分子克隆实验技术

nullnull吉林大学白求恩第一医院 艾滋病与病毒研究所 吕铭宇 讲师 分子克隆实验技术实验技术岗前培训null基本概念基本概念nullCell colonyMolecular 通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。 克隆（Cloning) PlantsAnimalsnull 基因克隆，是指由一个祖先基因所复制出来的基因群。由于基因的本质是DNA分子，又称DNA克隆。基因克隆（Gene Cloning）基因克隆一般是由细胞克隆在完成的。null基因 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 中常用的工具酶分子克隆分子克隆null分子克隆的基本过程 1、目的DNA的分离获取2、载体的选择与构建3、目的DNA与载体连接4、重组DNA转入受体细胞5、重组体的筛选与鉴定6、对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。null一、目的DNA的分离获取null获取目的DNA的常用方法：2.化学合成法——直接合成目的DNA（序列已知、片段较短）3. 文库筛选法——先构建，后筛选4.其他方法——重叠PCR法1. PCR——待扩增目的基因两端序列已知null PCR的基本原理 在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。PCR获得目的基因null94℃变性 54℃退火 72℃延伸 PCR的基本过程null举例：从cDNA中获取人的全长IFN-gamma的基因，怎么做？第二步. 根据引物 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 原则设计引物第三步. PCR反应第一步. 查找人全长IFN-gamma的序列 PCR获取目的基因举例null第一步. 查找人IFN-gamma的序列null1. 打开http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ 2. 在search后面的下拉框中选择Nucleotide，然后在中间的文本框中输入基因名称“IFN-gamma”，点击Searchnull3、限定为人的基因,精简查询结果。 null4、限定为mRNA,精简查询结果。 nullnullnullnullIFN-的cDNA的序列：ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCTTTTCAGCTCTGCATCGTTTTGGGTTCTCTTGGCTGTTACTGCCAGGACCCATATGTAAAAGAAGCAGAAAACCTTAAGAAATATTTTAATGCAGGTCAGATGTAGCGGATAATGGAACTCTTTTCTTAGGCATTTTGAAGAATTGGAAAGAGGAGAGTGACAGAAAAATAATGCAGAGCCAAATTGTCTCCTTTTACTTCAAACTTTTTAAAAACTTTAAAGATGACCAGAGCATCCAAAAGAGTGTGGAGACCATCAAGGAAGACATGAATGTCAAGTTTTTCAATAGCAACAAAAAGAAACGAGATGACTTCGAAAAGCTGACTAATTATTCGGTAACTGACTTGAATGTCCAACGCAAAGCAATACATGAACTCATCCAAGTGATGGCTGAACTGTCGCCAGCAGCTAAAACAGGGAAGCGAAAAAGGAGTCAGATGCTGTTTCGAGGTCGAAGAGCATCCCAGTAA null第二步. 根据引物设计原则设计引物 null长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp。 碱基分布的均衡性。 同一碱基连续出现不应超过5个。 引物Tm值一般 要求 对教师党员的评价套管和固井爆破片与爆破装置仓库管理基本要求三甲医院都需要复审吗 ： 55℃-65℃。 引物二级结构——引物二聚体。 尽可能避免两个引物分子之间3’端有有较多碱基互补发夹结构尤其是要避免引物3’端形成发夹结构。 5.引物3’端。 引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰。 6.引物5’端。 引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。 5’端加上限制性核酸内切酶位点序列(酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基);5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究;5’端标记放射性元素或非放射性物质(如生物素、地高辛等)。 7.引物的特异性。 特异性：避免非特异性扩增 引物设计原则null 引物的设计带酶切位点的引物的设计 在引物的5’端加酶切位点保护碱基+酶切位点+kozak序列（真核表达）常用的软件： Primer Premier 5.0 Oligo Gene Runner 一般引物的设计 根据引物设计原则，设计与模板完全互补配对的引物null一般引物的设计，以人IFN-gamma为例1.打开软件Gene Runner2.导入目的基因IFN-gamma序列null3. Primer F的设计Primer F（5’-3’）：ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCnull4. Primer R的设计Primer R（5’-3’）：TTACTGGGATGCTCTTCGnull带酶切位点的引物的设计,以人IFN-gamma为例Primer F（5’-3’）：ATGAAATATACAAGTTATATCTTGGC在一般引物的基础上，在其5’端加入保护碱基和酶切位点（查酶切位点保护碱基表）Primer EcoR I F（5’-3’）：CGGAATTCATGAAATATACAAGTTATATCTTGGC加酶切位点Primer EcoR I kozak F（5’-3’）：CGGAATTCGCCACCATGAAATATACAAGTTATATCTTGGC加Kozak序列（真核表达）加蛋白标签Primer EcoR I kozak Flag F（5’-3’）：CGGAATTCGCCACCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGATGAAATATACAAGTTATATCTTGGCnullPrimer R（5’-3’）：TTACTGGGATGCTCTTCGPrimer R（5’-3’）：TTACTGGGATGCTCTTCGPrimer F（5’-3’）：GCTCTAGAATGAAATATACAAGTTATATCTTGGC加酶切位点Primer Xbal kozak F（5’-3’）：GCTCTAGAGCCACCATGAAATATACAAGTTATATCTTGGC加Kozak序列（真核表达）加蛋白标签Primer Xbal kozak Flag F（5’-3’）：GCTCTAGAGCCACCATGGACTACAAAGACGATGACGACAAGATGAAATATACAAGTTATATCTTGGC反向引物在引物的5’端加入保护碱基和酶切位点的互补序列EcoR I:CGGAATTC Xba I：GCTCTAGAnull第三步. PCR反应体外扩增IFN-gamma 基因null以primer star 酶为例94度 3min94度 30s 55度 30s 72度 1min 20s(1kb/1min)72度 10min30cycle反应程序null第四步. 分离回收PCR获得的扩增IFN-gamma 基因nullDNA凝胶电泳切胶胶回收试剂盒回收目的基因null分子克隆的基本过程 1、目的DNA的分离获取2、载体的选择与构建3、目的DNA与载体连接4、重组DNA转入受体细胞5、重组体的筛选与鉴定6、对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。null1、载体的基本特点 1、载体的基本特点 null载体的分类null1. 克隆载体的结构特点克隆载体用于外源DNA片段的克隆和在受体细胞中的扩增选择性标志主要特点：复制子单一或多克隆酶切位点 克隆载体null用质粒图谱来观察克隆载体上的三个特点null1. 表达载体 的结构特点表达载体（expression vector）：用来在宿主细胞中表达外源基因的载体。 目的基因转录或翻译所必须的一些元件 比如启动子，核糖体结合位点，和终止子选择性标志主要特点：复制子单一或多克隆酶切位点 表达载体 null O LacLac operon 从质粒图谱上看表达载体的基本组成含有原核基因的转录单位，操纵子结构null2、常用的质粒载体null1. pUC18/19质粒载体：（实验室最常用的克隆载体）特点：pBR322的复制起点(ori) Apr基因，但DNA序列发生变化，不再含原来限制性核酸内切识别位点 lacZ基因内部有一段MCSpUC18 is derived from pBR322null2. pMD18-T载体特点：线性载体 5`端各带一不配对T 与PCR产物连接（T-A克隆）null3. pCDNA3.1 质粒载体图谱（真核）null4、在基因克隆过程中如何选择载体？null1.构建DNA重组体的目的，克隆扩增/表达，选择合适的克隆载体/表达载体   2. 载体的类型： （1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。如<10kb选质粒。 （2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。 （3）对原核表达载体应该注意3点：     ①选择合适的启动子及相应的受体菌；     ②用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；   3、载体MCS中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于连接。 如何选择载体？null分子克隆的基本过程 1、目的DNA的分离获取2、载体的选择与构建3、目的DNA与载体连接4、重组DNA转入受体细胞5、重组体的筛选与鉴定6、对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。null三、目的DNA与载体的连接null1、末端连接的种类null1.黏端连接2.平端连接—单一酶切位点的粘端连接 —双酶切点的粘性末端连接3.黏-平末端连接末端连接的种类nullVectorEcoRIEcoRIEcoRIRE digestion RE digestion Ligation Recombinant vectorRecombinant vectorRecombinant vectorEcoRIEcoRIEcoRIEcoRIEcoRI—单酶切基因片段的连接: 连接没有方向性单一酶切点的粘性末端连接1. 黏端连接null 目的DNA双向插入载体 多拷贝现象 没有方向性 容易出现载体自身环化缺点：nullwww.themegallery.com碱性磷酸酶预处理线性化载体DNA，载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。 载体自身环化解决办法：插入片断null双酶切点的粘性末端连接——实验室最常用的方法—双酶切基因片段的连接: 有方向性1. 黏端连接nullT-A 连接: www.themegallery.com 1. 黏端连接null任何带有平头末端的片段都可以连接，但效率低。2. 平端连接nullwww.themegallery.com 黏-平末端连接效率介于黏端和平端连接之间目的DNA和载体之间通过一端为黏端、另一端为平端的方式进行连接；可实现定向克隆3. 黏-平末端连接null一、双酶切反应，以EcoR Ι和XbaI 双酶切为例1. 确定双酶切用的通用缓冲液null2.配置反应体系3. 反应条件：37度，酶切过夜。4. 琼脂糖凝胶电泳检测并分离酶切后目的基因和载体，回收目的基因和载体null二、连接反应1. 配置反应体系2. 反应条件：16度，连接过夜。null分子克隆的基本过程 1、目的DNA的分离获取2、载体的选择与构建3、目的DNA与载体连接4、重组DNA转入受体细胞5、重组体的筛选与鉴定6、对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。null四、重组DNA转入受体细胞null常用的受体细胞大肠杆菌 酵母 昆虫细胞 哺乳动物细胞 感受态细胞（competent cell）null转化（transformation） 直接将质粒DNA导入细菌或酵母细胞称转化 转染（transfection） 将外源DNA导入真核细胞或将噬菌体DNA导入细菌称为转染。 感染（infection） 借助噬菌体或病毒颗粒将外源DNA导入宿主细胞称为感染。 电转化法 微注射法 常用的基因导入受体细胞的方法null氯化钙转化法 磷酸钙转染法 脂质体转染法 DEAE-葡聚糖法 电穿孔法 基因枪法常用的导入方法null氯化钙转化法一般用于大肠杆菌的转化 用CaCl2处理大肠杆菌，Ca2+ 与细菌外膜磷脂在低温下形成液晶结构，后者经热脉冲发生收缩作用，使细胞膜出现空隙，细菌细胞此时的状态叫做感受态。 null氯化钙导入法过程：null原理： 脂质体分子的阳离子部分与带有负电荷的核酸（磷酸盐上的负电荷）相连，形成脂质体/核酸复合物。该复合物所剩下的所有正电荷还可与细胞膜表面的负电荷相连，从而提高转染效率。经过细胞内吞进入细胞内。脂质体转染法（动物细胞）null脂质体转染法过程(1)将细胞接种于6孔板培养24小时，使其密度达到50～60%。 (2)在试管中配制DNA/脂质体复合物： ①用无血清培养基稀释供体DNA与脂质体悬液（按说明 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 计算比例），室温下放置5～10分钟，使DNA结合在脂质体上。 (3)弃去细胞中的旧液，用无血清培养液洗细胞一次后弃去，向每孔中直接加入 DNA/脂质体复合物，37℃培养3～5小时。 (4)再于每孔中加入20%FCS的培养基，继续培养14～24小时。 null分子克隆的基本过程 1、目的DNA的分离获取2、载体的选择与构建3、目的DNA与载体连接4、重组DNA转入受体细胞5、重组体的筛选与鉴定6、对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。null五、重组体的筛选与鉴定（筛） 鉴定null重组体的筛选与鉴定1.载体表型选择法 1.载体表型选择法 null一、抗药性平板筛选细胞在含有相应抗生素的培养基中培养： 无载体转入的细胞——死亡；含有载体的细胞——存活。尚需进一步鉴定载体是否为含有目的DNA的重组载体null二、-半乳糖苷酶显色反应选择法（蓝白斑）-半乳糖苷酶 乳糖半乳糖葡萄糖Xgal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝++深蓝色1. 原理：载体上有一段-半乳糖苷酶基因（Lac Z）的片段（氨基端），其上有外源DNA的插入位点。 受体菌基因组中有突变的-半乳糖苷酶基因（ 片段缺失）。可以被IPTG诱导表达。 载体和受体菌基因组可以互补形成完整有功能的-半乳糖苷酶。 Xgal----(5-溴-4-氢-３－吲哚－β－Ｄ－半乳糖苷)null（LacZ基因 N端序列）插入片段（LacZ基因失活）LacZ基因 N端序列LacZ酶蓝白斑筛选示意图null pMD18-T Vectornull 取5-10μL连接产物加到200μL分装的感受态细胞中。轻轻混匀，冰浴30min； 、 42℃（水浴中）热激90s，迅速在冰浴中冷3- 5min； 在上述管中加入600μL LB培养基，于37℃振荡（慢摇）培养45min-1hr； 制LB平板：将LB固体培养基溶化为液体，冷却到50-60℃时，在150 mL培养基中加氨苄青霉素（50mg/mL）150μL，使终浓度为50μg/mL。实验 步骤 新产品开发流程的步骤课题研究的五个步骤成本核算步骤微型课题研究步骤数控铣床操作步骤 null 混匀后倒入7-8个平皿中，待其凝固后，于LB平板中央加入X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷，为生色底物）40μL和IPTG（异丙基--β-D-硫代半乳糖苷）10-20μL。用灭菌的涂棒将X-gal和IPTG均匀涂布于平板上。 吸取300-500μL菌液（或将菌液离心后仅留少量的上清悬浮，取部分浓缩液），涂布于LB平板（含Amp+，X-gal和IPTG）上。室温涂布均匀后（至菌液完全被吸干），于37℃倒置，过夜（12-16hr）培养； 观察菌落，筛选阳性克隆。 null-半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。null直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较其分子量。利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。 分子量 Marker载体重组克隆null方法包括： 限制性内切酶法 PCR法 核酸杂交法 DNA测序法根据序列特异性可筛选出特定的重组DNAnull限制性内切酶法——根据限制酶切图谱筛选特定DNA连接前用什么酶 就用什么酶切nullnullPCR能在模板序列上扩增出预期DNA片断。（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。（2）用外源DNA插入片断引物作PCR。（3）电泳PCR产物。（4）检查是否有PCR产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。PCR法——直接鉴定目的DNA的存在原理过程null 凝胶电泳检测加样孔DNA Marker空质粒重组质粒 重组质粒酶切重组质粒的PCR扩增片段电泳检测法、酶切法、ＰＣＲ法凝胶电泳检测　null核苷酸序列测定——最准确的鉴定目的DNA的方法 可明确序列和阅读框的正确性null举例：构建pcDNA3.1-IFN-质粒1. 获得目的基因IFN- （1）设计引物 primer EcoRI F: Primer Xbal R: （2）以cDNA为模板，PCR获得目的基因IFN- 2. 载体的选择 pcDNA3.13. 载体与目的基因的连接 （1）将载体pcDNA3.1和PCR产物，用EcoR I 和Xba I进行双酶切 （2）T4 DNA ligase连接pcDNA3.1和目的基因IFN-4. 重组体转入受体细胞 （1）连接产物转入DH5感受态5. 重组体的筛选和鉴定 （1）将转入后的DH5 涂与含氨苄青霉素的LB平板上 （2）挑取LB平板上的单克隆，小提质粒，质粒进行双酶切鉴定或PCR鉴定 （3）双酶切鉴定或PCR鉴定正确的质粒，送测序null分子克隆技术概念及用途： 将感兴趣的基因引入具有特定功能的质粒载体，用特定方法将其导入细菌，细胞，动物体内表达对应蛋白，研究基因的功能。 X基因的克隆X基因的克隆目的基因样本 根据序列设计引物 酶切片段，切质粒载体 连接，转化大肠杆菌DH5a，Top10 挑克隆，培养 提取质粒，测序 nullnull1. 目的基因 （购买，他人赠予， 自制全细胞cDNA文库，序列合成）null2. 引物设计 软件 Generunner，Vector NTInull3. 酶切 切质粒载体