛋白 Cas1和 Cas2参与完 成；第二个层次主要为初级 CRISPR RNA成熟以 及识别和降解入侵的外源遗传物质．按照该分类标 准可以将 CRISPR/Cas 系统分为：Type玉、Type 域、 Type芋三种不同类型． Type玉系统是 CRISPR/Cas系统中 Cas蛋白最 多和最复杂的系统，包含 6个蛋白，其中有特征性 的 Cas3 蛋白，该蛋白具有解旋酶和核酸酶功 能[31]． 多个 Cas蛋白与成熟的 crRNA共同结合形 成 CRISPR相关病毒防御复合物 CASCAD(CRISPR associated complex for antivirus defense)，CASCAD 与入侵的外源 DNA 结合，促使 CASCAD 内的 crRNA与外源 DNA的互补链配对形成 R环结构， Cas3的核酸酶识别 R 环结构后先将互补链切开， 随后在 Cas3的解旋酶和核酸酶作用下再将非互补 链切开[32-34]． Type域系统的主要特征是包含一个标志性的 Cas9蛋白(分子质量很大的多功能蛋白)参与 crRNA 的成熟以及降解入侵的噬菌体 DNA 或是外源质 粒 [35]．Cas9蛋白包含两个功能结构域，一个在 N 端，有类似于 Ruc 核酸酶的活性，一个在中部有 类似 HNH核酸酶的活性．嗜热性链球菌具有典型 的 Type域 CRISPR/Cas系统，它的 CRISPR/Cas系 统编码 tracrRNA(trans-activating crRNA)，其指导 RNase芋和 Cas9 完成前体 crRNA 的成熟．随后 tracrRNA还能与成熟的 crRNA的重复序列配对形 成 RNA二聚体，进而和 Cas9蛋白结合成核糖核 蛋白复合体，发挥识别和降解入侵的外源 DNA功 能[36]． Type芋系统包含特征性的 Cas10蛋白，其具 有 RNA 酶活性和类似于 Type玉的 CASCAD 功 能[37]．Cas10主要参与 crRNA的成熟和剪切入侵外 源 DNA．目前发现 Type芋有两种亚型：Type芋 A 和 Type芋 B．激烈热球菌的 CRISPR/Cas系统属于 Type芋 A型，它干扰的靶标是 mRNA[38]；表皮葡 萄球菌 CRISPR/Cas 系统属于 Type芋 B 型，它的 693· · 生物化学与生物物理进展 Prog. Biochem. Biophys. 2013; 40 (8) 多个研究表明 CRISPR基因座首先被转录成前 体 CRISPR RNA(pre-crRNA)，然后在 Cas 蛋白或 是核酸内切酶的作用下被剪切成一些小的 RNA单 元，这些小 RNA即为成熟 crRNA，由一个间隔序 列和部分重复序列组成[43-48]．Type域型 CRISPR/Cas 系统 crRNA的成熟除了需要 Cas9和 RNase芋参与 以外，还需要 tracrRNA的指导[36]．CRISPR基因座 在没有受到外界压力的情况下表达水平很低[44, 49]． 当外源的质粒或是噬菌体入侵宿主菌时 CRISPR的 表达很快被诱导上调[45-46, 48, 50-51]． Fig. 2 New spcacer of CRISPR acqusition 图 2 CRISPR获得新间隔序列示意图 靶标与 Type玉和域 CRISPR/Cas 系统相同，是 DNA[20]．这也反映了自然界中的 CRISPR/Cas系统 的多态性． 三种类型的 CRISPR/Cas 系统的分布有所不 同．Type玉系统在细菌和古细菌中都有发现；Type 域系统仅存在于细菌中；Type芋型大多存在于古细 菌中，只有少数的细菌是 Type芋型[39]．20世纪 90 年代末期测序技术开始飞速发展，越来越多的细菌 和古细菌的基因组信息被解密，科学家们发现一些 特殊的菌株中同时存在多种类型的 CRISPR/Cas系 统，推测基因的水平转移可能是导致这一现象的主 要原因，例如一些包含有 CRISPR/Cas 系统的 质粒、转座子元件，在不同的菌株之间的转 移[24, 28-29, 40]． 4 CRISPR/Cas作用机制 对于 CRISPR/Cas的作用机理可以分为三个阶 段来理解，第一是 CRISPR的高度可变的间隔区的 获得，第二是 CRIPSR基因座的表达(包括转录和 转录后的成熟加工)，第三是 CRISPR/Cas系统活性 的发挥或者是对外源遗传物质的干扰． CRISPR的高度可变的间隔区(spacer)获得，其 实就是指外来入侵的噬菌体或是质粒 DNA的一小 段 DNA序列被整合到宿主菌的基因组，整合的位 置位于 CRRSPR 的 5' 端的两个重复序列之间 (repeats)．因此，CRISPR 基因座中的间隔序列从 5'到 3'的排列也记录了外源遗传物质入侵的时间 顺序．噬菌体或是质粒上与间隔序列对应的序列被 称为 protospacer，通常 protospacer 的 5'或是 3'端 延伸几个碱基序列 很保 守，被称 为 PAM (protospacer adjacent motifs)，它的长度一般为 2～5 碱基，一般与 protospacer相隔 1～4碱基[41]．新间 隔序列的获得可能分为三步：首先识别入侵的核酸 和扫描外源 DNA潜在的 PAM，将临近 PAM的序 列作为候选 protospacer；然后在 CRISPR基因座的 5'端合成重复序列；最后新的间隔序列整合到两个 重复序列之间(图 2)．目前只有第一个步骤被证实， Cas1和 Cas2蛋白是负责新间隔序列获得的核心蛋 白[19, 42]．另外研究发现 Type域型 CRISRP/ Cas系统 中 Csn2 蛋白对于新的间隔序列的获得也是必需 的[19, 43]． Cas蛋白复合物 新的间隔序列整合到 CRISPR基因座 间隔序列 正向重复序列 PAM原间隔序列入侵核酸 C C CCCC C C C CCCCCCCCCC CCCCCCT T T T T T T T TTT T T G G G GC G G GGG GGG GGGG GG GGGGG GGGAAAA A A A A A A A A A 5' 3' 5' 3' 694· · 方锐, 等：CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术2013; 40 (8) 干扰是 CRISPR/Cas发挥抵御外源遗传物质入 侵最关键的步骤，成熟的 crRNA与特异的 Cas蛋 白形成核糖核蛋白复合物，再与外源 DNA结合并 扫描到外源 DNA，寻找其上的靶序列，crRNA的 间隔序列与靶序列互补配对，外源 DNA在配对的 特定位置被核糖核蛋白复合物切割．早期研究认为 crRNA的间隔序列(spacer)与外源 DNA的靶位点完 全互补配对对于切割是必需的[19, 52]，但是后来的研 究证明 spacer 与 protospacer 部分互补配对时切割 也可以发生[34-35, 53]． 5 CRISPR系统如何避免自身免疫的发生 在研究 CRISPR/Cas系统的过程中有一个很重 要的问题．宿主菌利用 crRNA与靶序列配对结合 介导外源 DNA切割，而 crRNA本身是由宿主菌的 基因组为 模板 个人简介word模板免费下载关于员工迟到处罚通告模板康奈尔office模板下载康奈尔 笔记本 模板 下载软件方案模板免费下载 转录出的 pre-crRNA 经加工后形成 的，这就是说相同的靶序列也存在于宿主的基因组 中，那么 CRISPR/Cas系统应该有一套机制将自身 序列和外源的靶序列区分开．最近表皮葡萄球菌里 的一项研究发现了 CRISPR系统区分靶点和自身基 因组的方法．在表皮葡萄球菌里面成熟的 crRNA 除了 spacer 以外在其 5' 端和 3' 端包含有部分 repeat序列．当外源 DNA入侵宿主菌时，crRNA 扫描到外源 DNA上的靶序列(protopacer)并与之配 对结合，但靶位点两端的序列不能发生配对，对于 宿主菌基因组中相同序列的“protospacer”来说， crRNA 除了能与“protospacer”配对外，两端的 repeat 序列也能与“protospacer”两侧的基因组 DNA完全配对，实际上只有不完全的配对才允许 核糖核蛋白复合体发挥切割活性，通过这样的机制 CRISPR/Cas系统避免自我免疫[54]．另外，在研究 稻白叶枯黄杆菌中的 CRRISP/Cas系统时发现，虽 然在宿主菌的 CRISPR中的 spacer序列能够与噬菌 体 Xop411一段靶序列完全配对，但宿主菌对噬菌 体 Xop411 依旧不抵抗，分析发现是噬菌体 protospacer 临 近 的 PAM (proto-spacer adjacent motifs)突变引起，这说明外源 DNA的 protospacer 序列临近的 PAM 对 CRISPR/Cas 系统识别外源 DNA 的必要性[53]．宿主菌的 CRISPR 基因座位的 间隔序列(spacer)临近位置不存在 PAM，这也是 CRISPR系统能够区分自身 DNA和外源 DNA避免 发生自身免疫的原因之一． 6 CRISRP/Cas系统的应用 虽然 CRISPR/Cas的研究还处于初始阶段，但 是其已经被应用在工业和学术领域．较为成功的应 用是在奶制品的发酵中利用 CRISPR/Cas系统增强 发酵菌株对噬菌体的防御能力．CRISPR的特性也 被用于菌株的分类，以及防止一些携带致病或是抗 性基因的质粒的扩散[55]． CRISPR/Cas系统的作用特性与限制性核酸内 切酶相似，它对序列的特异性切割主要依赖于 crRNA 与 Cas蛋白形成的核糖核蛋白复合物识别 靶 序 列 上 的 PAM 以 及 protospacer ． 根 据 CRISPR/Cas系统这一特性，将其用于设计人工的 核酸内切酶(engineered endonuclease，EEN)，用来 对我们感兴趣的基因位点进行修饰． 三类 CRISPR/Cas系统中 Type域型系统的核糖核蛋白复 合物相对简单，除 crRNA 和 tracrRNA 外，只有 Cas9 一个蛋白．目前，产脓链球菌(Streptococcus pyogenes SF370)的 Type域型系统是被改造的最为成 功的人工核酸内切酶，已经在人类细胞、小鼠、斑 马鱼中成功实现了基因组定点修饰[56-58]．在将它应 用 于 ENN 之 前 ， Martin 等 对 于 Type 域 型 CRISPR/Cas9的改造做出了重大贡献，为进一步的 应用打下坚实的基础[59-60]．他们发现 tracrRNA对靶 点的识别和切割是必需的，tracrRNA的 5'端与成 熟的 crRNA 3'端有部分序列(约 13 bp)能够配对进 而形成茎环结构，对维持 crRNA与靶点的配对可 能十分重要．根据 tracrRNA 与 crRNA 的结构特 性，他们将 tracrRNA和 crRNA表达为一条嵌合的 向导 RNA (guide RNA， gRNA)，并在体外证明 gRNA可以发挥 tracrRNA和 crRNA的功能(图 3)． 此外，他们还证明 Cas9蛋白 N 端的类似于 RuvC 的结构负责非互补链的切割，而中部类似于 HNH 的结构负责互补链的切割，将 RuvC或是 HNH活 性突变后 Cas9只有单链切割活性，类似于切口酶， 互补链切割的位点位于 PAM的 5'端的第三个碱基 外侧，非互补链切割的结果是在 PAM上游的 3～8 碱基之间． 2013年初，MIT的 Zhang研究组首次报道利 用 CRISPR/Cas9 系统对人 293T 细胞的 EMX1 和 PVALB基因以及小鼠 Nero2A细胞的 Th基因实现 了定点突变[58]．该 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 同时报道哺乳细胞内 crRNA 的成熟不需要细菌的 RNase芋．同一期的《科学》 695· · 生物化学与生物物理进展 Prog. Biochem. Biophys. 2013; 40 (8) Fig. 3 Schematic of gRNA (chimeric RNA) guide Cas9 site鄄specific cleavage in animal genome 图 3 哺乳动物细胞中 gRNA (chemricRNA) 介导 Cas9基因定点编辑 (Science)杂志发表了 Mali [57]另一篇关于改造的 CRISPR/Cas9系统用于人类细胞基因组编辑的研 究．该论文报道，利用 CRISPR/Cas9 可以在人 293T细胞和 K652 细胞基因的靶位点形成双链或 是单链的切口，从而激活细胞的 DNA修复机制(包 括非同源重组的末端链接修复和精确的同源重组机 制)，高效地介导外源基因的定点插入．该论文与 Zhang的结果相比，不同之处在于，Zhang的结果 证明 gRNA效率低于 crRNA和 tracrRNA的分开表 达模式，而 Mali等的实验结果表明，使用 crRNA 与 tracrRNA融合的 gRNA能够获得比较高的切割 效率 ． 随 后在 Nature Biotechnology 以 及 Cell Research上同期发表的两篇相关研究论文使用的都 是与 Mali相同的 gRNA，也能获得不错的打靶效 率 [56, 61]．Mali 等的 gRNA 的 3' 端保留更完整的 tracrRNA 序列，结构上更加接近天然的 crRNA： tracrRNA结构．似乎是使用 3'端完整的 gRNA效 率会更高，因为它们的打靶位点并非针对同一种细 胞的同一位点，这一点有待证明．以前的研究证明 打靶位点的甲基化会明显降低 ZFN 和 TALEN 的 打靶效率[62-64]，不同的细胞系同一个位点之间或同 一个细胞系不同的位点之间由于表观状态的不同会 导致打靶效率的差异，CRISPR/Cas9系统在真核生 物中的打靶效率也可能受到靶位点染色体的表观状 态影响．如果该位点的状态适合 CRISPR/Cas9打 靶，无论使用 crRNA:tracrRNA或 gRNA打靶效率 都会很高．当然这只是推测，是否完整 gRNA就会 比精简的 gRNA效率高，还需要系统的实验验证． 目前来看，使用完整 gRNA更加保险． Cas9蛋白来源于细菌，因此要让 Cas9蛋白高 效地转运到哺乳动物细胞核内，需要在 Cas9蛋白 的 N 端或是 C 端加上真核细胞的核定位信号． Zhang 的论文指出在 Cas9 蛋白的两端各加一个 NLS能够使 Cas9蛋白高效地转运到细胞核内[58]． 但是从Mali等的研究结果来看，只需在 Cas9的 C 端加上核定位信号，即可使 CRSIPR/Cas9系统在 真核细胞高效地发挥功能[57]．但 Shen[65]的研究结果 表明，在 Cas9的 N 端加三个或是在 N 端和 C端 Cas9 嵌合 RNA或向导 RNA Cas9: gRNA核糖核 蛋白复合体 细胞核 细胞质 CMV启动子 PolyA U6启动子 嵌合 RNA或向导 RNA NLS-Cas9-NLS 696· · 方锐, 等：CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术2013; 40 (8) 均加核定位信号都不能有效地将 Cas9转运到人细 胞核内，只有在 N端添加核定位信号并且在核定 位信号和 Cas9蛋白之间加上 32个氨基酸残基的接 头才能发挥功能．可能原因是 Cas9蛋白在折叠过 程中对临近的 NLS功能有一定“遮蔽”作用，因 此需要间隔一定距离才能消除这种影响．从目前发 表的论文来看，在 Cas9蛋白的 C端添加核定位信 号，似乎是提高 Cas9 蛋白的核转运最有效的 方法． 远援1 CRISPR/Cas9在基因治疗中的应用 与 ZFN 和 TALEN 这两种人工核酸酶相比， CRISPR/Cas9 有 一 个 极 大 的 优 势 ． 那 就 是 CRISRP/Cas9可以改造成为切口酶，在 DNA的特 定位置制造单链切口，这样基本不会引起非同源末 端连接(NHEJ)，但可以激活细胞的同源重组(HR) 机制．实验证明，同一种细胞同一位点的单链切口 和双链切口诱发的同源重组效率基本相同[57]，但是 发生 NHEJ的概率大为不同．因此，利用 Cas9作 为切口酶可以高效地介导基因定点敲入或是对基因 组的点突变，大大降低了 NHEJ风险和脱靶事件导 致的基因组其他位置产生未知的突变．Ding等[66]在 Cell Stem Cell上的论文报道，在人 iPS细胞中，在 细胞相同、载体结构相似和位点相同的情况下， CRISPR/Cas9的定点突变效率至少是 TALEN 的 2 倍以上，并且诱发双等位基因的效率更高．人的 iPS细胞在治疗一些人类的遗传疾病方面很有前 景[67-70]．例如用 iPS细胞治疗人类的镰刀型贫血症， 可以将病人的皮肤细胞诱导成 iPS细胞，然后利用 CRISPR/Cas9突变型的切口酶来介导同源重组修复 突变的血红蛋白基因，再将修复的 iPS细胞定向诱 导分化为造血干细胞移植到病人体内．这种方法既 能提高同源重组效率，又能避免使用 ZNF、 TALEN和 CRISPR/Cas9时的脱靶效应造成的潜在 危险．CRISPR/Cas9与人 iPS细胞的结合应用必然 会对人类遗传性疾病的治疗产生巨大的影响． 6援2 CRISPR/Cas9在家畜育种中的应用 1997 年，体细胞克隆羊“多利”出生以后， 大型家畜的转基因应用在很多方面取得了突破性的 进展．特别是在利用转基因奶牛、羊乳腺生物反应 器生产药用蛋白以及动物疾病模型方面都取得了重 大的成果．但是对于猪、牛、羊等大型家畜，转基 因育种方面进展缓慢，主要有两个方面的原因：一 是目前转基因大多采用外源基因随机整合的方式， 转基因表达的可控性差，很难获得稳定且表型良好 的种畜；二是外源基因的随机整合让转基因动物在 生物安全评估中受阻，也难以让消费者接受转基因 动物食品．因此科研工作者迫切需要发展大动物的 精细基因编辑技术，但是传统的同源重组基因打靶 技术效率非常低(<10原7)，在实际生产中应用困难． 近些年出现的 ZFN和 TALEN以及 CRSPR/Cas9介 导的基因组编辑技术，有可能改变这一局面．已有 多篇研究报道了 ZFN 和 TALEN 对家畜基因组进 行高效编辑[71-74]，目前也有研究小组正在研究利用 CRISPR/Cas9系统对猪的基因组定点修饰． 家畜基因的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)显著影响家畜的生产性能，例 如猪的 IFG2内含子 2的 SNP可以调节 IGF2在猪 肌肉组织中的表达，显著提高猪的瘦肉率[75]，特塞 尔绵羊 MSTN 基因 3' 端非翻译区的 SNP 导致 MSTN在肌肉中的表达下降，显著促进绵羊肌肉的 增长[76]．随着分子标记技术的发展，越来越多的功 能性 SNP将会被发现．怎样快速将这些 SNP集中 到优势的种畜基因组中提高它们的生产性能，将成 为大型家畜育种研究新方向．利用传统的杂交育种 方式引入这种优势 SNP的同时可能会引入一些不 理想的基因，影响到其他性能，需要经过多个世代 的选育才能达到育种的目标．但是，精确的基因编 辑技术可以在不改变基因组组成情况下，只在特定 的位点引入我们所需要的 SNP，一般只要一个世代 就能达到育种目标，大大缩短育种时间，降低了不 稳定性．ZFN、TALEN和 CRISPR/ Cas9都具有高 效的基因编辑效率，但 CRISPR/ Cas9在大家畜的 点突变修饰方面有独特优势．主要表现在以下四个 方面：第一，CRISPR/Cas9的靶点在基因组中分布 频率很高，几乎是每 8 bp就有一个靶点，TALEN 的靶点在基因组的分布频率大概是 1/125 bp，而 ZFN 每 500 bp 才 有 一 个 合 适 的 靶 点 [77]， CRISPR/Cas9系统更容易在需要突变的点附近筛选 到高效的靶点．第二，CRISPR/Cas9在引入定点插 入时比 ZFN 和 TALEN 具有更精确的优势，这是 由于 Cas9切割 DNA两条链的功能分别属于两个 功能域，通过突变其中的一个功能域使 Cas9变成 只切割一条链的切口酶，同时引入修复模板，这样 大大降低了天然 Cas9切割双链引入随机突变的概 率．第三，ZFN和 TALEN以及 CRISPR/Cas9对靶 点都不是 100%的特异，尤其是在靶点只有一个碱 基的差异时，它们可能无法区分模板 DNA和基因 组 DNA，统统将它们当成自己的靶点切割．因此， 697· · 生物化学与生物物理进展 Prog. Biochem. Biophys. 2013; 40 (8) 在利用 ZFN 和 TALEN 来对基因组做点突变的时 候，一般使用单链 DNA作为模板，且突变位点要 位于 ZFN和 TALEN与 DNA的结合区，尽量减少 ZFN 和 TALEN 对突变后基因组的继续切割．但 CRISPR/Cas9对靶点的识别需要 PAM (NGG)和靠 近 PAM 的 11 bp 的种子序列完全保守， 14 bp (PAM+种子序列)序列中的任何一个碱基突变之后 CRISPR/Cas9的切割效率基本降至零．所以靶点选 择时可以将突变位点设定在这 14 bp之内，完全可 以使用双链 DNA作为模板对基因组进行点突变， 不需要担心 CRISPR/Cas9是否会对突变后的基因 继续切割． 第四，在人体细胞实验中证明 CRISPR/Cas9可以简便高效地实现多个位点(多于 一个位点)切割[78]，因此可以实现一次将多个 SNP 同时引入到种畜基因组中，这样就会大大缩短育种 所需的时间．ZNF和 TALEN要实现一次多个位点 的切割就必须同时制备多对 ZFN和 TALEN，而且 目前体外合成的单链 DNA长度有限，很难在一个 模板中同时包含多个突变位点． 另外，ZFN和 TALEN除了能介导基因组的定 点突变技术之外，还可以将它们的 DNA结合区与 其他的转录调控蛋白(如 VP16和 KRAB)融合，来 激活或者抑制靶基因的表达 [79-81]．Qi 等 [82]将 CRIPSR/Cas9改造成为转录调节因子，下调基因的 表达．突变的 Cas9蛋白丢失 DNA切割活性，但 其与 gRNA 形成的核糖核蛋白复合物保留了与靶 点特异性结合能力．该复合物与基因结合后形成的 空间位阻可以抑制转录的延伸或抑制 RNA聚合酶 以及转录调控因子的结合，从而在转录水平抑制基 因的表达，这种干扰基因转录的方法不仅简单而且 能够同时干扰多个基因，在细菌和哺乳动物细胞体 内都有不错的效果，尤其是在细菌体内几乎可以达 到 100%的干扰能力．根据这一思路，我们也可以 考虑在 Cas9蛋白的末端添加其他的功能蛋白，例 如 VP16等转录激活因子以及甲基化酶等，用于激 活靶基因表达或是调控靶位点的甲基化水平，但 Cas9蛋白分子质量大、空间结构较复杂，改造后 是否能像 ZFN和 TALEN 的改造蛋白那样发挥功 能还有待研究． 7 人工构建 CRISPR/Cas9的方法以及突变 效率的检测 ZFN 和 TALEN 对靶点的识别主要依赖于 DNA结合蛋白对核酸的识别．ZFN中一个锌指蛋 白(结构单元)识别三个碱基序列，而 TALEN的一 个 RVD识别一个碱基，为了保证特异性，通常靶 点长度在 10bp 以上．因此，在构建 ZFN 或是 TALEN时需要根据靶点的序列来将锌指蛋白单元 或是 RVD 排列组合起来，操作繁琐、制备周期 长、需要耗费大量的劳动和费用． CRISPR/Cas9系统是一个由核酸和蛋白质组成 的核糖核蛋白复合物，它对靶点的识别依赖于核酸 对核酸的识别，通过碱基的互补配对完成．打靶一 个位点只需要在原有载体的基础上替换 20～30 bp 的核苷酸，相当于合成一对引物，构建过程相对于 ZFN和 TALEN更加简单、快捷，适合规模化、高 通量的组装． ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9打靶基因后引入 突变的方式基本一致，都是 NHEJ 或是 HR．在 CRISPR/Cas9的应用中，活性检测或是突变效率的 检测可以参照 ZFN 和 TALEN 方法．主要包括： 靶位点直接 PCR后 TA克隆测序、限制性内切酶 法和基于可以识别错配双链的错配内切酶检测法 (主要采用 Cel玉内切酶和 T7E1两种酶)． 8 结语与展望 从 CRISPR 发现至今 25 年已经过去了， CRISPR的功能逐步被解密．CRISPR 作为细菌和 古细菌的一种免疫系统与哺乳动物后天免疫系统有 类似之处，不同的是 CRISPR的免疫记忆能够遗传 给后代．获得免疫能力的细菌或是古细菌能够生存 下来并能将免疫能力传递给下一代，非常完美地验 证了拉马克的获得性遗传理论[83]．除了免疫能力以 外，最新的研究发现致病菌的 CRISPR还可以通过 调节内源基因表达帮助它躲避宿主的免疫系统同时 增强其毒力[84]．越来越多的研究表明 CRISPR还可 能有更多其他的功能[85]，它作为一种保护装置能够 帮助细菌和古细菌更好地适应外界不断变化的环境 压力．虽然我们已经了解了 CRISPR/Cas的免疫原 理并加以应用，但关于这个系统的一些疑问仍值得 研究．首先，CRISPR既然具有如此重要的功能， 为何大部分细菌都丢失了 CRISPR 系统？还有， CRISPR是怎样选择 spacer以及又是通过何种机制 将 spacer整合到 CRISPR基因座的 5'端？ CRISPR/Cas9 作为最简单的 Type域 CRISPR 系统被成功地改造成为类似于 ZFN 和 TALEN 的 ENN．相对于 ZFN 和 TALEN 它的优势主要体现 在其构建更加方便简单．不同的物种、不同的细胞 698· · 方锐, 等：CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术2013; 40 (8) 或是不同的靶点对于同一种 ENN效率都有很大差 异，很难轻易下结论哪种 ENN对基因组的编辑效 率会更高．CRISPR/Cas9独特之处是既可以作为双 链的内切酶也可被改造成为切口酶，另外靶点的唯 一限制是 3'端必须有 PAM序列(NGG)，所以它的 靶点在基因中出现的频率远高于 TALEN和 ZFN． CRISPR/Cas9的主要缺点可能是它的脱靶效应，它 对靶点的识别取决 14 bp 序列(PAM 和它 3' 端的 11 bp)，这种长度的序列在基因组中很容易重复出 现．但是从当前的研究结果来看，并没有发现 CRISPR/Cas9 的 脱 靶 效 应 高 于 ZFN 和 TALEN[66, 78]．CRISPR/Cas9对靶点的识别依赖于核 酸与核酸的配对，那么它对靶点的甲基化等表观修 饰的敏感程度是否低于 ZFN 或是 TALEN？Cas9 蛋白除了核酸酶的活性外还具有解旋酶的功能，这 是否意味着靶点所处的染色体的开放程度对 CRISPR/Cas9 影 响 比 ZFN 或 是 TALEN 小 ? CRISPR/Cas9来源于细菌，它是否会对哺乳动物细 胞或个体产生毒性或是否会诱发哺乳动物细胞或个 体的免疫反应？还有，能否通过筛选突变体的方法 获得更加特异的 Cas9蛋白？这些问题都有待进一 步研究． CRISPR/Cas9作为第三代人工核酸酶成为目前 研究的热点，相对于 ZFN 和 TALEN 有其独特的 优势：a．构建简单方便快捷，适用于任何分子生 物实验室；b．用于基因组的点突变编辑优于 ZFN 或 TALEN；c．CRISPR/Cas9精确的切口酶活性用 于基因治疗安全性高于 ZFN 或 TZLEN．可以预 见，CRISPR/Cas9在基础理论研究、临床治疗和农 牧渔业等领域必将有越来越有广阔的应用前景，并 且产生深远的影响． 参 考 文 献 [1] Kim Y G, Cha J, Chandrasegaran S. Hybrid restriction enzymes: zinc finger fusions to Fok玉 cleavage domain. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93(3): 1156-1160 [2] Urnov F D, Rebar E J, Holmes M C, et al. Genome editing with engineered zinc finger nucleases. Nat Rev Genet, 2010, 11 (9): 636-646 [3] Perez E E, Wang J, Miller J C, et al. Establishment of HIV-1 resistance in CD4+ T cells by genome editing using zinc-finger nucleases. Nat Biotechnol, 2008, 26(7): 808-816 [4] Moscou M J, Bogdanove A J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors. Science, 2009, 326(5959): 1501 [5] Boch J, Scholze H, Schornack S, et al. 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