液相色谱串联质谱法同时测定鱼肉中30种激素类和氯霉素类药物残

第30卷第12期2011年12月分析测试学报FENXICESHIXUEBAO(JournalofInstrumentalAnalysis)Vol.30No.121329～1337收稿日期:2011－09－21;修回日期:2011－09－26基金项目:广东省科技计划重点专项“农产品检测监控与追溯技术研究与示范”资助项目(2009A020101004)*通讯作者:黄晓兰，研究员，研究方向:食品安全检测技术，Tel:020－37656312，E－mail:櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏櫏殽殽殽殽wenhxl@126.com食品安全专栏QuEChERS/液相色谱－串联质谱法同时测定鱼肉中30种激素类及氯霉素类药物残留罗辉泰，黄晓兰*，吴惠勤，朱志鑫，黄芳，林晓珊(中国广州分析测试中心广东省分析测试技术公共 实验室 17025实验室iso17025实验室认可实验室检查项目微生物实验室标识重点实验室计划 ，广东广州510070)摘要:建立了鱼肉中8种雌激素、5种雄激素、6种孕激素、8种糖皮质激素及3种氯霉素类药物多残留的QuEChERS/液相色谱－串联质谱(LC－MS/MS)同时测定方法。均质样品用水分散后加乙腈提取，经分散固相萃取净化后，采用ZORBAXExtend-C18色谱柱(100mm×2.1mm，3.5μm)分离，分别在电喷雾正、负离子模式下以多反应监测(MRM)方式检测。正离子模式下的流动相为水－乙腈，负离子模式下的流动相为0.1%氨水－乙腈。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，30种药物在相应的质量浓度范围内线性良好，相关系数均大于0.99，在3个加标水平下的平均回收率为63%～118%，相对 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 偏差(RSD)为3.8%～18.2%，检出限(LOD，S/N≥3)和定量下限(LOQ，S/N≥10)分别为0.03～1.6μg/kg及0.10～5.0μg/kg。市售多种鲜活鱼类的测定结果表明，该方法简便快速、灵敏可靠、经济有效，适用于鱼肉中激素类及氯霉素类药物多残留的同时快速测定。关键词:QuEChERS;液相色谱－串联质谱;雌激素;雄激素;孕激素;糖皮质激素;氯霉素;鱼肉中图分类号:O657.63;R977.1文献标识码:A文章编号:1004－4957(2011)12－1329－09doi:10.3969/j.issn.1004－4957.2011.12.001SimultaneousDeterminationof30HormonesandChloramphenicolsResiduesinFishUsingQuEChERSSamplePreparationandLiquidChromatography－TandemMassSpectrometryLUOHui-tai，HUANGXiao-lan*，WUHui-qin，ZHUZhi-xin，HUANGFang，LINXiao-shan(GuangdongProvincialPublicLaboratoryofAnalysisandTestingTechnology，ChinaNationalAnalyticalCenterGuangzhou，Guangzhou510070，China)Abstract:Amulti-residuemethodwasdevelopedforthesimultaneousdeterminationof8estrogens，5androgens，6progesterones，8glucocorticoidsand3chloramphenicolsinfishusingQuEChERSsamplepreparationandliquidchromatography－tandemmassspectrometry(LC－MS/MS)．Theho-mogenizedsamplewasdispersedbywater，thentheanalyteswereextractedwithacetonitrile．TheseparationwereperformedonaZORBAXExtend-C18column(100mm×2.1mm，3.5μm)bygradi-entelutionafterdispersive-solid-phaseextraction(d-SPE)purification．Thequalitativeandquantita-tiveanalysisof30analyteswereoperatedbyelectrosprayionizationmassspectrometryundertheposi-tiveornegativemodeusingmultiplereactionmonitoring(MRM)．Acetonitrileandwaterwereusedasthemobilephaseinthepositivemode．Acetonitrileand0.1%ammoniahydroxidewereusedasthemobilephaseinthenegativemode．Thecorrelationcoefficientsofcalibrationcurveswereover0.99inthecorrespondingconcentrationrange．Theaveragerecoveriesofthe30analytesatthreespikedconcentrationlevelsvariedfrom63%to118%withrelativestandarddeviations(RSDs)of3.8%－18.2%．Thelimitsofdetection(LOD，S/N≥3)andquantitation(LOQ，S/N≥10)were0.03－1.6μg/kgand0.1－5.0μg/kg，respectively．Therealsampletestsshowedthattheproposedmethodwassimple，rapid，sensitive，reliableandcost-effective，andwassuitableforthesimultane-分析测试学报第30卷ousdeterminationofhormonesandchloramphenicolsinfishsamples．Keywords:QuEChERS;liquidchromatography－tandemmassspectrometry(LC－MS/MS);es-trogens;androgens;progesterones;glucocorticoids;chloramphenicols;fish激素类药物主要包括雌激素(Estrogens)、雄激素(Androgens)、孕激素(Progestogens)及糖皮质激素(Glucocorticoids)等，因其具有影响动物性别分化、缩短动物生长周期的作用，常被非法用于水产养殖中，以提高水产品的养殖效率。氯霉素类(Chloramphenicols)药物具有广谱抗菌能力，也被广泛用于水产养殖业。这些药物一般较稳定，不易降解，在水产品中的残留可通过食物链进入人体，激素类药物在体内仍具有生物活性可严重影响人体的正常生理功能，更严重的是这5类药物具有致突变、致畸形、致癌的潜在危害［1］。已有研究表明，儿童性早熟、妇女乳腺癌和子宫癌发病率的上升与动物源性食品中性激素残留有关［2］，氯霉素类药物则会对人体造血机能产生严重的副作用［3］。因此，欧盟、国际食品法典委员会(CEC)、美国、日本等均对动物源性食品中激素的残留作出了严格要求。我国农业部176号公告明确规定，禁止饲料和动物饮用水中添加己烯雌酚、雌二醇等雌激素，炔诺醇、左炔诺孕酮、炔诺酮等孕激素，苯丙酸诺龙等雄激素以及蛋白同化激素;235号公告规定己烯雌酚、醋酸甲羟孕酮、丙酸睾酮、苯丙酸诺龙、甲基睾酮等化学合成类激素在动物性食品中的最高残留限量(MRL)为不得检出。对于氯霉素类药物，包括我国在内的大多数国家都对其MRL作了规定。上述药物残留的检测方法主要有酶联免疫法［3］、液相色谱法(HPLC)［4］、气相色谱－质谱法(GC－MS)［5－6］及液相色谱－串联质谱法(LC－MS/MS)［7－13］等。虽然简便快速的酶联免疫法具有较高的灵敏度，但易出现交叉反应及假阳性;HPLC法仅靠保留时间定性，抗干扰能力差且灵敏度不能满足残留检测要求;GC－MS则需对样品进行繁琐的衍生化处理。LC－MS/MS技术无需对样品进行衍生化处理，可同时测定多个目标物，具有高选择性、高灵敏度、高通量的优势，弥补了前述方法的诸多不足，使得该技术在食品安全分析中得到广泛应用。目前，测定某一类激素或氯霉素残留的LC－MS/MS方法已较为成熟，同时测定多类激素残留的LC－MS/MS法亦偶有报道［14－19］，但同时测定鱼肉中4类激素及氯霉素类药物残留的液相色谱－串联质谱法尚未见报道。QuEChERS是由美国化学家Lehotay和德国的Anastassiadas于2003年提出的一种快速(Quick)、简便(Easy)、便宜(Cheap)、有效(Effective)、可靠(Rugged)及安全(Safe)的样品处理技术［20－22］，最早在农药多残留中使用。本文采用先进的QuEChERS技术进行样品处理，通过优化样品前处理条件及色谱－质谱条件，建立了一次同时提取、正负离子模式分别测定雌激素、雄激素、孕激素、糖皮质激素和氯霉素类共5类30种药物残留的新方法。本方法可为鱼类产品药物多残留的定性定量分析提供技术保障，亦可为其他动物源性食品中的兽药多残留分析提供借鉴。1实验部分1.1仪器与试剂Agilent1200SLSeriesRRLC/6410BTripleQuardMS快速高效液相色谱/串联四极杆质谱联用仪(美国安捷伦公司);AS3120超声波发生器，功率250W，频率33kHz(AutoScience公司);AnkeTDL-40B离心机(上海安亭科学仪器厂);DC12H水浴式氮吹浓缩仪(上海安谱科学仪器有限公司);XW-80A快速混匀器(海门市麒麟医用仪器厂)。30种药物标准品:雌酮(Estrone，E1)，17β-雌二醇(17β-Estradiol，17β-E2)，雌三醇(Estriol，E3)，己烷雌酚(Hexoestrol，HES)，己烯雌酚(Diethylstilbestrol，DES)，双烯雌酚(Dienestrol，DIE)，17α-炔雌醇(17α-Ethynylestradiol，17α-EE2)，苯甲酸雌二醇(Estradiolbenzoate，EB)，氯霉素(Chloro-mycetin，CAP)，甲砜霉素(Thiamphenicol，TAP)，氟甲砜霉素(Florfenicol，FF)，孕酮(Progesterone，P)，17α-羟孕酮(17α-Hydroxyprogesterone，17α-OHP)，甲羟孕酮(Medroxyprogesterone，MP)，醋酸氯地孕酮(Chloromadinone17-acetate，CA)，醋酸甲地孕酮(Megestrol17-acetate，MA)，醋酸甲羟孕酮(Medroxyprogesterone17-acetate，MPA)，睾酮(Testosterone，TS)，甲基睾酮(Methoxytestosterone，MTS)，诺龙(Nandrolone，NT)，丙酸睾酮(Testosteronepropionate，TSP)，苯丙酸诺龙(Nandrolonephe-nylpropionate，NTPP)，地塞米松(Dexamethasone，DX)，醋酸地塞米松(Dexamethasoneacetate，DXA)，0331第12期罗辉泰等:QuEChERS/液相色谱－串联质谱法同时测定鱼肉中30种激素类及氯霉素类药物残留倍他米松(Betamethasone，BT)，氢化可的松(Hydrocortisone，HCT)，醋酸可的松(Cortisoneacetate，CSA)，泼尼松(Prednisone，PDN)，氢化泼尼松(Prednisolone，PDS)，醋酸泼尼松(Prednisoneacetate，PA)，纯度均大于96.8%，购自德国Dr.Ehrenstorfer公司和美国SigmaAldrich公司。乙腈(色谱纯，德国Merck公司);N-丙基乙二胺吸附剂(Bondesil－PSA)、十八烷基键合硅胶吸附剂(Bondesil-C18)(美国Agilent公司);无水乙酸钠、无水硫酸镁(分析纯，上海阿拉丁试剂);中性氧化铝、氯化钠、冰醋酸、氨水(分析纯，广州化学试剂厂);实验用水为二次蒸馏水。1.2标准溶液的配制以甲醇为溶剂分别配制质量浓度为1000mg/L的标准储备溶液，置于棕色刻度管，于－18℃冰箱中保存。将上述储备液用甲醇逐级稀释为1mg/L(雌激素为5mg/L)，用于优化质谱参数。根据各化合物的灵敏度，分别准确移取不同体积各化合物储备液于100mL容量瓶中，用甲醇配制成混合标准中间液，再以30%乙腈水溶液逐级稀释为混合标准工作溶液。1.3样品前处理1.3.1提取准确称取匀质后的鱼肉试样5.0g(精确至0.01g)，置于50mL带螺旋盖的聚丙烯离心管中，加入8mL水，在快速混匀器上充分涡旋混匀1min后，准确加入15.0mL乙腈，涡旋混匀2min，加入QuEChERS盐析剂(4.0g无水硫酸镁、1.0g氯化钠)，快速摇匀，置冰水浴中降温，4000r/min离心10min，移取上清液8mL至另一带螺旋盖的15mL聚丙烯离心管中，待净化。1.3.2净化将QuEChERS净化粉(500mg无水硫酸镁、500mg中性氧化铝及200mgPSA)加入装有8mL提取液的离心管，涡旋混匀1min，4000r/min离心5min。准确移取5.0mL上清液至10mL具塞刻度试管，于45℃水浴下氮吹浓缩至近干，加入1.0mL30%的乙腈溶液复溶，超声30s，涡旋混匀，过0.22μm滤膜，待上机测定。1.4基质匹配混合标准溶液的配制取空白基质样品，按“1.3”方法处理样品，浓缩至干后，加入“1.2”配制的混合标准工作溶液1.0mL复溶，超声30s，涡旋混匀，过0.22μm滤膜，即得。1.5LC－MS/MS测定1.5.1色谱条件正离子模式:色谱柱:ZORBAXExtend-C18柱(100mm×2.1mm，3.5μm);柱温:30℃;流速:0.3mL/min;进样量:5μL;流动相:A为水，B为乙腈;梯度洗脱程序:0～3min，30%～53%B;3～4min，53%～57%B;4～6min，57%～62%B;6～6.01min，62%～90%B;6.01～7min，90%～95%B;7～7.1min，95%～30%B，保持3min。负离子模式:色谱柱:ZORBAXExtend-C18柱(100mm×2.1mm，3.5μm);柱温:30℃;流速:0.3mL/min;进样量:10μL;流动相:A为0.1%氨水，B为乙腈;梯度洗脱程序:0～1min，30%B;1～1.01min，30%～47%B;1.01～4min，47%～50%B;4～4.01min，50%～30%B，保持3min。1.5.2质谱条件电喷雾离子源(ESI);正离子或负离子扫描模式;多反应监测(MRM)采集方式;干燥气温度:350℃;干燥气流速:10.0L/min;雾化气压力:275.8kPa(40.0psi);毛细管电压:5000V;分辨率:MS1为Wide(负离子模式)或Unit(正离子模式)，MS2均为Unit;在正离子模式下，采用分时间段采集模式。各化合物的质谱采集参数见表1。表130种化合物的质谱采集参数Table1Massspectrometricacquisitionparametersof30compoundsNo．CompoundtR/minIonizationmodeParention(m/z)Production(m/z)FragU/VCEU/VDwellt/msChloramphenicols(氯霉素类)1CAP2.21ESI－321.0257.1，152.0*1374，8402TAP1.19ESI－354.0290.1*，185.01454，12403FF2.06ESI－356.0336.0*，185.01420，1240Estrogens(雌激素类)4E15.18ESI－269.1159.0，143.0*13536，4540517β-E24.34ESI－271.2183.1，145.1*15040，40406E31.74ESI－287.2171.1*，145.113536，44401331分析测试学报第30卷(续表1)No．CompoundtR/minIonizationmodeParention(m/z)Production(m/z)FragU/VCEU/VDwellt/ms7HES6.15ESI－269.1134.1，119.0*1308，45408DES5.66ESI－267.1237.1*，222.114024，32409DIE5.86ESI－265.1235.0，93.1*14020，24401017α-EE24.94ESI－295.4159.2，145.2*13535，434011EB9.22ESI+377.2105.0*，77.114024，4080Progesterones(孕激素)12P7.67ESI+315.2109.1，97.1*14728，24801317α-OHP5.47ESI+331.2109.1，97.1*13128，286014MP6.34ESI+345.5123.0*，97.014024，286015CA7.75ESI+405.2345.2，309.2*11012，128016MA7.47ESI+385.2325.3*，267.210212，168017MPA7.81ESI+387.3327.3*，123.19012，3280Androgens(雄激素)18TS4.81ESI+289.4109.1，97.1*14028，246019MTS5.29ESI+303.5109.1，97.1*10023，216020TSP9.11ESI+345.2109.1，97.1*14022，208021NT4.35ESI+275.6257.4，109.1*10010，206022NTPP8.53ESI+407.3257.2，105.0*14020，2880Glucocorticoids(糖皮质激素)23DX3.33ESI+393.3373.3*，355.31408，106024DXA5.04ESI+435.3415.3，397.2*1508，86025BT3.33ESI+393.2279.2*，237.214015，156026HCT2.43ESI+363.4309.3*，159.313520，286027CSA4.57ESI+403.4325.4，163.2*12025，306028PDN2.44ESI+361.2343.1*，147.11114，246029PDS2.31ESI+359.3267.4，171.3*13514，306030PA4.44ESI+401.2341.1*，295.213012，2060*quantitativeion1.5.3测定方法在正、负离子模式的测定条件下，分别将样品溶液和基质匹配混合标准溶液注入液相色谱－串联四极杆质谱仪进行测定，以其基质匹配混合标准溶液峰的保留时间和2对质谱监测离子对为依据进行定性，以定量离子对的峰面积计算样品中待测物的含量。2结果与讨论2.1质谱条件的优化根据待测物的化学结构及已有报道［11，19］，雌激素类(除苯甲酸雌二醇外)及氯霉素类化合物因含有酚羟基而适合在ESI源的负离子模式下离子化，产生的母离子为［M－H］－，其余化合物因含有羰基等多电子基团而适合在ESI源的正离子模式下形成［M+H］+母离子。在相应的离子化模式下，分别将30种药物1.0mg/L(或5.0mg/L)的标准溶液直接注入质谱仪进行质谱参数的优化。先通过母离子全扫描(MS1scan)确定化合物的准分子离子，再作选择离子监测(SIM)优化其碎裂电压(Frag)及毛细管电压使［M+H］+或［M－H］－的响应最大，然后对母离子作子离子全扫描(Productionscan)，获得碎片离子信息，选择丰度较高的2个特征碎片离子，优化碰撞能量使其响应最大，最后得到该化合物的2个MRM离子对及相应的质谱参数。由于雌激素中性的甾体结构缺乏酸性或碱性基团，在溶液中较为稳定，不易形成离子，因而较难离子化。依据电喷雾电离的机理，以利于化合物去质子化的乙腈为有机相，同时在流动相中加入适量的氨水，可改善该类化合物在负离子模式下的离子化效率。实验表明，以0.1%氨水－乙腈为流动相有效地提高了雌激素的响应，但同时也减弱了氯霉素类化合物在该模式下的响应，而由于氯霉素类的响应很高，即使部分损失灵敏度仍能满足检测需要。因此，为兼顾响应较低的雌激素，本方法仍选择该流动相组成。2.2色谱条件的优化由于5类待测化合物大多属于弱极性化合物，在C8、C18固定相中均有较好的保留，结合其质谱行为的差异，分别建立正、负离子模式下的色谱条件。由于在负离子模式下，为提高雌激素的灵敏度，2331第12期罗辉泰等:QuEChERS/液相色谱－串联质谱法同时测定鱼肉中30种激素类及氯霉素类药物残留流动相需使用0.1%氨水，其pH值达到10左右，超过了普通硅胶基质C18柱的pH值耐受范围，ZOR-BAXExtend-C18(2.1mm×100mm，3.5μm)可耐受pH2.0～11.5范围的流动相，因而选作本方法的分离柱。一般在正离子模式下加入适量的甲酸或乙酸有利于提高质谱检测的灵敏度和改善类固醇激素的峰形，但在本文优化的色谱条件下，不加酸性添加剂也能获得良好的峰形及优异的检测灵敏度。甾体类激素化合物具有相同的环戊烷骈多氢菲母核结构，部分化合物间的差异只在于是否多1个羟基(如雌酮与雌二醇)、多1个甲基(如睾酮与甲基睾酮)以及有无氢化(如己烯雌酚与己烷雌酚)，这加大了分离难度，通过反复试验梯度洗脱条件，最终实现了大多数化合物的分离。优化条件下30种药物的MRM色谱图见图1。图130种化合物混合标准溶液的MRM色谱图Fig.1MRMchromatogramsof30compoundsmixedstandardsolution3331分析测试学报第30卷实验发现采用不同的溶剂作为标准稀释液或样品处理后的复溶溶液会对质谱响应及色谱峰形产生显著影响。比例过高的有机溶剂能明显增强质谱响应，但同时也会造成部分化合物的色谱峰形坍塌。经多次试验，确定以30%乙腈溶液作为样品处理后复溶及标准溶液配制用溶液，可获得对称、尖锐的峰形和良好的质谱响应。2.3QuEChERS样品前处理条件的优化2.3.1提取方法的优化已有研究表明［19］动物肌肉组织中激素呈结合态的情况较少(如肌肉中睾酮可解离的结合态小于20%，17β-雌二醇小于5%)，且Yang等［10］分别在无酶解或酶解条件下测定了肌肉、虾、牛奶中的内源性激素，发现两种条件下的测定结果无差异。为节省样品处理时间，本方法省略了酶解步骤。本文30种化合物多属于弱极性或中等极性，常用的提取溶剂涉及甲醇、乙腈、乙酸乙酯等。尽管甲醇已被国家标准选为激素多残留检测的提取溶剂，但鉴于其盐析效果不佳，本文只考察QuEChERS常用提取溶剂(乙腈、乙酸乙酯及丙酮)的提取效果。实验发现乙腈与乙酸乙酯的提取回收率相当，且高于丙酮;但用乙酸乙酯提取的溶剂颜色较深，表明其带出了弱极性基质成分，这将增加后续净化的难度;乙腈在有效提取目标物的同时具有沉淀蛋白的作用，且其带出的弱极性成分大大减少，因而选用乙腈作为QuEChERS的提取溶剂。在提取时，比较了直接乙腈提取与先加水分散再乙腈提取的处理方法，结果表明，先加水将样品充分分散后再用乙腈提取可获得更高的回收率，其二次提取液中30种目标物的含量(不超过4%)均小于前者(部分化合物大于10%)。这可能与乙腈具有的蛋白凝结作用有关，凝结的蛋白阻碍了其进入内部发生作用，而加水可加大均质样品的分散程度，提高其比表面积，使提取溶剂与样品发生更多的接触，同时乙腈与水互溶，这也增加了其渗透性，所以其提取效果最佳。2.3.2净化条件的优化分散固相萃取是QuEChERS方法的净化手段，PSA、C18、中性氧化铝及石墨化炭黑(GCB)是常用的吸附剂。PSA通常用于去除提取液中的脂类和糖类物质，C18及中性氧化铝具有良好的除脂能力，GCB可去除提取液中的色素成分，但对含苯环官能团的化合物有较强的吸附作用［20］。鱼肉中含有丰富的蛋白质(在前述乙腈提取时已被沉淀)及脂肪类物质，而目标物几乎都含有苯环，故本研究只选取PSA、C18及中性氧化铝作为净化吸附剂进行优化。为考察这3种吸附剂对30种目标物的吸附情况，在同一浓度水平的混合标准溶液中分别加入100mg的3种吸附剂充分混匀1min，过0.22μm滤膜后测定，发现C18对待测物的吸附极强，有23种目标物的回收率小于30%;而PSA与中性氧化铝对大多数目标物吸附较少，可作为净化剂进一步优化。根据鱼肉提取液中残留脂肪和水分的含量特点，考察了50～300mgPSA、500～1000mg无水硫酸镁及200～1000mg中性氧化铝按不同比例组合的净化效果。结果表明，采用200mgPSA、500mg无水硫酸镁及500mg中性氧化铝为净化剂组合进行分散固相萃取时，样品溶液澄清，基质干扰较小，回收率最佳。2.4基质效应的 评价 LEC评价法下载LEC评价法下载评价量规免费下载学院评价表文档下载学院评价表文档下载 及消除尽管样品在经过乙腈沉淀蛋白、分散固相萃取后得到了良好的净化效果，但仍无法完全消除其基质效应。基质效应主要是由于基质成分和目标化合物在电喷雾离子源进行离子化时相互竞争的结果，包括基质增强效应和基质抑制效应。在液相色谱－质谱定性定量分析中，基质效应影响仪器的灵敏度和重复性，是影响可靠定性及准确定量的重要因素，这在基质复杂的样品(如动物源食品及生物样本)中表现尤为明显。因而在建立LC－MS/MS检测方法时应对基质效应进行评价，并采取措施进行消除，以保证结果的准确可靠。基质效应可采用(基质匹配标准溶液所作曲线的斜率/无基质标准溶液所作曲线的斜率－1)×100%进行评价［7］，负值表示存在基质抑制效应，正值表示存在基质增强效应，绝对值越大则基质效应越强。本文对30种化合物的基质效应进行了评价(见表2)，可以看出除甲基睾酮外，大部分化合物均存在不同程度的基质效应，且抑制效应多于增强效应。消除基质效应除改进样品净化手段外，还有使用同位素内标［13，18］(理化性质与目标物几乎一致)、稀释样品溶液(降低基质成分浓度)、配制基质匹配标准溶液(为标准液提供与样品溶液相似的离子化环境)等方法。综合考虑，本方法采用配制基质匹配标准溶液的方法，很好地消除了基质影响，完全能满足残留检测的要求。4331第12期罗辉泰等:QuEChERS/液相色谱－串联质谱法同时测定鱼肉中30种激素类及氯霉素类药物残留表230种化合物的基质效应评价Table2Evaluationofmatrixeffectsof30compoundsNo．CompoundCalibrationcurvewithoutmatrix(无基质匹配标准曲线)Calibrationcurvewithmatrix(基质匹配标准曲线)r2Sloper2SlopeMatrixeffect(%)1CAP0.9993604.60.9992657.68.82TAP0.9998406.20.9979462.413.83FF0.9998699.70.9995852.221.84E10.999728.680.999625.30－11.8517β-E20.998827.410.999620.52－25.16E30.997433.710.999637.6711.77HES0.9999109.30.998286.98－20.48DES0.9992151.70.9981123.1－18.99DIE0.9998113.10.997888.69－21.61017α-EE20.9999118.30.998797.76－17.411EB0.9985281.60.997068.97－75.512P0.9998958.90.9988116.9－87.81317α-OHP0.9976767.40.9999462.6－39.714MP0.998614710.9974581.6－60.515CA0.9991289.40.998231.01－89.316MA0.999720800.99941072－48.417MPA0.9995600.60.9973166.5－72.318TS0.9995357.90.9948302.0－15.619MTS0.9986220.60.9997221.00.220TSP0.996488.840.991957.55－35.221NT0.996657.200.996773.6328.722NTPP0.9970634.70.9988282.8－55.423DX0.9981359.30.9997160.4－55.424DXA0.9944227.00.999064.82－71.425BT0.9987107.60.999848.50－54.926HCT0.9958217.80.999193.77－56.927CSA0.9991406.80.9996267.7－34.228PDN0.9989217.30.996492.78－57.329PDS0.999814120.9924229.5－83.730PA0.9987330.90.9978188.7－43.02.5线性范围、检出限与定量下限按“1.4”方法配制6个水平的基质匹配混合标准工作溶液，在选定的色谱条件和质谱参数下上机测定。以目标物定量离子的峰面积(Y)为纵坐标，质量浓度(X，μg/L)为横坐标绘制工作曲线，得到线性回归方程，相关系数为0.9919～0.9999，表明各化合物在相应的浓度范围内呈良好的线性关系。采用标准添加法进行测定，以定量离子信噪比(S/N)≥3确定样品的检出限(LOD)，S/N≥10为定量下限(LOQ)，结果见表3。30种药物的LOD为0.03～1.6μg/kg，LOQ为0.10～5.0μg/kg。表330种化合物的回归方程、相关系数、线性范围、检出限及定量下限Table3Regressionequations，correlationcoefficients，linearranges，limitsofdetection(LODs)andlimitsofquantitation(LOQs)of30compoundsNo．CompoundRegressionequationr2Linearrangeρ/(μg·L－1)LODw/(μg·kg－1)LOQw/(μg·kg－1)1CAPY=657.68X－89.010.99920.56～560.030.102TAPY=462.42X－496.650.99790.68～680.040.133FFY=852.29X－459.480.99950.53～530.070.254E1Y=25.30X－409.990.999610.5～21000.832.5517β-E2Y=20.52X+20.230.999610.6～21200.622.06E3Y=37.67X－250.960.999610.1～20200.461.57HESY=86.98X－610.830.99823.2～6400.852.58DESY=123.10X－1376.50.99813.2～6400.922.99DIEY=88.69X－809.640.99783.2～6401.03.01017α-EE2Y=97.76X－295.760.998711.2～22401.34.011EBY=68.97X－849.560.99705.1～5101.65.05331分析测试学报第30卷(续表3)No．CompoundRegressionequationr2Linearrangeρ/(μg·L－1)LODw/(μg·kg－1)LOQw/(μg·kg－1)12PY=116.93X－122.350.99880.51～510.321.01317α-OHPY=462.69X+61.020.99990.54～540.451.514MPY=581.66X－610.640.99740.54～540.250.815CAY=31.01X－29.590.99820.54～540.321.016MAY=1072.74X－663.930.99940.54～540.291.017MPAY=166.56X－202.420.99730.53～530.351.218TSY=302.01X+1948.40.99482.02～4040.251.019MTSY=221.06X+106.180.99972.10～2100.752.020TSPY=57.55X－264.950.99192.10～2100.682.021NTY=73.63X+431.190.99672.08～2080.802.522NTPPY=282.81X－1096.80.99882.04～1020.953.023DXY=160.47X－192.200.99972.04～2040.852.524DXAY=64.82X+166.200.99902.06～2060.832.525BTY=48.50X+38.670.99982.04～2040.923.026HCTY=93.77X－88.890.99910.90～900.672.027CSAY=267.71X+20.760.99962.1～4200.842.528PDNY=92.78X－421.820.99642.0～2000.652.029PDSY=229.57X－870.310.99241.1～1100.622.030PAY=188.75X+808.050.99782.1～2100.913.02.6方法的回收率与精密度向空白鱼肉样品中添加3个浓度水平的30种化合物混合标准溶液，按前述处理方法及测定条件进行回收率实验，每个添加水平做6个平行，结果见表4。各化合物的平均回收率为63%～118%，相对标准偏差(RSD)为3.8%～18.2%，均符合残留检测有关标准和法规的要求。表4样品中30种化合物的回收率和相对标准偏差(n=6)Table4RecoveriesandRSDsof30compoundsinthesamples(n=6)DrugSpikedw/(μg·kg－1)RecoveryR/%RSDsr/%DrugSpikedw/(μg·kg－1)RecoveryR/%RSDsr/%DrugSpikedw/(μg·kg－1)RecoveryR/%RSDsr/%CAP11048.7EB106614.3NT108714.35897.750818.9501028.2201035.61008011.11009210.1TAP11059.1P510618.2NTPP101129.85998.225967.950947.62010410.5509911.310010410.3FF19110.717α-OHP58014.9DX107612.859511.2251026.550973.8201029.650988.7100906.9E15689.8MP51018.2DXA107010.3258510.6258710.750897.9100947.650987.810010211.317β-E25828.8CA511813.5BT10779.6258810.625974.9509612.81009610.2501059.510010314.3E357411.8MA58210.9HCT10649.825776.4251037.950787.3100889.3501007.3100736.6HES56514.2MPA51088.9CSA10687.925809.5258012.3507910.51009510.0509210.3100818.8DES57213.6TS56613.6PDN106811.5258614.925957.850788.9100858.650937.31007510.6DIE5746.3MTS106312.0PDS10717.9258310.2508910.6508310.3100918.2100956.8100774.96331第12期罗辉泰等:QuEChERS/液相色谱－串联质谱法同时测定鱼肉中30种激素类及氯霉素类药物残留(续表4)DrugSpikedw/(μg·kg－1)RecoveryR/%RSDsr/%DrugSpikedw/(μg·kg－1)RecoveryR/%RSDsr/%DrugSpikedw/(μg·kg－1)RecoveryR/%RSDsr/%17α-EE2107116.3TSP10707.8PA10719.750966.8509510.650896.9200847.9100905.6100875.52.7实际样品的测定为验证该方法的可靠性，从市场购买了鲩鱼、鲫鱼、鳙鱼、叉尾鱼及鳗鱼进行测定，同时作质控样品。其中在鲩鱼中检出少量氢化可的松(22.5μg/kg)，其余样品均未检出30种药物残留，质控样品的回收率等指标均达到分析要求，表明结果准确可靠。3结论本文将在蔬菜水果农药残留分析中采用的QuEChERS样品处理技术引入到鱼肉的药物多残留分析中，通过优化样品预处理及色谱－质谱测定条件，建立了一次同时提取，正、负离子分别测定鱼肉中激素及氯霉素类共30种药物的QuEChERS/LC－MS/MS法。该方法样品前处理成本低廉、简便快速、灵敏可靠，方法的各项技术指标均能满足日常残留检测分析的要求，适合于鱼肉中这30种药物的筛查和定量分析。参考文献:［1］SunM．J.HenanInst.Sci.Technol.:Nat.Sci.Ed．(孙梅．河南科技学院学报:自然科学版)，2006，34(4):298－302．［2］ZhangAZ，WangQL，ShenJ，ZhangSF，ChenLR．Chin.J.Chromatogr．(张爱芝，王全林，沈坚，张 书 关于书的成语关于读书的排比句社区图书漂流公约怎么写关于读书的小报汉书pdf 芬，陈立仁．色谱)，2010，28(2):190－196．［3］TanH，MaiQ．Chin.J.Heal.Lab.Technol．(谭慧，麦琦．中国卫生检验杂志)，2010，20(7):1649－1650．［4］ZhanCR，GuoP，ChenZG，WangYX，HuZG．Chin.J.Anal.Chem．(占春瑞，郭平，陈振桂，王远兴，胡志国．分析化学)，2008，36(4):525－528．［5］LinWX，DongWF，ChenX，TianM，YuL，ZhaoJH，YangCG．Chin.J.Chromatogr．(林维宣，董伟峰，陈溪，田苗，于灵，赵景红，杨春光．色谱)，2009，27(3):294－298．［6］LiP，QiuYM，CaiHX，KongY，TangYZ，WangDN，XieMX．Chin.J.Chromatogr．(李鹏，邱月明，蔡慧霞，孔莹，唐英章，王大宁，谢孟峡．色谱)，2006，24(1):14－18．［7］TsoJ，AgaDS．J.Chromatogr.A，2010，1217:4784－4795．［8］RegalP，VázquezBI，FrancoCM，CepedaA，FenteC．J.Chromatogr.B，2009，877:2457－2464．［9］KushnirMM，RockwoodAL，RobertsWL，YueB，BergquistJ，MeikleAW．Clin.Biochem．，2011，44:77－88．［10］ShaoB，ZhaoR，MengJ，XueY，WuGH，HuJY，TuXM．Anal.Chim.Acta，2005，548:41－50．［11］PengT，LiSJ，ChuXG，CaiYX，LiCJ．Chin.J.Anal.Chem．(彭涛，李淑娟，储晓刚，蔡云霞，李重九．分析化学)，2005，33(4):463－466．［12］XuYJ，TianXH，ZhangXZ，GongXH，ZhangSJ，LiuHH．J.Instrum.Anal．(徐英江，田秀慧，张秀珍，宫向红，张世娟，刘慧慧．分析测试学报)，2010，29(2):152－156．［13］WangZJ，LengKL，SunWH，LiuYP，ZhaiYX，TanZJ，GuoMM，WangY．Prog.FisherySci．(王志杰，冷凯良，孙伟红，刘艳萍，翟毓秀，谭志军，郭萌萌，王瑜．渔业科学进展)，2009，30(2):115－119．［14］HarwoodDT，HandelsmanDJ．Clin.Chim.Acta，2009，409:78－84．［15］WuPG，WangQ，ChenHH，YingYF，ZhaoYX，ShenXH，SongGL，XuXM．Chin.J.Anal.Chem．(吴平谷，王强，陈慧华，应永飞，赵永信，沈向红，宋国良，徐小民．分析化学)，2008，36(11):1476－1482．［16］QinY，ChenJ，ZhangMJ．Chin.J.Anal.Chem．(秦燕，陈捷，张美金．分析化学)，2006，34(3):298－302．［17］ZhuWX，LiuYF，YuanP，YangJZ．Chin.J.Chromatogr．(祝伟霞，刘亚风，袁萍，杨冀州．色谱)，2010，28(11):1031－1037．［18］GB/T21981－2008．Determinationofhormonemultiresiduesinfoodstuffsofanimalorigin———LC－MS/MSmethod．Na-tionalStandardsofthePeople'sRepublicofChina(动物源食品中激素多残留检测方法液相色谱－质谱/质谱法．中华人民共和国国家标准)．［19］YangY，ShaoB，ZhangJ，WuY，DuanH．J.Chromatogr.B，2009，877:489－496．［20］KlinsunthornN，PetsomA，NhujakT．J.Pharm.Biom.Anal．，2011，55:1175－1178．［21］Aguilera－LuizMM，VidalJL，Romero－GonzálezR，FrenichAG．J.Chromatogr.A，2008，1205:10－16．［22］StubbingsG，BigwoodT．Anal.Chim.Acta，2009，637:68－78．7331