分子杂交

*分子杂交MolecularHybridization分子杂交 分子杂交（molecularhybridization）分子生物学中用于检测生物样本中是否含有特定的生物分子的一门技术。分子杂交分类支持物不同 概念：参加反应的一条核酸链被预先固定在固体支持物上，另一条反应核酸则游离在溶液中进行的杂交反应。 固相支持物：硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、乳胶颗粒、磁珠、微孔板，芯片等固相杂交 分类：①杂交后，游离片段容易经漂洗除去；菌落原位杂交、斑点杂交、狭缝杂交、Southern印迹杂交、Northern印迹杂交、组织原位杂交和夹心杂交等。 固相杂交的特点：②支持物上留下的杂交物容易检测；③能防止靶DNA自我复性。因此，该法最为常用。液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液中。 定义：杂交后溶液中过量的未杂交探针难以除去，误差较高。应用不广。 特点：分子杂交分类 SouthernBlot----DNA杂交 NorthernBlot----RNA杂交 WesternBlot----蛋白质杂交核酸分子杂交分子杂交流程图样品制备电泳杂交转膜结果显示探针/抗体制备按片断长短进行分离凝胶中的片段转移到固相支持物DNA/DNADNA/RNA抗原/抗体提取DNA/RNA/蛋白放射自显影荧光检测显色技术ProtectionofINS-1CellsFromFreeFattyAcid–InducedApoptosisbyTargetinghOGG1toMitochondriaRacheket.al,Diabetes,2006STORYBACKGROUNDPancreaticbetacell Chronicexposuretoelevatedlevelsoffreefattyacids(FFAs)impairspancreaticcellfunctionandcontributestothedeclineofinsulinsecretionintype2diabetes. FFAsdamagedmitochondrialDNA(mtDNA)andultimatelyledtoapoptosisinINS-1cells.STORYBACKGROUNDHuman8-oxoguanineDNAglycosylase/apuriniclyase(hOGG1)糖基化酶hOGG1是细胞修复DNA氧化损伤特异性产物8-羟基鸟嘌呤(8-OHdG)的重要酶类IntegrateMTS-OGG1intotheINS-1cellulargenomeWHATDIDTHEYWANTTODO?MTS-OGG1–transfectedINS-1cellsMitochondrialtargetingsequence(MTS) MTS-OGG1cellsshowedasignificantdecreaseinFFA-inducedmtDNAdamagecomparedwithvector-onlytransfectants. hOGG1overexpressioninmitochondriadecreasedFFA-inducedinhibitionofATPproductionandprotectedINS-1cellsfromapoptosis.RESULTHowtoidentifyhOGG1expressioninmitochondriaofINS-1cells?A:SouthernblotanalysisusingtheMTS-OGG1sequenceasaprobe.B:WesternblotanalysisusinghOGG1antiserum.Immunodetectionofcytochromecwasperformedtoassuremitochondriallocalization.SouthernblotWesternblotamtDNA-specificprobeNeuronatin,aDownstreamTargetofBETA2/NeuroD1inthePancreas,IsInvolvedinGlucose-MediatedInsulinSecretionKhoiChu,Diabetes,2005 BETA2(NeuroD1)isamemberofthebasichelix-loop-helixtranscriptionfactorfamily.BETA2playsanimportantroleinthedevelopmentofthepancreasasaregulatoryfactorforthetranscriptionoftheinsulingene. Usingmicroarraytechnology,neuronatin(Nnat)wasidentifiedasdifferentiallyexpressedbetweenwild-type(WT)andknockout(KO)pancreaticRNAfromembryonicday14(e14.5).STORYBACKGROUNDWHATDIDTHEYWANTTODO?confirmthedownregulationofNnatinpancreasofmutantBETA2embryosHowtodo?NorthernblotandinsituhybridizationRESULT35Sor33P-UTPlabeledprobesaprobeencodingforGLUT2,amarkerforendocrinecellsinthepancreasinsituhybridizationNnattranscriptswereabsentfromKORNAsamplesate16.5.Thisdecreasewasparalleledbyamarkedreductionininsulinandglucagontranscripts,twoknowntargetgenesofBETA2,whereastheexpressionoftheexocrinemarkeramylasewasunaltered.RESULTNorthernblot*核酸分子杂交一、核酸分子杂交（nucleotidemolecularhybridization） 指具有一定同源序列的两条核酸单链（DNA或RNA），在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后，形成异源双链的过程核酸分子杂交过程一般需要经历了核酸的变性和复性两个阶段。DNA的变性（denaturation）DNA分子在某些理化因素的作用下，其两条互补链之间的氢键发生断裂，双螺旋结构松开分成两条单链。变性DNA的两条互补单链，在适当条件下,重新结合恢复双螺旋结构的过程，称为DNA的复性。DNA的复性（renaturation）核酸经加热变性后，在低于变性温度20℃~30℃时，反应系统中加入的核酸探针与待测核酸样品中具有互补序列的单链DNA或RNA形成双链结构，通过检测标记信号即可检测特定的核苷酸片段。核酸分子杂交技术原理 热变性 酸碱变性核酸溶液pH<3或>10时，核酸分子的双链完全打开。常用碱变性法。 化学试剂变性常用的化学试剂有：尿素、甲酰胺、甲醛等。常用变性方法二、核酸探针核酸探针（nucleicprobe）:带有可检测标记，能与特定序列的核酸片段互补配对形成双链的一段核苷酸。核酸探针的质量（标记效率和特异性）是核酸分子杂交成功的关键。核酸探针的分类 根据标记物的性质分： 放射性标记:32P,35S,125I,3H。 非放射性标记：化学发光标记、酶标记、荧光标记等 放射性核素：核酸探针传统的标记物优点： 灵敏性高：0.5～5pg特异性高：放射自显影法 方法简便。 缺点：半衰期短，必须经常标记探针（3H的半衰期长达12.3年，但它所释放β放射线能量太低，只能用于组织原位杂交）费用高检测时间长：曝光时间1～15天放射性同位素对人体有害，实验室和环境易被污染 非放射性标记物优点：无放射性污染； 稳定性好； 探针可长时间保存。 缺点：灵敏度及特异性不高。 非放射性标记物的种类 半抗原：地高辛，利用半抗原的抗体进行免疫学检测。  配体：生物素，是一种抗生物素蛋白avidin和链亲和素streptavidin的配体。  荧光素：异硫氰酸荧光素和罗丹明，可被紫外线激发出荧光而被检测到。 光密度或电子密度标记物：金、银。 根据探针中核酸的性质分：DNA(包括cDNA)探针RNA探针(包括cRNA)寡核苷酸探针肽核酸（peptidenucleicacid,PNA）探针(1)DNA探针（包括cDNA探针）：①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。②DNA探针不易降解（相对RNA而言）。③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，能用于同位素和非同位素标记。(2)RNA探针：主要是细胞mRNA和病毒RNA探针。 RNA探针和cRNA探针的特点：RNA:DNA杂交体比DNA:DNA杂交体有更高的稳定性。杂交反应效率高、易于降解、标记方法复杂。用途：用于检测DNA和mRNA，以及研究基因 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达中的转录。 cRNA探针：以双链DNA中与mRNA序列相同的一条链为模板转录得到的RNA链，其序列与mRNA互补，也称为反义RNA。采用化学合成的短链核苷酸探针,最常用的寡核苷酸探针有18--40个碱基。(3)寡核苷酸探针特点：①链短、序列复杂度低、分子量小，与等量靶位点完全杂交的时间短。②寡核苷酸探针可识别靶序列内1个碱基的变化。③一次可大量合成寡核苷酸探针，使得这种探针价格低廉。探针 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 的条件①被检基因结构清楚；②有明确的基因产物;具备下列条件之一，就可以设计、制备特异性基因探针。核酸探针的常用标记方法核酸探针的标记几乎总是先将脱氧单核苷酸底物标记相应的信号，然后利用核酸合成的方法合成具有标记信号的核苷酸链。 缺口平移法（nicktranslation） PCR法 DNA快速末端标记 T4多核苷酸激酶标记DNA5’末端 随机引物延伸 放射性探针的标记由DNaseⅠ和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ共同完成。DNaseⅠ：在双链DNA上随机打开若干个单链缺口，产生3’-OH端大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ：5’→3’DNA聚合酶活性；5’→3’外切核酸酶活性（1）缺口平移标记法（nicktranslation）随机引物：含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段的混合物。46=4096DNA聚合酶ⅠKlenow片段5’→3’DNA聚合酶活性弱3’→5’外切核酸酶活性无5’→3’外切核酸酶活性（2）随机引物法（randompriming） 产物平均长度为400-600个核苷酸。 Klenow片段没有5’→3’外切酶活性,反应稳定,可以获得大量的有效探针。 反应时对模板的要求不严格,用微量制备的质粒DNA模板也可进行反应。制备高比活性探针(1010cpm/μgDNA);Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：1、取25～50mg模板DNA于0.5ml离心管中，100℃水浴5min，立即置冰浴。2、在另一个0.5ml离心管中加入：Labeling5×Buffer(含随机引物)10μldNTPmix(含dCTP.dGTP.dTTP各0.5mmol/L)2μl[α-32P]dATP3μlKlenow酶5U3、将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl混匀。室温或37℃1h.4、加50μl终止缓冲液终止反应标记后的探针可直接使用或过柱纯化后使用。由于α-32P的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。（3）末端标记法T4DNA聚合酶5’→3’聚合酶活性，1500nt/min,为polI的两倍3’→5’外切酶活性，可作用于ssDNA和dsDNA,其切除速度分别为40和4000nt/min适用于合成寡核苷酸探针的标记，用末端标记制备的探针一般携带的标记分子较少。 放射自显影利用放射线在X线片上成影作用来检测杂交信号*杂交信号检测非放射性探针的标记 生物素标记核酸（光敏生物素、酶促生物素） DNA半抗原标记 荧光素标记以生物素化的脱氧核苷三磷酸（Bio-11-dUTP,Bio–7–dATP、Bio-11-dCTP）等代替相应脱氧核苷三磷酸，经DNA聚合酶作用掺入新合成的DNA。可以采用缺口平移法和随机引物延伸法进行。生物素标记法基本原理：地高辛（Digoxigenin，DIG）是一种类固醇半抗原，来源于植物(Digitalispurouren和Digitalislanta)的花和叶中，其他生物体中不含有地高辛抗体。DIG可以与dUTP反应形成DIG-dUTP，通过酶促法插入到合成的DNA探针中。通过酶标记的抗地高辛抗体来实施检测。DNA半抗原标记——地高辛标记原理： 非放射性核素探针的检测偶联反应半抗原:通过抗原-抗体反应与显色体系偶联。配体:亲和法与显色体系偶联：生物素-抗生物素蛋白-酶（Avidin-Biotin-Enzyme-Complex，ABC）  显色反应通过连接在抗体或生物素蛋白的显色物质如酶、荧光素等进行杂交信号的检测。  酶学检测 通过酶促反应使底物形成有色产物。辣根过氧化物酶（HRP）和碱性磷酸酶（AKP）荧光检测 异硫氰酸荧光素（FITC）和罗丹明（Rho)，可被紫外线激发出荧光而被检测到。主要应用于原位杂交。 化学发光法 在化学反应过程中伴随的发光反应。适合于Southern、Northern及斑点杂交。 电子密度标记利用重金属的高电子密度、在电子显微镜下进行检测，适合于细胞原位杂交。显色反应DAB辣根过氧化物酶显色试剂盒(DABHorseradishPeroxidaseColorDevelopmentKit)DAB，3,3N-DiaminobenzidineTertrahydrochloride辣根过氧化物酶的常用底物。辣根过氧化物酶催化，DAB会产生棕色沉淀。BCIP/NBT碱性磷酸酯酶显色试剂盒(BCIP/NBTAlkalinePhosphataseColorDevelopmentKit)BCIP/NBT是碱性磷酸酯酶的常用底物。在碱性磷酸酯酶的催化下，BCIP会被水解产生强反应性的产物，该产物会和NBT发生反应，形成不溶性的深蓝色至蓝紫色的NBT-formazan。化学发光法生物素标记核酸检测试剂盒通过Streptavidin-HRP及后续的ECL试剂来实现化学发光检测Biotin标记核酸的检测试剂盒。(ChemiluminescentBiotin-labeledNucleicAcidDetectionKit)Biotin-Streptavidin-HRPDNABiotin-probeStreptavidin-HRP常用杂交方法介绍基本原理：1975年由英国人southern创建，是研究DNA图谱的基本技术，在遗传病诊断、DNA图谱 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 及PCR产物分析等方面有重要价值。DNA标本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳分离各酶解片段，然后将DNA从凝胶中转印至滤膜上与探针杂交。通过检测与探针互补DNA条带来确定在众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。Southern印迹杂交（SouthernBlot）SouthernBlot操作流程1、基因组DNA的提取2、限制性内切酶切断DNA3、电泳分离DNA片段,变性4、将DNA转移至尼龙膜;5、尼龙膜洗涤、固定；6、预杂交、与探针杂交；7、成像或显色。1、酚抽提法提取基因组DNA SDS使组织蛋白与DNA分子分离 蛋白酶K消化分解蛋白质 酚、氯仿/异戊醇抽提除去蛋白质， 乙醇沉淀纯化DNA 加入EDTA能抑制DNase的活性，RNase除去RNA，此法可获得100~200kb的DNA片段。2、限制性内切酶切断DNA 基因组DNA很长，需要将其切割成片段后用于杂交分析。 一般选择一种限制酶来切割DNA分子。 有时可采用部分和充分消化相结合的方法获得一些具有交叉顺序的DNA片段。 消化DNA后，加入EDTA，65℃加热灭活限制酶。 样品可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品。3、琼脂糖凝胶电泳和碱变性 先将DNA样品(含不同大小的DNA片段)先按片断长短进行分离，然后进行杂交。 琼脂糖凝胶电泳可分辨70－80000bp的DNA片段制备琼脂糖凝胶，尽可能薄。DNA样品与上样缓冲液混匀，上样。 DNA样品在制备和电泳过程中始终保持双链结构 为了进行有效地实现Southern印迹转移，必须将最长的DNA片段控制在大约2kb以下。DNA的大片段必须被打成缺口以缩短其长度。 通常是将电泳凝胶浸泡在0.25M的HCl溶液短暂的脱嘌呤处理，移至碱性溶液中浸泡，使DNA变形并断裂形成较短的单链DNA片段，再用中性PH的缓冲液中和凝胶中的缓冲液。4、将DNA转移至尼龙膜将凝胶中单链DNA片段转移到固相支持物上。注意保持各DNA片段的相对位置不变。用于转膜的固相支持物有多种，包括硝酸纤维素膜（NC膜）、尼龙（Nylon）膜、化学活化膜和滤纸等。a．处理膜时应戴手套并用平头镊子操作，膜切角。b．去离子水完全湿润膜，浸入变性转移液至少5分钟。c.制作转印“三明治”，用玻璃棒赶出其间滞留的气泡。d.DNA转移持续进行8-24小时。重物玻璃板吸水纸滤纸NC滤膜凝胶滤纸支持物转移缓冲液 毛细管虹吸转移法 电转移法 真空转移法-1h5．膜的洗涤、固定1）膜置于0.5MTris·Cl（pH7.2）、1MNaCl中，室温浸泡15分钟，除去粘附的琼脂糖。2）将膜平铺于一张纸巾上，室温干燥30分钟以上。3）DNA固定：在真空烧箱或普通烘箱内于80℃烘烤0.5－2小时。6.探针标记和预杂交预杂交：将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭。预杂交液：含有鲑鱼精子DNA（该DNA与哺乳动物的同源性极低，不会与DNA探针DNA杂交）、牛血清等。southern印迹杂交实验仪器 用杂交袋封装。 每平方厘米NC膜需预杂交液0.2ml。 变性的鲑鱼精DNA置终浓度200μg/ml。 鲑鱼精DNA置沸水浴中10min，迅速置冰上冷却1-2min，使DNA变性，保持单链。 42℃水浴中温育4h。7、杂交、洗膜加入标记的探针DNA（预先热变性成为单链DAN分子）。杂交是在相对高离子强度的缓冲盐溶液中进行，杂交过夜。然后在较高温度下用盐溶液洗膜。离子强度越低，温度越高。（一）将滤膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏）。（二）在暗室内，将2张X光底片放入曝光暗盒，并用透明胶代固定，合上暗盒。（三）将暗盒置-70℃低温冰箱中使滤膜对X光底片曝光（根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天）。8、放射性自显影检测（四）从冰箱中取出暗盒，置室温1-2h，使其温度上升至室温，然后冲洗X光底片。Southernblot是研究DNA图谱的基本技术，在遗传诊断、DNA图谱分析及PCR产物分析等方面有重要价值。 Southernblot的应用血迹中的DNA DNA指纹分析从DNA转录成mRNA*Northern印迹（NouthernBlot） Northernblot是在变性条件下将待检RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同SouthernBlot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。定性分析mRNA的常用方法。 用于分析基因转录与否以及转录水平的变化，比较两个或以上不同组织或细胞某一已知基因转录水平的差异注意：A甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性,不能用NaOH（会使RNA水解）。B样品RNA变性后进行电泳分离。C转印后，烘烤固定前不能用低盐缓冲液洗D胶中不能加EB（影响RNA与硝酸纤维素膜的结合）甲醛变性电泳： RNA变性，消除RNA中的二级结构，保证RNA完全按照分子的大小分离。 DEPC水处理电泳槽，去除RNA酶。 在通风橱中加入甲醛，放置一段时间以减少甲醛蒸汽。进样前用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛使RNA变性RT-PCR RT-PCR是以mRNA为模板反转录合成cDNA、再以cDNA为模板进行特异性扩增，进行RNA定性或定量分析的一种方法原理通过合适的引物，将细胞内的RNA（一般为mRNA)逆转录成cDNA然后，通过PCR技术，将痕量的cDNA扩增成大量的双链DNA。获得的dsDNA可通过测序获得目的基因，也可用于基因操作。三、斑点杂交（Dotblot） 核酸样品变性后直接点样于滤膜上，固定标本，与探针进行杂交可做半定量分析。基因芯片（Genechip）/DNA芯片（DNAchip）： 1995年斯坦福大学SchenaM和BrownPO等发表第一篇基因表达阵列芯片，之后国内外兴起了一股微点阵（microarrays）技术——基因芯片的浪潮。 基因芯片是将各种“探针”固定在基质上，用于检测受检的各种标记样品中与探针互补的核酸物质的变化。基因芯片（genechip），也叫DNA芯片(DNAchip)技术是指通过微阵(Microarray)技术将高密度DNA片段通过高速点样机器人或原位合成方式以一定的顺序或排列方式使其附着在如硅片、膜、玻璃片等固相表面，以同位素或荧光标记的DNA待测样品，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的技术。基因芯片的定义“探针”：载玻片或尼龙膜表面的寡核苷酸“样品”：标记了荧光或同位素待测靶核酸——DNA、cDNA或RNA基因芯片 工作流程 财务工作流程表财务工作流程怎么写财务工作流程图财务工作流程及制度公司财务工作流程 将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同个体、不同组织、不同细胞周期、不同发育阶段、不同分化阶段、不同病变、不同刺激（包括不同诱导、不同治疗手段）下细胞内的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异性。进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。原位杂交（insituhybridization，ISH） 原位杂交（insituhybridization，ISH）即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术； 可用于基因及其表达产物的定位分析。可在细胞涂片、组织切片以及分裂中期染色体带中检测DNA或RNA基本原理在细胞或组织结构保持不变的条件下，用标记的已知的核苷酸片段，按核酸杂交中碱基配对原则，与待测细胞或组织中相应的基因片段相结合（杂交），所形成的杂交体经显色反应后在光学显微镜或电子显微镜下观察其细胞内相应的核酸分子。*荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization,FISH）荧光标记的探针* 细胞或组织的固定 组织细胞杂交前的预处理 制备探针 杂交 杂交结果的检测流程Whole-mountinsituhybridizationlocalizing Pax6 mRNAinearlychickembryos从RNA翻译成蛋白质蛋白质印迹（Westernblot） 对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法。 免疫印迹（immunoblotting） Westernblot是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。 可用于分析蛋白质水平的变化 Easternblot？基本原理采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（如NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。WesternBlot流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 转膜 封闭 一抗杂交 洗涤 二抗杂交 洗涤 底物显色SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）SDS即十二烷基硫酸钠（SodiumDodecylSulfate）是阴离子表面活性剂，它能以一定比例和蛋白质结合，形成SDS-蛋白质复合物。蛋白质即带有大量的负电荷，并远远超过了其原来的电荷，从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除。与此同时，蛋白质在SDS作用下结构变得松散，形状趋于一致，所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的电泳迁移率的差异仅仅取决于蛋白质的分子量。内参Marker纯净水（ddH2O）丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺（Arc-Bis）SDSTris-HCL四甲基乙二胺(TEMED)（催化硫酸铵形成自由基而加速丙烯酰胺和双丙烯酰胺的聚合）过硫酸铵(APS)（提供引发丙烯酰胺和双丙烯酰胺聚合的自由基）凝胶成份常用凝胶配置比例 分离胶（12%） 浓缩胶（4%） ddH2O 4.95ml 3.05ml Arc-Bis 6ml 0.67ml Tri-HCl 3.75ml（PH=8.8） 1.25ml（PH=6.8） 10%-SDS 150ul 50ul 10%-APS 150ul 50ul TEMED 15ul 10ul膜的选择转膜半干法（用恒流）将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。 封闭（1h）(封闭时间过短会导致背景过深) 5％脱脂奶粉（如果用生物素标记的二抗，就不能用奶粉封闭，因为奶粉中含有生物素） BSA（牛血清蛋白） WesternBlot膜封闭液（生物试剂公司提供）剪膜一抗、二抗孵育Tween有助于去除非特异性的结合，减少背景显色反应 重组蛋白一般用磷酸酯酶AP显色或是二氨基联苯胺DAB显色，裂解液一般用ECL发光法 辣根过氧化物酶HRP标记二抗用DAB显色，按顺序依次将DAB三种剂各取3滴于5ml蒸馏水中，避光混匀，将膜加入显色液中避光显色5-15min终止反应，对照Marker记录实验结果，将印迹膜晾干扫描保存 底物发光法：将两种显色底物1：1等体积混合后将其覆盖在膜表面使其均匀，用玻璃胶片把膜包起来，马上在暗室中将X光片覆盖在膜的上面（时间根据光的亮度来衡量），显影、定影。染色体和基因水平检测转录水平检测蛋白质水平检测DNAdotblotSouthernblotPCRISHchipNorthernblotRNase保护分析RT-PCRISHchipWesternblotICH基因的检测