巴斯德毕赤酵母

null应用双质粒共 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达体系提高融合蛋白 GGH 在毕赤酵母 GS115 中的表达量 应用双质粒共表达体系提高融合蛋白 GGH 在毕赤酵母 GS115 中的表达量 姓名：夏永仙 学号：3110102 专业：微生物 日期：2011-12-41.毕赤酵母表达系统优点1.毕赤酵母表达系统优点1.含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达 2.表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使 表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化 3.发酵 工艺 钢结构制作工艺流程车尿素生产工艺流程自动玻璃钢生产工艺2工艺纪律检查制度q345焊接工艺规程 成熟，易放大。已经有大规模工业化高 密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/L以上， 表达重组蛋白时，已成功放大到10000L null4.培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲醇，其余为无机盐，培养基中不含蛋白，有利于下游产品分离纯化；而酿酒酵母所用诱导物一般为价格较高的半乳糖 5.外源蛋白基因遗传稳定。一般外源蛋白基因整合到毕赤酵母染色体上，随染色体复制而复制，不易丢失6.作为真核表达系统，毕赤酵母具有真核生物的亚细胞结构，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻译后修饰加工功能 2.概括内容：2.概括内容： 通过同源重组的方式分别在毕赤酵母基因组 HIS4 位点与 AOX1 位点整合pPIC9K 和 pPICZαB，实现在同一宿主菌中的共表达，从而提高标蛋白在毕赤酵母中的基因剂量，在一定范围内以提高目标蛋白的表达量 表达载体主要分类表达载体主要分类 (1) 胞内表达载体主要有 pHIL-D2、pA0815、pPIC3K、pPICZ、pHWO10，pGAPZ、pGAPZa(Invitrogen)，等。该类载体可以将目的基因表达在胞内，可以避免毕赤酵母的糖基化，主要适合于那些不能被糖基化相关基因的表达。 (2) 分泌型表达载体主要有 pPIC9、pHIL-S1、pPICZα、pYAM75P 等。由于毕赤酵母本 身的泌内源蛋白非常少，将外源蛋白分泌 到胞外，非常有利于目的蛋白质的纯化及 积累。 毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式毕赤酵母同源重组的原理及目的基因整合方式 通过转化 DNA 与毕赤酵母基因组中同源序列的同源重组，毕赤酵母可产生稳定的阳性转化子。这些重组的菌株在无选择压力条件下，即使其携带的基因是多拷贝的，也表现出极度稳定性。常用的表达载体都含有 HIS4 基因，编码组氨酸脱氢酶基因，这些载体经限制性内切线性化 以后，可在 AOX1 或 his4 位点进行同源重组， 从而产生 HIS+重组子。1）基因插入 AOX1 或 aox1::AGR4 位点1）基因插入 AOX1 或 aox1::AGR4 位点2）基因插入 His4 位点 2）基因插入 His4 位点 3）多拷贝插入表达载体 如 pPIC9K，pPIC3.5K3）多拷贝插入表达载体 如 pPIC9K，pPIC3.5K3.实验方法及结果 1) 酵母表达载体 pPICZαB-ggh 的构建 3.实验方法及结果 1) 酵母表达载体 pPICZαB-ggh 的构建 pPIC9K-ggh 带有 KpnⅠ和 NotⅠ两种酶切位点的 GGH 引物 ggh 基因pMD19-T Simple Vector E. coli JM109验证抽提质粒KpnⅠ 和 NotⅠ pPICZαB pPICZαB-ggh双酶切E. coli JM109转化筛选阳性克隆PCR双酶切鉴定2000 bp 左右的 DNA 片段连连3.实验方法及结果 2)重组表达质粒的线性化和电转化酵母细胞3.实验方法及结果 2)重组表达质粒的线性化和电转化酵母细胞 5~10 μg pPICZαB-ggh PmeⅠ线性化 5.6 kb 片段回收−20 ℃保存备用电转化 Bio-Rad 电 转 仪涂布培养30 ℃ 2~3 d 出现转化子3.实验方法及结果 3) 免疫斑点法筛选高表达菌株3.实验方法及结果 3) 免疫斑点法筛选高表达菌株①将菌落转移到醋酸纤维素薄膜上 ②在 BMMY 平板上置同样大小的 0.22 μm 的硝酸纤维素薄膜，将醋酸纤维素薄膜菌落面向上置于硝酸纤维素薄膜上，30 ℃培养 80 h，上层醋酸纤维素薄膜转移至 MD 平板上，4 ℃保存 ③下层硝酸纤维素薄膜取出，5％脱脂奶封闭 2 h ，用TBST 洗膜 5 min，重复 3 次。用兔抗人血清白蛋白多抗 37 ℃孵育 2 h，用 TBST 洗膜 5 min，重复 3 次。 用二抗结合，37 ℃孵育 2 h，用 TBST 洗膜 5 min， 重复 3 次。加入新鲜配置的 DAB 显色液，染色 5 min 后用 TBST清洗，挑选出染色颜色较深的 菌落进行摇瓶培养和诱导。 3.实验方法及结果 4)诱导表达及表达产物分析3.实验方法及结果 4)诱导表达及表达产物分析 挑取膜上颜色由深到浅的单菌落接种于 10 mL的 YPD 培养基，培养 24 h，5％接种量转接到装有60 mL 含 3％甘油的 BMGY 培养基的 500 mL 三角瓶中，初始 OD 600 为 1，30 ℃、120 r/min 振荡，24 h 后离心收集菌体，用 20 mL 含有 3％甲醇的 BMMY 培养基重悬菌体后诱导表达，甲醇诱导 80 h 后OD 600 约为 200，10000 r/min 离心 10 min，收集上清，用尿微量白蛋白试剂盒测发酵上清液中的目的蛋 白 含量，发 酵 液 离 心 后 取 上 清 等体积 进 行SDS-PAGE 分析3.实验方法及结果 4)诱导表达及表达产物分析3.实验方法及结果 4)诱导表达及表达产物分析 GS115/F 3 GS115/F 33.实验方法及结果 5)重组毕赤酵母基因组的提取和 PCR鉴定阳性克隆3.实验方法及结果 5)重组毕赤酵母基因组的提取和 PCR鉴定阳性克隆 提取高产菌 GS115/F 3 和出发菌株 GS115/F 2 的基因组 DNA，加入 RNase A 消除 RNA 的干扰。以pPICZαB 质粒上的抗性基因，即 Zeocin 基因为扩增目的片段设计引物 对提取的酵母基因组 DNA 进行 PCR 扩增验证3.实验方法及结果 6) Q-PCR 鉴定高产菌的目的基因拷贝数3.实验方法及结果 6) Q-PCR 鉴定高产菌的目的基因拷贝数设计基因 gapdh 、ggh片段引物PCR回收基因片段pMD19-T 质粒重组质粒 E. coli JM109转化验证并提取重组质粒建立 gapdh 基因和 ggh 基因的循环数 (C t 值) 与起始模板数的相关标准曲线检测待测样品中的 ggh基因表达水平的差异F3与F2相比： 基因剂量提高了26.7％ 蛋白产量提高了 49.7％3.实验方法及结果 6) Western blotting 鉴定融合蛋白的表达3.实验方法及结果 6) Western blotting 鉴定融合蛋白的表达 将原始出发菌株 GS115/F 2 和高产菌株 GS115/F 3的发酵液离心取上清，200 V 电压下进行 SDS-PAGE电泳，100 V 电压下转膜 60 min 至硝酸纤维素膜上，5％脱脂奶粉 4 ℃封闭过夜，TBST 洗膜 3 次，分别加入鼠抗人血清白蛋白单抗和鼠抗人 GLP-1 单抗结合 (抗体均以 1∶1 000 稀释)，37 ℃孵育 2 h，去除抗体，TBST 洗膜 3 次。 再加入辣根过氧化物酶标记的抗鼠的二抗 (1∶1000 稀释)，37 ℃下孵育 2 h，去除二抗，TBST 洗膜 3 次之后，加 DAB 显色。3.实验方法及结果 6) Western blotting 鉴定融合蛋白的表达3.实验方法及结果 6) Western blotting 鉴定融合蛋白的表达表达宿主经双质粒体系改造前后蛋白质的 分子量均是 7.3kDa，表明宿主菌株的改造没有影响融合蛋白的特性 融合蛋GGH 同时具有人白蛋白和人胰高血糖素样肽-1 的免疫原性GGH降解条带4.讨论4.讨论1）将免疫斑点法结合高浓度抗生素平板对其进行筛选，抗生素平板上生长的菌落影印在醋酸纤维素薄膜上，诱导分泌的蛋白透过醋酸纤维素膜结合在硝酸纤维素膜上。免疫显色后各菌落的外泌蛋白量之间的对比明显、直观，可以直接挑选染色较深的单菌落进行液体培养基诱导表达。这个方法简化了筛选高产菌株的工作量，并且可靠性更高。 但是高浓度的抗生素抗性在很多情况并不能真实反映表达量，某些拷贝在整合时目的基因可能丢失， 仅剩下抗生素抗性，出现假阳性。免疫斑点法 筛选的特点是必须应用已知蛋白的相应抗体 进行筛选，因此，对于尚无抗体的新蛋白或 者比较昂贵的抗体应用较难。 4.讨论4.讨论2）毕赤酵母中宿主表型、基因剂量、外源基因特性、外源蛋白的理化性质和发酵条件的优化控制等都是影响蛋白质表达水平的重要因素。一般提高基因剂量的方法大部分都是通过在体外构建多拷贝的目的基因串联以同源重组的方式整合到酵母基因组中，然后通过高浓度的抗生素来筛选高表达的转化子。 本研究证明了两次电转携带有同种目的基因的不同分泌型表达质粒，通过高浓度的抗生素结合免疫法筛选， 不仅可以提高目的基因的拷贝数，并且在一定范 围内提高了外源蛋白的表达量。这种双质粒共 表达体系不仅可以提高单一蛋白在宿主中的表 达量，还可以实现两种不同的蛋白在同一宿主 中的共表达。 4.讨论4.讨论3）本实验通过建立双质粒共表达体系提高融合蛋白 GGH 在毕赤酵母中的表达，然后通过高浓度的抗生素抗性结合免疫斑点法进行高通量的筛选，获得的高产菌 GS115/F 3 融合蛋白的表达量将近提高了一半，和出发菌株 GS115/F 2 相比表达的蛋白质结构一致。影响外源蛋白在毕赤酵母中的表达因素还很多，它不仅受外源基因特性的影响，也受到宿主菌、Mut表型、酶切和糖基化及培养条件 的影响，所以应从影响毕赤酵母蛋白表达的多种 因素着手提高融合蛋白 GGH 的表达量，实现 规模化制备。null The End Thank You