ISH原位杂交检出mRNA

18 18.3.3原位杂交检出mRNA 原位杂交(以检出mRNA为目标)是检出组织、细胞中存在特定、并且正在 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达基因的方法。原位杂交技术可用于探求恶性细胞的来源，研究基因表达、突变、丢失、插入对癌细胞分化、分裂、受体特性的影响以及和恶性变及转移机制的关系。 方法简介： 本法要在完整地保存RNA 的同时制备组织切片，并在其上进行杂交。因此需要组织学技术、分子生物学技术等多种技术的组合。但从结果得到的情报量也多。在原位杂交的显示阶段使用放射性同位素时，需要镀膜、自显影等。用地高辛系统等非放射性标记物则需要显示标记物反应。由于后者方便、也有相当的分辨率与敏感度。以下以地高辛标记为例简介非放射性原位杂交法。 检测mRNA需对器皿、试剂进行去RNA酶处理，以免在检测过程中组织中的mRNA被消化造成假阴性结果。将取出组织、细胞用4%多聚甲醛-PBS溶液中固定，梯度乙醇脱水。透明、浸蜡后将组织包入石蜡中。 固定、脱水、包埋操作是获得良好组织切片的重要步骤。冰冻切片步骤少，RNA分解机会也少，但形态不如石蜡切片。 将玻片浸入硅烷溶液镀膜后，制作切片。本法以RNA 探针效果最好，寡核苷酸探针也可，随机性引物探针不适用于原位杂交，其缺点是易出现背景染色，敏感度也不高等。据报道，用同位素探针时，将探针分解成长度为100碱基左右的的探针可增加信号强度。作者在地高辛系统未见有明显差异。由于地高辛对碱耐受性较差，分解后回收率很低。用不同分子量的探针检查探针对切片的渗透力，结果与预料相反，大至700 碱基的探针均有良好的渗透力，1K左右的探针也可得到满意结果。也就是说，在亚克隆时得到的插入DNA 如在1K以下，由此制备的探针可以不用分解，直接用于杂交。转录产物可以长期保存(3个月)，这种情况下用乙醇沉淀比较安全。 石蜡切片脱蜡进水后用蛋白酶 K消化，4%多聚甲醛·磷酸缓冲液再固定。冰冻切片则直接用蛋白酶 K消化，4%多聚甲醛·磷酸缓冲液再固定。经漂洗等处理后脱水干燥，滴加探针液放入湿盒进行杂交。杂交后经漂洗、抗体反应、显色反应后封片、照相。 消除背景染色的方法：①.在抗体反应液与洗净液中加入 0.2% Tween-20可减少非特异性背景染色。②. 用较高浓度(10%) 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 血清或正常IgG封闭。③在经过前处理的无用切片上滴加稀释抗体吸附60分钟。将吸附过的抗体溶液滴加在杂交切片上，进行反应。 原位杂交法具有分子生物学与组织形态学两个方面。如果成功，由此可得到许多信息。可以期待本技术在将来会成为一种有多种用途的肿瘤分子研究法。 应用举例： 我们用原位杂交技术检测化学诱发肝癌过程中白蛋白的表达改变，发现白蛋白mRNA表达随肝细胞变性、增生而表达减少甚至消失，随肝细胞再生及肿瘤向肝细胞方向分化表达重新出现或加强。以往我们观察到肝细胞肝癌(HCC)向胆管细胞性肝癌(CC)分化，用原位杂交发现CC病灶中部分肿瘤细胞有HCC分化，呈明显的白蛋白mRNA阳性。说明原位杂交技术可以为确定肿瘤分化方向提供证据，可应用于临床肿瘤分类诊断。 用原位杂交技术检测肿瘤细胞内癌基因mRNA，可检出激活的癌基因。用不同种类的癌基因探针检测同一种癌组织内癌基因mRNA，可以明确肿瘤内有哪些癌基因被激活。同样，用癌基因特异的DNA探针可检测癌组织中癌基因的扩增情况。已有报道发现胃癌、肺癌细胞内H-ras和c-myc癌基因被激活；肝癌、大肠癌、淋巴瘤中c-myc扩增；乳腺癌和肺癌中c-erbB-2扩增。 该技术还可用于检测与肿瘤增生、浸润转移相关的细胞因子及受体的变化。我们应用本技术检测不同时期肝癌转化生长因子及其受体的表达，发现结节性增生肝细胞中少数邻近界板的细胞内能检测到TGF1、2mRNA。部分不典型增生肝细胞内检测到TRⅡmRNA。肝癌细胞中未能检测到TGF及TRⅡmRNA的表达。在条索状及团块状新生胆管细胞中显示TRⅡmRNA表达，胆管增生区域内，胆管上皮表达TRⅡ,TGF1 mRNA。胆管增生纤维化明显区，TGF2 mRNA在增生明显的胆管上皮及周围梭型细胞均有表达，以胆管细胞的表达较强烈。胆管癌细胞癌中TGF1与TRⅡmRNA的表达较弱。说明原位杂交可以用于检测肿瘤相关细胞因子在肿瘤发生过程中的表达从而推测其对肿瘤生物特性的影响。 肿瘤间质对肿瘤的生物学特性有重要影响。我们用原位杂交技术检测后观察到HCC较少表达TGFβmRNA而CC的TGFβmRNA表达较多，同时间质细胞TGFβ受体mRNA表达也以CC为多。TGFβ是重要的间质形成促进因子，以上结果可能是HCC与CC间质差异形成的重要原因，可能对HCC、CC的浸润、转移差异有一定影响。提示原位杂交对研究肿瘤细胞与非肿瘤细胞的相互作用十分有效。 原位杂交技术还可用于临床分期、估计预后。例如，神经母细胞瘤病人早期没有癌基因扩增，晚期有N-myc基因扩增。小细胞肺癌如果c-myc基因扩增，c-myc mRNA表达提高，表明比典型小细胞癌分化更低、恶性度更高。 18.3.4 原位杂交检测 DNA 应用原位杂交技术结合染色体显带技术可进行正常细胞基因和癌基因的染色体定位。用上述方法检出的癌基因有近30种，其中大部分已定位于人类染色体的特定区域(另行介绍)。 适用于检查被DNA病毒感染的细胞，检查病毒与肿瘤发生发展的关系。离心沉淀细胞涂片也可用此法。方法与mRNA 检出法类似，不同之处有：无必要对器械、试剂进行去RNA 酶处理。为使探针向细胞内的渗透效率稳定，PCR法扩增、标记的地高辛探针的长度以200～300 碱基为宜。预处理切片时为使探针能充分渗透到核内，蛋白酶的浓度要大大高于检查RNA 所用者。杂交前要加热使探针变性，骤冷。 应用举例： 原位杂交技术既能在受感染的组织、细胞内显示特定病毒的DNA或BNA序列，确定感染病毒的类型，又可同时观察到组织病理变化，确定受感染细胞的类型，这有助于了解病毒与肿瘤发病机制和病理过程的关系。为了增加检测的敏感性，可在原位PCR的基础上再进行原位杂交。 乙型肝炎病毒(HBV)DNA与肝癌的关系研究较多，已在肝癌细胞内发现有整合型HBVDNA及游离的HBVDNA，在原发性肝癌中其整合率达90％，在癌旁组织中也发现有HBV DNA存在，这些结果对进一步阐明HBV与原发性肝癌的关系有重要意义。最近原位杂交研究证明，丙型肝炎病毒(HCV)也与肝癌发生密切相关。张王海等应用高敏感的HCV cDNA探针对66例人HCC标本石蜡切片进行原位杂交，探讨HCV 、HBV在HCC中的存在情况。发现HCV在癌周表达较强；HCV与HBV在HCC中的存在是各自独立的，但又经常伴随。认为肝炎病毒在HCC发生中的独立和相互作用均值得重视。还用原位杂交观察HCC中癌基因c-myc、N-ras、H-ras，肿瘤转移抑制基因nm-23H1，细胞因子TGF-β1 ｍRNA表达，并探讨HCV各基因区抗原的表达对它们的影响。发现HCV核心蛋白抗原CP10是致癌的重要因素，能够促进癌基因c-myc、N-ras、H-ras的表达。NS3抗原对上述基因表达的影响不明。NS5可能通过促进TGF-β1ｍRNA表达，间接抑制c-myc的表达，从而影响HCC的分化。nm-23H1的表达几不受HCV的影响，而与HBV的关系密切，HBV能抑制其表达，但机制不明。 EB病毒(EBV)是一种亲人B淋巴细胞性病毒。经原位杂交技术证实，EBV还可在口咽上皮细胞、宫颈上皮细胞内复制；EBV能引起传染性单核细胞增多症，并与Burkitt淋巴瘤和免疫功能受损患者淋巴瘤的发病有关，约50％AIDS相关淋巴瘤与EBV有关。在鼻咽癌的研究中，已发现EBV与未分化型和非角化型鼻咽癌的发生密切有关。关于EBV与其他类型上皮肿瘤的关系，如唾液腺癌、乳腺髓样癌、胸腺瘤、胃癌、肺癌等也有报道。 人乳头瘤病毒(HPV)与子宫颈良、恶性上皮肿瘤相关，还与肺癌、消化系统肿瘤和泌尿系统肿瘤有关。HPV有60多个亚型，用HPV—DNA探针检测子宫颈涂片，发现阳性率高达66％。HPV中有些型与良性肿瘤有关，而有些型(如16和18型)则与癌或癌前病变有关。 双重原位杂交同时显示癌基因和病毒，可用于研究两者在肿瘤的发生过程中是否具有协同作用。例如在皮肤、粘膜良性病变和恶性肿瘤中HPV感染情况与c-myc和H-ras癌基因活性的对比研究中发现：癌基因myc和ras与PVV感染在皮肤致癌方面可能有协同作用。 18.4特殊原位杂交方法及相关技术： 薄片组织原位杂交:薄片组织不经切片，直接进入前处理，在微量离心管内进行原位杂交和探针漂洗。抗体反应与显色反应也在试管内进行。可以直接观察，也可在发色后制备切片，观察有基因表达的细胞。不过，组织的大小受到限制: 厚度超过2mm 时，探针、抗体的渗透率差，不能保证满意的结果。 整体原位杂交:优点为除可观察动物整体外，还因标本有一定厚度而使信号增强。无需高度技巧的包埋、制片过程。缺点为用组织在杂交液中进行反应，组织的大小也有限制，需要较长时间漂洗多余的探针。如不进一步作组织切片，就难以确认信号在细胞的定位，不能进行详细的组织学检查。观察杂交结果可用解剖显微镜或倒置显微镜。照像可用暗背境或透射光。这时可接着做冰冻切片观察信号的细胞定位，但要知道，切片后信号会相应地减弱。 自动化原位杂交 就是用自动化原位杂交仪完成原位杂交的主要步骤。杂交步骤同常规原位杂交，包括器械、试剂去RNA酶处理，组织固定、包埋，玻片处理与镀膜，制备切片，制备探针，切片预处理，杂交，洗去多余探针，抗体反应，显色反应。 将自动免疫组化仪加以改良，就可将其转用于自动化原位杂交。 原位杂交结果的定量 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ：在用原位杂交技术于癌的诊断等时，会遇到定量的问题。放射性同位素标记探针可用乳剂进行放射自显影，乳剂在β线作用下感光，形成银粒，对银粒计数即可定量。非放射性同位素标记探针原位杂交技术的检查结果可用图像分析仪可进行信号变换，对原位杂交的结果进行定量分析。 信号强度的数值化：用CSPD的分析缓冲液滴加在切片上，用光强度测定器测定，进行图像分析，算出每个细胞的测定值。将数值资料保存于软盘或照像。 如果荧光标记的抗地高辛抗体效价很高而且稳定，可不经发光处理，直接用激光共聚焦显微镜进行定量。这样，图像清晰，敏感度也高。抗体效价较低时，需要用间接法。 由于原位杂交技术既可从分子水平去研究DNA或BNA的性质及其病理变化，又能在细胞水平进行形态学观察，不仅可利用新鲜组织标本、培养细胞，而且可用于石蜡包埋切片进行回顾性研究。因此，随着该技术的发展和方法的不断改进与完善，在医学生物学的各个领域得到广泛的应用。