ProA，ProG纯化单抗步骤ProA对特定型单克隆抗体的亲和性比较：H1.ATProteinA对特足亚型单克瞬抗体讪亲利陀比段抗体亲和件纠洽pH洗脱pH人很高60-7.03.5-45W56.0-7.0S.5-4.5IgQ低-没有8.0-9.0<7.0IgG,低-点7.0-S.030-6.0小鼠旳低W.0-9.04.5-6.0IgGi*屮等7-0-8.03.5-55IgG%高>7.03.0-4.0辭傑高>7.03,5-5.5ProAProG结合buffer洗脱buffer结合buffer洗脱bufferIgG13.5MNaCl，pH9.0pH6.5lgG2apH4.5lgG2bpH3.0IgG3pH3.0通常采用中性缓冲液作为结合缓冲液（如：50mMPB0.15MNaClpH7.0）,采用低pH缓冲液作为洗脱液（如：0.1M柠檬酸pH3.5），由于ATProteinA与IgG结合的能力取决于抗体的来源及亚型（
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1）,高盐和高pH可以促进抗体和介质的结合，并减少非特异性结合，提高pH，可中和耐碱ProteinA和IgG结合位点的相对的组氨酸残基。这些残基静电排斥效应阻碍亲和反应。增加盐浓度，以减少静电排斥，增强疏水作用。针对不同的抗体，可以通过改变缓冲液的盐的类型以及浓度以及pH来进行结合条件和冲洗条件的优化。杂质残留将会影响柱子的层析性能。如果聚集严重，将会堵塞柱子，反压增大，并影响流速。所以定期的在位清洗能够防止污染物在柱床上的聚集，有助于保持介质的性能。可以采用2MNaCl清洗2CV，以去除较强的非特异性结合的蛋白；然后用0.1-0.5MNaOH清洗柱子，接触时间10-15min；立即用结合缓冲液冲洗至少5CV。结合缓冲液：PBS，pH7.0洗脱缓冲液：Gly-HCl，PH3.0柱清洗液：可以采用2MNaCl清洗2CV，以去除较强的非特异性结合的蛋白；然后用0.1-0.5MNaOH清洗柱子，接触时间10-15min；立即用结合缓冲液冲洗至少5CV。1.根据抗体的亚型确定填料的种类。对于IgG1亚型的抗体采用ProteinG填料纯化，对于lgG2a、lgG2b,lgG2c,IgG3亚型的抗体采用ProteinA填料纯化。IgM和IgG不采用此
方法
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纯化将新填料装入大柱子内，用PBS洗涤三次，每次用8-10mlPBS。如果填料是使用过的，则先用洗脱液洗脱，再用PBS洗涤三次备用。洗涤完毕后，将腹水装入柱子内，做好标记，用封口膜封口。4C孵育过夜。将腹水从大柱子放里出，即为Ft,单独用干净瓶子装好Ft,在瓶子上写好标记。用PBS洗涤大柱子三次去掉未结合的抗体及杂质，再转入小柱内，小柱子也要对应做好标记。待小柱子内液体放干后，开始用预冷的洗脱液洗脱抗体，每次洗脱液加1ml，用1.5mlEP收集洗脱下的组份，收集下的抗体用中和液（10xPBS）中和。取3.3ul中和好的抗体，用100ulBradfordkit里的考玛斯亮蓝组份检测抗体的大致浓度，确认有明显显色反应的可以收集装瓶。反复洗脱至考玛斯亮蓝不能明显检测到任何蛋白质成份为止。装洗脱下的浓度较高的抗体装入干净新瓶子，做好标记，暂时放4度冰箱保存。原则上放弃低于1mg/ml的抗体，或将其与Ft混合重新上柱。将小柱子用PBS洗涤一次，换到大柱子内再洗三次。将Ft装入大柱内，重复上述步骤，直到Ft内无抗体为止。收集完抗体后向抗体内加入等体积甘油，再加入2.5%NaN3，至终浓度为万分之二。充分混匀后于-20度冰箱保存。用洗脱液洗涤小柱子三次，再转入大柱子内，再用PBS洗涤三次，最后再向大柱子内加约5mlPBS，并加入NaN3至终浓度约为万分之二，于4度冰箱保存。来源出处：武汉戴安生物技术有限公司
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