果蝇蛋白质组学研究进展

生 ，丌 技 术 H 通 讯 v ， ．24N。．5 Se)．9LE RSIN BIOTEC NOLOGY oI 3ep Z～U13 TTE H V · 斗l o·3 lj 715 doi：10．3969~．issn．1009—0002．201 3．05．028 果蝇蛋白质组学研究进展 邢晓华。。 一，杨晓明 一，徐平 ’ 1．北京工业大学 生命科学与生物工程学院，北京 100124； 2．军事医学科学院 放射医学研究所，北京 100850；3．北京蛋白质组研究中心，北京 102206 综 述 [摘要] 蛋白质组学旨在阐明基因组所 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达的真正执行生命活动的全部蛋白质的表达规律和生物功能。随着人类 基 因组学计划 的逐 渐成 熟 ，分 子水平 的实验技 术不断发展 ，蛋 白质 组学的研究被提高 到 了前所未有 的高度。果蝇是 生命科 学领域最为 常用 的一种模式 生物，长期 的系统研 究也使果 蝇的基 因组成 为至今 注释最好 的基 因组之一 ，为功 能基因组研究奠定 了基础。但由于技术的限制，迄今有关果蝇蛋白质组学研究的报道尚不多见。近年来果蝇蛋白质 组学 的研 究主要包括表达谱 、修饰谱 、比较蛋 白质组 学和疾病模 型蛋 白质组等 四个方 向，为进 一步开展人 类疾病 临床 蛋 白质组学研 究奠定 了基础 。 [关键词] 果蝇；表达蛋白质组；翻译后修饰蛋白质组；比较蛋 白质组；疾病模型蛋 白质组 [中图分类号] Q5；Q78 [文献标识码] A [文章编号] 1009—0002(2013)05—0715—07 Advances in Drosophila melanogaster Proteomics XING Xiao—Hua _2l3，YANG Xiao—Ming。’ ，XU P '。 1．College of Life Science and Bioengineering，Beijing University of Technology，Beijing 100022；2．Beijing Insti— tute of Radiation Medicine，Beijing 100850；3．Beijing Proteome Research Center，Beijing 102206；China Co—c0rresponding authors，YANG Xiao—Ming，E—mail．"xia0mingyang@sina．eom；XU Ping，E—mail：xupingghy@gmail．con 果 蝇 (Drosophila melanogaster)是 一种 双 翅 目 (Diptera)昆虫，因喜好腐烂的水果及发酵的果汁而 得名 。由于个体小 、繁殖快 、生活史丰富 、染色体少 、 突变多等一 系列优点 ，果蝇 已成为生命科学领域最 常用 的一种模式生物⋯。 果蝇是多细胞生物 ，具有复杂的发育过程和丰 富的行 为学特征 ，与人类在身体发育 、神经退化 、肿 瘤形成等的调控机制上有很 多相通之处 ，其调控规 律也与人类极其相似 ，许多人类基 因在果蝇上也有 ， 收稿日期：2013—03—19 基金项 目：国家自然科学基金(31070673，31170780)；国家重点实验 室课 题 (SKLP—K200904．SKLP—Y201102)；国家 科技 支 撑 计 划 (2Ol2BAFl4B00) 作者简介：邢晓华(1987一 )，女，硕士研究生 通信作者 ：杨晓明，(E—mail)xia0mi“gya“g@sina．con；徐平 ，(E—mail) xupingghy@gmail．com 甚至功能可以互通 。因此，在20世纪生命科学发 展 的历史长河 中，果蝇扮演 了十分重要的角色。遗 传学 、发育 的基 因调控 、各类神经疾病 、帕金森病 、老 年痴呆 、药物成瘾 和酒精 中毒 、衰老与长寿 、记忆与 某些认知行为的研究 中都有果蝇的“身影"[31o 目前 果蝇基因组方面的研究也 已相当成熟。2000年 ，果 蝇全基因组测序完成。该基因组中编码蛋白质的基 因有 13 600多个 ，数量少于线虫。但因果蝇存在复 杂的生活史和形态变化 ，因此其基因的功能调控更 为复杂多样。长期的系统研究也使果蝇 的基 因组成 为至今注释最好的基因组之一 。另外 ，果蝇拥有 目 前国际上应用最广泛的在线数据库Flybase，利于对 其蛋白质的功能和结构进行进一步的分析 。 尽管果蝇的研究在遗传学和基 因组方面已非常 成熟，但蛋白质是生命活动功能的直接承担者，在果 一峨 一 h S g v 一一一 咖一～ 一 一 ～ 协 一 ．一 ．～一一～～一一 一 一 一一一一一一～ 一 _罟 。 ．叭 ． n e 一 一呲一一 ．一 一～一 一一～ 一 一 一 ～ m m 砒 一一一一一一一～一 ～一一～一一～～一一 一 一 m ．一 ．霎～ ～～一一一一一一一一 7l6 L 生 ETTE 物 RS IN 技 BIOT 术 ECHN 通 OLOG 讯 Y v。l-24 NO．D seP．．2O13 V OI· 斗l e‘一二Ul0 蝇蛋 白质组水平的研究可以直接获得基因在细胞内 的确切功能 ，是系统鉴定 、定量蛋白质 ，并研究其生 物学功能 的重要手段。最重要的是 ，在蛋 白质组层 面 ，果蝇作为无脊椎模式生物 ，在氨基酸序列水平与 脊椎动物的同源性最高 ，结合果蝇的遗传学 、基 因组 学及生理学研究技术基础 ，能够对其如此丰富且与 人类极其相似 的生活史调控 规律进行深度解读 。 因此 ，果蝇蛋 白质组学研究 引起了生命科学界 的广 泛重视 ，成为 当今国际生命科学和生物技术领域最 活跃的学科前沿 。 但 由于技术 的限制 ，至今在果蝇蛋 白质组学方 面的研究报道并不多见。我们对近年来的果蝇蛋白 质组学研究进行了综述 ，主要包括果蝇蛋白质组的 产生背景 ，以及在表达谱 、修饰谱 、比较蛋白质组学 和疾病模型蛋 白质组学等方面的进展 ，并对果蝇蛋 白质组学 的发展前景进行了展望 ，为进一步开展人 类疾病模型的果蝇蛋 白质组学研究奠定基础 。 l 果蝇及 其蛋白质组 的研究 内容 果蝇的生活史包括卵、幼虫 、蛹、成虫等4个连 续 的但形态完全不同的变态发育阶段。其 活周期 十分短暂 ，在25℃、60％相对湿度条件下约为 10 d。 通过控制养殖温度 ，可以加速或 减缓果蝇 的发育 。 果蝇个体很小，成虫果蝇体长仅为3～4 mm，且雄性 较雌性偏小。果蝇 的染色体数 目少 ，其核型只包括 4对 同源染色体 ，其中 1对为性染色体 ，3对为常染色 体。果蝇的性别决定方式为XY型 ，雄性异配，因此 常常被用作验证性别决定的实验素材 。 基于清晰的遗传背景 和便捷 的遗传操作 ，果蝇 在发育生物学 、生物化学 、分子生物学等领域都 占据 了不可替代的位置 ，在神经科学领域也得到越来越 广泛的应用。随着现代分子生物学技术的El臻成 熟 ，对果蝇的研 究已远远不止停留在基 因和遗传学 的层次上 ，科学 家更关注果蝇基因如何调控蛋 白质 的表达 ，并进而对生命活动进行直接调控 ，揭示人类 生命的奥秘。 随着人类基因组学计划 的逐渐成熟 ，分子水平 的实验技术不断发展 ，果蝇蛋 白质组学研究的各个 方面均有较大突破，新的研究 内容和方法不断出现。 2 果蝇蛋白质组表达谱 基于凝胶 电泳体系的蛋 白质鉴定策略是近年来 果蝇蛋 白质组学研 究常用 的技术策略 ，主要包括 2 种技术 ：一是基于 2一DE的传统的蛋 白质组学研究方 法 ，二是基于一维凝胶电泳分离一高效液相色谱分离 和串联质谱技术(GeLC—MS／MS)的蛋 白质组学研究 策略。但 由于技术的限制 ，果蝇蛋白质组学研究 ，尤 其是大规模的蛋白质组学研究报道 尚不多见。为得 到覆盖率更高的果蝇蛋 白质组表达谱 ，各种新方法 不断产生 ，比较有效 的是将样 品分为不同的组织和 器官分别进行鉴定 ，不但可以提高鉴定率 ，也可以为 研究特定组织和器官提供更为详尽的蛋 白信息 ，实 现生物功能专一性和多样性(表 1)。 2．1 基于2一DE的传统的蛋 白质组学研究方法 基 于2一DE的传统 的蛋 白质组学研究方法在前 期 的果蝇蛋 白质组学研究中占据主要地位。Alonso 等 利用 2一DE技术研究 了果蝇线粒体的蛋白质组 ， 鉴定到 231个银染的多肽 ，对应了66个线粒体蛋 白 质；并且用相似的技术体系对果蝇成虫的翅膀胎盘 进行 了蛋 白质组分析 ，共鉴定到 1492个多肽 ，对应 了 1O0多个蛋 白[91 o Vierstraete等” 利用该技术对果 蝇幼虫血淋巴的分泌蛋 白质组进行 了分析 ，分别得 到脂 多糖 、啤酒酵母和藤黄微球菌等 3种物质感染 下发生免疫的蛋 白质 10、20和 l9个 。Takemori等”I 用相似的技术体系发现 了440个果蝇雄性生殖 系统 (包括睾丸 、精囊 、附属腺 、射精管和射精管球)组织 特异的蛋 白。Lee等” 利用双向电泳技术鉴定 了果 蝇头部中的1500个荧光蛋 白点 ，得到 650个蛋白质， 其中500个属于果蝇头部特异 的蛋 白质。 双 向电泳可分离上千种蛋 白质 ，并获得该蛋 白 表 l 以果蝇为模式生物的蛋 白质组表达谱 研究进展 邢晓华等：果蝇蛋白质组学研究进展 717 的等 电点和相对分子质量 ，但也存在不易分离强疏 水性 、低溶解度 、极酸或极碱的蛋 白质 ，以及繁琐 、不 稳定 、灵敏度低等缺点 “ 。 2．2 基于 高效液相 色谱分 离和 串联质谱技术的蛋 白质组学 近几年中，基于高效液相色谱分离和串联质谱 技术的蛋白质组学逐渐成为主流的全蛋白质组研究 方法。Bunner等 报道了基于LC—MS／MS蛋白质组 技术的首例大规模果蝇 蛋白质组学研究成果 ，选取 果蝇 卵 、幼虫 、蛹和成虫等 4个发育阶段及 Kc167和 S2等 2个细胞系作为研究 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 ，在多种蛋 白提取分 离鉴定技术的支持下 ，经若干次重复试验 ，共鉴定到 9124个 蛋 白，对应 8672个基 因，成 为迄今最大规模 的果蝇蛋白质组研究。 组织特异和亚细胞水平的蛋 白质组学研究是蛋 白质组学领域中的一支新生力量 。它一方面降低样 品的复杂度，使分析简单化；另一方面可以相对富集 相应亚细胞结构的低丰度蛋 白，而且可以部分提示 蛋 白质 的定位和功能信息 ，成 为蛋 白质鉴定及其功 能研究 的纽带。由于果蝇这个多细胞生物的复杂 的 发育过程、丰富的行为学特征及不断改进的多种策 略和技术方法 ，其亚细胞蛋 白质组学研究进展非常 迅速 ，一些重要 的亚细胞结构 的蛋 白质组不断得到 分析，并 已深入到亚细胞器和复合体水平。Was— brough等 利 用 LC—MS／MS的方 法分离分析了果蝇 精子蛋白质组 ，获得了包含956个精子相关蛋白的 数据集。Muller等” 分析了果蝇胚胎中心体的蛋白 质组学研究 ，共鉴定到蛋白251个。Khanna等“ 利 用相似方法研究 了质膜蛋 白质组 ，鉴定了 432个蛋 白。Cammarato等㈣也利用该方 法对 145个果 蝇心 脏组织进行蛋 白质组分离分析 ，共鉴定了 1228个相 关蛋白质。不但如此，亚细胞蛋白质组还向更深方 向发展 。Anholt等 。1以果蝇触角为研究材料 ，初步探 索 了果蝇 的可溶性蛋 白质组 ，发现 了 100多个相关 蛋白。这些有益的尝试都加深了我们对蛋白质在特 异组织及细胞 内的特异表达 、转运、定位及其生物学 功能的理解 。 3 果蝇蛋白质组修饰谱 蛋 白质翻译后修饰在生命活动中起着十分重要 的作用，它使蛋白质的结构更为复杂、功能更为完 善、调节更为精细、作用更为专一。研究较多的果蝇 的蛋白质翻译后修饰形式主要是磷酸化、泛素化、糖 基化、类泛素化及组蛋白的甲基化。在体内，各种翻 译后修饰过程不是孤立存在的 ，而是相互作用 、共 同 调节的 3．1 磷 酸化 修 饰 蛋 白质磷酸化修饰涉及细胞信号传导 、神经活 动 、肌 肉收缩及细胞的增殖 、发育和分化等生理 、病 理 过 程 ，在生 命 活动 发展 中发 挥 着 巨大 的作 用 。 Zhai等 ”利用一套完整 的磷 酸化 富集和鉴定体系 ， 包括强阳离子交换色谱、金属离子亲和色谱和高精 度的质谱体系，在果蝇的胚胎中共鉴定到l3 720个 磷酸化位点 ，来 自2702个蛋 白 ，建立 了当时规模最 大的果蝇磷酸化数据集。在果蝇的蛋 白质磷酸化修 饰的蛋白质组学研究 中 ，人们致力于不断提高磷酸 肽的富集效率和质谱 的鉴定水平 ，以此提高果蝇蛋 白质组的磷酸化修饰谱。Pinkse等 利用基于二氧 化钛富集的二维色谱方法，使果蝇S2细胞系的磷酸 肽鉴定量与仅借助SCX相比翻了4番，高达2152个， 大大加强 了磷酸肽的富集效果 。Bodenmiller等[231不 但通过改进磷酸肽的富集方式将果蝇Kc167细胞系 的磷酸肽 的鉴定从 299提高到494个 ，并且经 MS3质 谱谱图的确认，提高了鉴定的可信度，也将磷酸化肽 的鉴定数 目提高到 505个 ，其 中25个蛋白(5％)都是 这种新方法单独鉴定的结果。这一尝试使果蝇的磷 酸化 蛋 白质组学研究有 了巨大飞跃 。另外通过将 ETD和CID结合，进一步提高了果蝇Kc167细胞系 磷 酸化肽 的鉴定率 ，其中 ETD单独鉴 定了 153个磷 酸肽。这与提高磷酸肽富集效率的方法异曲同工， 对 果蝇 修饰 蛋 白质 组 的鉴定做 出了 巨大贡献 [24]o Courcelles等 ’发 明了一种算法 ，可以鉴定磷 酸肽 的 同分异构体 ，在果蝇 的磷酸化蛋白质组鉴定 中共得 到 15 700个磷酸肽 ，证明了在LC—MS的洗脱层面有 8％～12％的磷酸肽都含有同分异构体。 3．2 泛素化和类泛素化修饰 蛋 白质泛素化和类泛素化修饰对于蛋白质的定 位 、代谢 、功能 、调节和降解起着重要作用。随着蛋 白质翻译后修饰研究 的不断深入 ，蛋白质泛素化 的 新 的功能不断被挖掘 ，包括参与细胞周期 、增殖 、凋 亡、分化、转移、基因表达、转录调节、信号传递、损伤 修复、炎症免疫等几乎一切生命活动的调控，并且在 肿瘤、心血管等疾病发病中起十分重要的作用，是近 年来生物化学研究的一项重大成果 ，亦是研究 、开发 新药物的新靶点。Franco等 利用蛋白质组学策 略，在果蝇的胚胎细胞 中鉴定到 48个神经细胞特异 的泛素化底物。更为重要 的是 ，这些泛素化底物都 是首次被鉴定到 ，并且没有任何 同源 的蛋 白质具有 泛素化的证据 ，说明这种蛋 白质组学方法鉴定的神 经 细胞 的泛素 化底物 并不 与其他细 胞类 型共 有 。 Nie等[271在果蝇的早期胚胎细胞中鉴定到140个早期 类泛素化底物 ，并且验证 了这些底物分别参 与细胞 周期调控 、Ras信号通路和早期形体形成过程。类 718 TT 技 术 通 讯 v 0l_24 N 。．5 Sep．,201 3S IN B10TECHNOLOGY P LETTER V 0l- 斗 o·J 泛素化蛋白质组学数据集的产生 ，为以后研究类泛 素化的功能提供了便利。Xu等 发展了一种果蝇近 乎全标记 的SILAC方法 ，并发现果蝇在成虫期 随年 龄的增长 K48和 K63泛素链具有不 同的变化趋势 ， 表明蛋白质的泛素化及其状态和生物寿命相关。 3．3 组蛋 白修饰 组蛋 白上 的翻译后修饰 主要有4种情况 ，即乙 酰化 、磷酸化 、甲基化和ADP一核糖基化。甲基化和 乙酰化与转录调节有关 ，特别是组蛋 白乙酰化对于 哺乳动物生物钟 的调控是非常重要 的[291 o Ardehali 等 。-通过多线染色体染色和活细胞成像技术，首次 发现 了一种位于启动子区域的负责组蛋白H3K4三 甲基化的蛋白dSetl。该蛋 白依赖的H3K4三甲基化 负责染色体结构的形成 ，并保证 RNA聚合酶 Ⅱ的合 成供给 ，进而完成对转录活性的调节。 Imhof等 发现组蛋白H1的修饰形式随多细胞 生物的不 同生长阶段而变化 。以果蝇胚胎为例 ，S10 期的H1单磷酸化丰度明显 比胚胎期的少 ，说明翻译 后修饰与细胞周期和细胞分化相关。这是首次在果 蝇 中进行组蛋 白的翻译后形式的鉴定 ，为后续研究 提供了依据。 乙酰化对基因表达的调控已广为人知。这一新 的研究更让人们确定组蛋 白的乙酰化对基因表达的 调控具有广泛的作用 ，而果蝇 可以作为很好的模 型来验证这一论断 ，进而推动组蛋 白修饰在生命 发 展过程 中发挥更加积极 的作用。 4 果蝇比较蛋白质组 蛋 白质组具有动态 、多样和时空特异性 。即使 在细胞发育的不 同阶段 ，因不 同时期 、不同条件 ，蛋 白质组 的构成也不断地变化 。因此 ，分析 比较不 同 条件下蛋 白质组 的变化和差异 ，发现和鉴定在不 同 生理条件下蛋白质组中的差异组分 ，从 中揭示生命 的奥秘 ，这些构成了 比较蛋 白质组 学的研究 内容 。 然而 ，比较蛋 白质组学研究 由于并 不要求捕获“全 部”蛋 白，而重在找出有意义 的差异蛋 白，因而在技 术上有着相当高的可实现性。 目前常用的方法主要 分为有标定量(1abeling quantitation)和无标定量(1a。 bel—free quantitation)2类 。有标定量又可分为化学 标记方法 [如 同位素标记 的亲 和标 签(isotope—cod． ed affinity tag，ICAT)、串联质谱标签(tandem mass tag，TMT)、同位素相对标记与绝对定量技术 (isobar— ic tagging for relative and absolute quantitation， iTRAQ)]和代谢标记方法[(细胞培养氨基酸稳定同 位素标 记 (stable isotope labeling with amino acids in cell cuhure，SILAC)、”N代谢标记方法][33]o目前 果蝇 中应用较广泛的有 N标记 、SILAC、iTRAQ及无 标定量方 。 4．1 N标 记方 法 2003年 Krijgsveld等 0首次提出 了果蝇全蛋 白 质组的代谢标记策略。用只含 N的培养基标记酵 母 ，再 以此喂养生长在以这些标记酵母为惟一氮源 的培养基中的果蝇卵，经质谱鉴定发现 ”N的标记效 率约为95％，证明果蝇可通过 1个世代得到几乎完 全的标记 。Findlay等 利用该技术研究 了果蝇交配 时精液蛋白对生殖的影响，发现了 19个原先没有注 释的基因。这种代谢标记和非标记果蝇可在蛋 白样 品抽提前混合 ，因此可 以极大地减少样品操作过程 引起 的误差。缺点是不同肽中标记的氮原子数 目不 同，致使标记与非标记肽的相对分子质量位移在鉴 定前不能预测，且标记肽段形成宽泛的同位素峰分 布，增加了蛋 白质鉴定中的假阳性率和定量的难度。 4．2 SILAC标记 方 法 与 N标记方法不同，SILAC标记是利用重稳定 性同位素标记的氨基酸在生长过程中对 目标蛋 白质 组进行标记 。这种标记和非标肽段的相对分子质量 位移是可以提前预测的，并且随后 的蛋白质分离 、酶 切 、鉴定等所有过程都在 同一条件下进行 ，误差小 ， 重复性好 ，因此逐渐取代 N标记方法而成为现阶段 同位素代谢标记的金 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 。Bonaldi等 利用ISWI 基因缺陷型果蝇模型和对照组的SILAC方法标记果 蝇 SL2细胞 系，用 LTQ—Orbitrap质谱 仪鉴定到4l19 个蛋 白，同时得到了因ISWI基 因表达水平的改变而 引起的几百个在转录组和蛋白质组水平表达产生显 著差异 的蛋 白。Sury等 报道 ，在果蝇 中SILAC标 记的效率可 以达到近 100％，为果蝇的SILAC标记提 供了更广阔的应用空间。Xu等 也利用赖氨酸重标 酵母的方法对果蝇进行了近乎完全的标记 ，并在果 蝇 的泛素化蛋 白质组研究 中得 到良好 的应用 ，为果 蝇翻译后修饰蛋白质组的研究奠定了坚实基础。 4．3 ICAT标记 方 法 ICAT是 由Gygi等 开发 的一种 同位素亲和标 签标记和定量蛋 白质组学研究策略。该方法通过在 蛋 白水平分别加入不同标记的ICAT试剂 ，反应后等 比例混合进行消化和质谱分析。实践表明ICAT试 剂存在一些不足 ，如不能分析半胱氨酸缺失的蛋 白 质 、标记和非标记肽不能被同步洗脱 、难于精确定量 等。另外 ，ICAT标签试剂本身的相对分子质量约为 500，增加了谱图和数据库搜索的复杂性 。为解决这 些技术上 的缺陷，先后又开发了可剪切 ICAT(eleav— able ICAT，cICAT)试剂 ，用可被酸剪切的官能团代 替ICAT试剂中的聚醚链接 ，以此减少难 以解析的碎 片离子数量 ；以9个 C取代 8个氘原子 ，使轻 、重 同 邢晓华等：果蝇蛋白质组学研究进展 719 位素试剂相对分子质量相差 9，不仅便于质谱分辨 不同分子质量的标签 ，而且使得轻 、重肽段可被色谱 共洗脱 ，有效提高 了定量精度。Kohler等⋯ 用 cICAT 标记方法检测了普通幼虫期果蝇和饥饿状态下的脂 肪体蛋 白质 的表达变化 ，监测到脂肪脱氢 酶 Desat1 缺失时果蝇幼虫细胞在丧失饥饿状态下的 自我吞噬 的功能 ，首次揭示 了Desatl在脂滴形成和 自体吞噬 中的作用 。这种 cICAT标记试剂 的缺点是合成成本 太高 ，难 以普及使用 。 4．4 iTRAQ标记方法 iTRAQ标记是化学标记的一种 ，可同时标记并 比较 8种不同样本 ，提 高了分析通量。Pflieger等 使用iTRAQ技术对蛋白磷酸酶处理后果蝇细胞系进 行研究 ，通过比较蛋 白质的磷 酸化状态 ，发现了胰 岛 素受体的同源序列Chico。Pedersen等 为了检测果 蝇中的温度敏感致死因子，采用iTRAQ技术对实验 组 、近交系对照组 和远交系对照组进行不同的化学 标签标记 ，经二维液相色谱一串联质谱分析 ，共鉴定 到 45个在 实验组 和近交 系对照组发生 了明显变化 的可能的温度敏感蛋白，这些蛋 白在近交系和远交 系对 照组 中并没有发生显著的量的变化 ，进一步证 明了这些温度敏感差异蛋白的真实性 。但这种标记 方法要求对比较的蛋白组必须进行提取、蛋白酶消 化和脱盐处理等多个步骤，然后才能进行标记 、混合 和质谱鉴定 、定量 。这会引入试验误差 ，增加 了发现 真实的生物学差异蛋 白的难度。 4．5 无标 定量 方 法 无标定量方法不进行任何标记 ，而是直接利用 质谱鉴定中产生的数据，比如样品酶切后经LC—MS／ MS产生的质谱数据对蛋白样品进行定量比较。这 种方法简便易行，在果蝇定量蛋白质组学研究上也 得到了广泛应用。Xun等 利用该方法分析了帕金 森病果蝇模型 的蛋 白质组 ，在 A53T 仅一突触核蛋 白 果蝇模型中鉴定 、定量了253个蛋 白，并在重叠 区域 筛选到 24个表达差异蛋 白。这些蛋 白主要与膜 、内 质网、肌动蛋 白细胞骨架 、线粒体和核糖体相关。 Xun等 将无标定量 和广泛型内标技术相结合 ，定量 了青 少年型帕金森病果蝇模 型(AR—JP)，共定量 了 375个蛋 白。其 中 16个蛋 白具有显著的表达差异 ， 参与能量代谢的失调蛋白有7个 ，并有6个表达下 调 ，说 明青少年型帕金森病和能量代谢有较高 的关 联性 ；参与蛋 白转运活动的 5个蛋 白均表现 出较高 的水平 ，如幼虫血清蛋白1 o【、1B、17和脂肪体蛋白1 均显示出高于 1O倍的上调水平。尽管同位素标记 已成为可信赖的定量方法，但准备同位素化合物需 大量 时间，并且试剂昂贵 ，难 以推广 ，而非标定量法 不存在这些缺点 ，应用前景广阔。但非标定量法对 样品制备和分析过程 的控制要求较高 ，否则难 以得 到可信的结果。 5 果蝇疾病模型蛋 白质组 近一个世纪以来 ，果蝇作 为生命科学领域 的一 种理想的模式生物，在生物学研究的舞台上占有举 足轻重的地位。十几年前完成的果蝇 的基因组测序 结果显示 ，超过60％的人类疾病基因在果蝇的基因 组 中有直 系同源物 ，其 中人类 的肿瘤 、神经疾病 、畸 形综合征 等相关基因多与果蝇基 因同源。因此 ，以 果蝇为模式研究人类疾病 的发病机制有非常重要的 意义 。 Xun等 利用液相色谱 和质谱联用技术 ，对 A30P仅一突触核蛋 白转基因果蝇和对照的早期帕金 森病 果蝇模 型进行 了蛋 白质组研究 ，结果 显示约 44％的基 因在转 录水平 和蛋 白质水平均 发生 了改 变，但变化趋势不完全一致。蛋白质组研究弥补了 转录本研究的不足，对后期疾病状态的预测有较大 的帮助 。他们在该研究 中还发现 ，早期 的细胞骨架 和线粒体差异蛋白主要与神经退化相关。 Belier等 比较了野生 型和脂肪储存缺 陷型果 蝇的脂肪滴成分的差异 ，在鉴定到的248个蛋 白中， 除了发现与脂肪滴相关的PAT蛋 白外 ，还鉴定 了参 与蛋 白质胞 内定位和多层面转运的一些相关蛋 白。 Li等 利用 2一DE技术研究 了经饮食抑制剂 BBI处 理后果蝇胚胎 中肠蛋 白质组的变化 ，发现 了9种表 达差异蛋白，例如固醇载体蛋白SCPX参与了脂肪酸 代谢过程。脂滴和脂肪酸代谢直接介导肝脏脂质代 谢 ，是肝病发生和发展的主要成 因，这为人类肝脏疾 病的研究提供了依据。 Chan等 利用果蝇模型研究了VCP基因引起 的 额 颞 叶痴 呆病 (IBMPFD)的 比较 蛋 白质组 。利 用 2D—DIGE方法在转基 因果蝇模型中鉴定了43个蛋 白点 ，并发现 VCP的突变消耗了大量ATP，为节约能 量 ，导致 肌动蛋 白关 闭，由此激活 ROS信号通路 ，进 而引发细胞凋亡 。这是蛋 白质组学在探索IBMPFD 分子机制方面的新发现 ，为发病机理 的研究 和治疗 靶点的寻找提供了有力证据。 6 结语 利用果蝇进行遗传学研究 的历史悠久 ，对其染 色体组成、编码基因、蛋白质定位和表型等的详细阐 明都是其他生物无法比拟的。百余年的研究也积累 了很多果蝇的相关知识与信息，制备了大量分布于 数以千计的基因中的突变体 ，为构建果蝇的各种疾 720 生 物 技 术 通 讯 LETTERS IN B10TECHNOLOGY Vo1．24 No．5 Sep．，2013 病模型奠定了基础 。随着蛋 白质组学技术的发展 ， 果蝇还将继续作为重要的模式生物被广泛用于生命 科学的各个研究领域 。这为开展与疾病相关的临床 蛋 白质组学(clinical proteomics)研究 ，揭示生命 的 奥秘和疾病发生发展的分子机制奠定坚实的基础。 参考文献 [1 J Belier M，Oliver B．One hundred years of high—throughput Drosophila research[J]．Chromosome Res，2006，14(4)：349—362． 【2】 Bier E．Drosophila，the golden bug，emerges as a tool for hu‘ man genetics[J]．Nat Rev Genet，2005，6(1)：9—23． f3] Chien S，Reiter L T，Bier E，et a1．Homophila：human dis— ease gene cognates in Drosophila[J]．Nucleic Acids Res，2002， 30(1)：149—151． [4] Adams M D，Celniker S E，Holt R A，et a1．The genome se- quenee of Drosophila melanogaster[J]．Science，2000，287(5461)： 2l85—2l95 【5] Grumbling G，Strelets V．FlyBase：anatomical data，images and queries[J]．Nucleic Acids Res，2006，34(Database issue)： D484-D488． 【6】 Mushegian A R，Garey J R，Martin J，et 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