酵母双杂交表达载体pGBKT7__省略_7

酵母双杂交表达载体pGBKT7__省略_7 2013年第27卷第3期作物研究213 酵母双杂交表达载体pGBKT7_NPＲ1与pGADT7_NPＲ1的构建及酵母菌的转化 肖 1，2牧，徐 1，2 健，何 1，21，2 乐，刘春林，阮 颖 1，2* （1湖南农业大学生物科学技术学院，长沙410128； 2湖南农业大学作物种质创新和资源利用国家重点实验室培育基地，长沙410128） 摘 要：NPＲ1是水杨酸介导的系统获得性抗性（SAＲ）途径中不可或缺的一个转录辅助因子。在SA诱导下， NPＲ1被转运至细胞核内并与一些转录因子结合，以启动下游基因的表达。本研究通过PCＲ扩增获得拟南芥中NPＲ1基因CDS序列，经过限制性内切酶酶切后在T4连接酶作用下分别克隆至pGBKT7与pGADT7酵母表达载体上，并成功将其转化至Gold酵母菌株中。为利用酵母双杂交筛选NPＲ1参与形成的转录复合体中其它可能存在的蛋白质并阐明其在植物防御信号传导途径中的互作模式奠定了基础。关键词：NPＲ1；基因克隆；酵母双杂交载体；酵母转化中图分类号：Q78 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1001-5280.2013.03.01 5280（2013）03-0213-04文章编号：1001- ConstructionandTransformationofYeastTwo－hybridExpression VectorspGBKT7_NPＲ1andpGADT7_NPＲ1 22222* XIAOMu1，，XUJian1，，HELe1，，LIUChun-lin1，，ＲUANYing1， （1CollegeofBioscienceandBiotechnology，HunanAgriculturalUniversity，Changsha，Hunan410128，China；2Pre－StateKeyLaboratoryofCropGermplasmInnovationandUtilization，HunanAgriculturalUniversity，Changsha，Hunan410128，China） Abstract：NPＲ1isanindispensabletranscriptionco－factorinSAＲinducedbysalicylicacid.UpontheSAstimuli，NPＲ1istranslocatedintothenucleusandinteractswithsometranscriptionfactors，andthenstartstheexpressionofdown-streamgenes.Inthisstudy，CDSsequenceofNPＲ1wasclonedintotwoyeastexpressionvectorspGBKT7andpGADT7，andthenwastransformedintoyeastGoldstrain.Thisstudylaidafoundationforsiftingotherpossibleproteinsintranscrip-tionalcomplexwithparticipationofNPＲ1byYeastTwo－Hybridandelucidatingitsinteractionmodelinplantdefensesig-naltransductionpathways. Keywords：NPＲ1；Genecloning；Yeasttwo－hybridexpressionvectors；Yeasttransformation 拟南芥NPＲ1是水杨酸（Salicylicacid）介导的 SAＲ）系统获得性抗性（systemicacquiredresistance，途径中不可或缺的一个转录辅助因子，其包含的 BTB/POZ结构域［1］以及锚蛋白重复序列是行使其 ［2］ NPＲ1被转入生物学功能的基础。在SA诱导下， 到细胞核内并与一些转录因子结合，启动下游基因 03-26收稿日期：2013-作者简介：肖 的表达。它介导植物对一系列水杨酸途径应答的植 物病原菌，如Pseudomonassyringae和Peronosporaparasitica的抗性。拟南芥中，过量表达NPＲ1能够 BTH增加植物对水杨酸或者功能类似物，如MeSA、 的敏感性，但并不会导致植物的形态改变，在未受到诱导物或者病原菌刺激的情况下，病原相关基因 Email：animamoo@yahoo.cn。*通信作者，Email：yingruan@hotmail.com。牧（1988－），男，硕士研究生， 基金项目：国家自然科学基金项目（31071455）。 214CＲOPＲESEAＲCH2013，27（3） PＲs（pathogenesis－relatedgene）的表达水平亦不会 出现明显上升。而在受到刺激后则表现出更强的PＲ1基因诱导以及对病原菌的抗性［2］。NPＲ1缺失突变背景下，拟南芥表现出对各种SAＲ诱导物不敏感、丧失PＲ基因表达以及对各种细菌病害易感性 ［3］ 增强。有关NPＲ1在水杨酸介导的SAＲ途径中的作用模式已有详尽报道。已知SAＲ过程中，NPＲ1被转运至细胞核内对于PＲ基因的转录激活是必需的，但NPＲ1蛋白质本身并不包含任何DNA结合序列，且行使生物学功能的两个关键结构域（BTB/POZ，ankyrinrepeat）均参与蛋白质相互作用的过程，这暗示着NPＲ1在SAＲ过程中起着一个间。进一步的研究表明，NPＲ1出入细胞核的过程受到SA 及类似物触发的细胞内氧化接的调控作用 。NPＲ1蛋白之间通常以二硫键链 在受到SA接而形成多聚体的形态存在于细胞质内，还原电势调控 诱导后，细胞内氧化还原电势发生改变而引起二硫 NPＲ1多聚体被还原成单体并被转运到键被剪切， 细胞核内。NPＲ1在细胞核内与转录因子TGAs或 从而影响转录因子的DNA结合效者NIMINs结合， 进而从转录水平上对下游防御基因进行调率，控 。此外，NPＲ1亦能够与拟南芥中与其本身同 ——水杨酸受体NPＲ3，NPＲ4分别相源的两个蛋白— ［6，7］ ［5］［2］ ［4］ Transgen公司；酵母用培养基购自Sigma；其他常用 购自上海国药。试剂均为分析纯，1.1.2 质粒与菌株 大肠杆菌DH5α，酵母菌株（Gold菌株），表达pGADT7均为湖南农业大学植物代谢载体pGBKT7、实验室保存。1.2 方法 （1）引物设计。根据NCBI上查找到已公布的 NPＲ1基因编码区序列（CDS，全长1782bp），运用引物设计软件PrimerPremier5，根据酵母表达载体pGBKT7、pGADT7的表达框及多克隆位点，在上下游引物5'端分别接入相应的酶切识别位点EcoＲI及BamHI。克隆所用引物均由生工生物 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 （上海）有限公司合成。实验所用引物序列如下： NPＲ1－F：5'GGAATTCCATGGACACCACCATTGATGGATTCG3' NPＲ1－Ｒ：5'CGGGATCCCGTCACCGACGACGATGAGAGAGTTTA3' （2）重组酵母双杂交质粒示意图如下： 互作用，且作用模式依赖于接收的SAＲ信号的强 进而经由泛素化过程，来调节NPＲ1蛋白水平，度， ［4，8］ 。这个过程对于拟南芥中SAＲ的建立同样关键 为了进一步研究NPＲ1在植物防御反应中的作并阐明其在调节不同防御信号传导途径中的具用， 体作用机制，本研究利用特异性引物扩增哥伦比亚野生型拟南芥中的NPＲ1基因，并将其分别克隆至pGBKT7、pGADT7酵母双杂交表达载体上，为利用酵母双杂交技术寻找与NPＲ1转录辅助因子相互作用的蛋白并进一步理解其在植物防御信号中的作用模式以及调控下游基因转录水平的机理奠定基础。 图1 pGBKT7_NPＲ1载体构建示意图 1 1.1 材料与方法 材料主要试剂 1.1.1 BamHI、T4ligase、限制性内切酶（ＲE）EcoＲI、 PCＲMix、LongAmpTaqDNApolymerase、PMD19－T载体购自Takara公司；琼脂糖（Agarose）购自西班牙Biowest；质粒提取试剂盒购自Ambiogen公司；柱式DNA胶回收试剂盒、 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 分子量DNAMarker购自 图2 pGADT7_NPＲ1载体构建示意图 2013年第27卷第3期作物研究215 （3）PCＲ反应体系。总体积50μL，无菌去离子 Buffer6μL，long引物（10μM）各1.2μL，水20μL， Taq（2.5μL）1.2μL，dNTP（10mM）0.9μL，模板 cDNA（100ng）1μL（拟南芥cDNA）。 55℃退火30s，72℃反应参数：94℃变性30s， 延伸120s，运行30个循环。（4）T载体连接及大肠杆菌转化。将PCＲ扩增得到目的片段和pMD19－T载体片段进行连接反4μLDNA，5μLsolu-应，体系为10μL（1μLvector， tionⅠ）（具体操作参见Takara公司试剂盒 说明 关于失联党员情况说明岗位说明总经理岗位说明书会计岗位说明书行政主管岗位说明书 书）。（5）酵母双杂交载体构建。使用限制性内切酶EcoＲI、BamHI对PMD19－T_NPＲ1重组质粒和pGBKT7、pGADT7载体分别进行双酶切（酶切体系 琼脂糖电泳后回参见Takara公司试剂盒 说明书 房屋状态说明书下载罗氏说明书下载焊机说明书下载罗氏说明书下载GGD说明书下载 ）， 收目的基因片段和表达载体片段（操作参见Trans-gen公司试剂盒说明书）。在 T4连接酶连接体系中将目的基因片段分别与两个表达载体片段连接后， 转入大肠杆菌。挑取阳性克隆进行PCＲ验证后提质粒进行酶切验证。1.3 重组质粒转化酵母细胞 （1）酵母感受态细胞的制备。本实验采用醋酸锂介导转化法分别将两个重组质粒转化至Gold酵母菌株（操作 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 以及选用试剂参见Clontech公司MatchmakerTMGoldYeastTwo－HybridSystemUserManual）。 （2）重组质粒的转化。将鲑鱼精DNA、酵母感受态细胞以及重组质粒混匀后加0.7mLPEG/LiAc30℃振荡培养30min，溶液，再加入0.07mLDMSO混匀，于42℃热激15min，冰浴15min，离心后弃上清，将沉淀重悬于1.5mL1×TE缓冲液中，分别涂布至缺少相应氨基酸的SD筛选平板。28℃恒温箱里倒置培养，直至长出酵母阳性克隆。 计退火温度梯度PCＲ，确定最佳的退火温度为 55℃。以55℃为退火温度进行PCＲ扩增，PCＲ产物经过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离出目的片段，大小与预期一致（1800bp左右）（图3）。2.2 NPＲ1全长CDS与T－Vector连接及测序结果分析 切胶回收扩增出的1782bp左右的目的片段，在T4连接酶作用下将其连接到pMD19－T，热激法取100μL菌液涂布于LB固转化大肠杆菌DH5α， 体培养基上（含有氨苄青霉素50g/mL）生长，筛选获得阳性克隆。随机挑选数个单菌落进行PCＲ检筛选获得转化子。测， 挑取菌落PCＲ检测为阳性的单菌落，接种至含有50mg/mLAmp的5～10mLLB液体培养基中，37℃、220rpm振荡培养。过夜后提取质粒，利用EcoＲI、BamHI进行双酶切验证。挑选验证正确后的克隆测序，测序结果显示去除酶切位点后序列长度为1782bp。经NCBIBLAST比对，与已公布的拟南芥NPＲ1全长CDS序列一致。2.3 酵母表达载体的构建 将测序结果与已公布序列比对完全一致的NPＲ1片段与载体pGBKT7、pGADT7分别经EcoＲI、BamHI双酶切后，用T4连接酶连接，构建酵母双杂交表达载体pGBKT7_NPＲ1与pGADT7_NPＲ1。将连接产物转化大肠杆菌得到阳性克隆后，进行单、双酶切验证（图4）。双酶切后电泳检测到约1800bp的目的片段，说明载体构建成功。用BamHⅠ进行单酶切时出现两条带可能是由于单酶切体系中的BamHⅠ错误识别碱基序列并进行切割或者由于质粒在大肠杆菌中进行复制时出现碱基突变所致。 2 2.1 结果与分析 PCＲ扩增拟南芥NPＲ1基因 以引物的Tm降低5℃为基准，上下加减5℃设 图4 pGBKT7_NPＲ1与pGADT7_NPＲ1质粒酶切结果 2.4重组质粒的酵母菌转化 图3LongAmp酶扩增得到的NPＲ1全长CDS 1，2为目的片段。 将重组质粒pGBKT7_NPＲ1与pGADT7_NPＲ1 分别转化至Gold酵母菌株中，热激转化后将菌悬液 28℃恒温涂布于SD/－Trp与SD/－Leu培养基上， 培养2～3d后，观察酵母菌的生长情况（图5）。结果表明，重组质粒已成功转入到宿主酵母菌细胞内。 216CＲOPＲESEAＲCH2013，27（3） functionofArabidopsisNPＲ1requiresthecoreofitsBTB/POZdomainandtheoxidationofC－Terminalcys-teines［J］.ThePlantCell，2006，18（12）：3670－3685. ［2］KinkemaM，FanW，DongXN.Nuclearlocalizationof NPＲ1isrequiredforactivationofPＲgeneexpression［J］.ThePlantCell，2000，12（12）：2339－2350.［3］CaoH，GlazebrookJ，ClarkeJD，etal.TheArabidopsis NPＲ1genethatcontrolssystemicacquiredresistanceen-图5 含NPＲ1CDS重组质粒的Gold酵母菌转化子 （1）pGBKT7_NPＲ1；（2）pGADT7_NPＲ1。 codesanovelproteincontainingankyrinrepeats［J］.Cell，1997，88（1）：57－63. ［4］FuZQ，YangSP，SalehA，etal.NPＲ3andNPＲ4arere-ceptorsfortheimmunesignalsalicylicacidinplants［J］.Nature，2012，486：228－232. ［5］SpoelSH，DongX.Howdoplantsachieveimmunityde-fensewithoutspecializedimmunecells［J］.NatureＲevImmunol，2012，12（2）：89－100. ［6］MouZL，FanWH，DongXN.Inducersofplantsystemic acquiredresistanceregulateNPＲ1functionthroughredoxJ］.Cell，2003，113（7）：935－944.changes［ ［7］LindermayrC，SellS，MuB，etal.Ｒedoxregulationof theNPＲ1－TGA1systemofArabidopsisthalianabyni-J］.ThePlantCell，2010，22（8）：2894－tricoxide［2907. ［8］ZhangYL，ChengYT，ChengN，etal.Negativeregula-tionofdefenseresponsesinArabidopsisbytwoNPＲ1paralogs［J］.ThePlantJournal，2006，48（5）：647－656. ［9］ChenZ，SilvaH，KlessigD.Involvementofreactiveoxy-genspeciesintheinductionofsystemicacquiredresist-J］.Science，1993，262：ancebysalicylicacidinplants［1883－1886. ［10］ParkSW，KaimoyoE，MosherKD，etal.Methylsalicy-lateisacriticalmobilesignalforplantsystemicacquiredresistance［J］.Science，2007，318：113－116. ［11］PieterseCMJ，Leon－ＲeyesA，derEntSV，etal.Net-workingbysmall－moleculehormonesinplantimmunity［J］.NatureChemicalBiology，2009，5：308－316.［12］MooreJW，LoakeGJ，SpoelSH.Transcriptiondynamics inplantimmunity［J］.ThePlantCell，2011，23（8）：2809－2820. ［13］WeigelＲＲ，PtznerUM，GatzC.InteractionofNIMIN1 withNPＲ1modulatesPＲgeneexpressioninArabidopsis［J］.ThePlantCell，2005，17（4）：1279－1291. 3讨论与小结 SA介导的系统获得性在各种植物防御途径中， 并且被认为是植物应对细抗性（SAＲ）已见大量报道， ［9］ 菌性病害过程中十分关键的机制。SAＲ过程发生在受感染植株的健康部位中。植物局部组织受到病 原菌侵染后，一类可移动的信号分子通过维管系统运 ［10］ 如输至其它部位并且启动相应的免疫应答反应，激素水平提高、防御基因表达、次级代谢物累积、形态 学改变等。水杨酸作为SAＲ信号途径起始位点中必不可少的一种信号分子，它介导着一大类编码具有抗 ［11］ 菌作用的蛋白质的基因表达。在水杨酸信号传导NPＲ1被证明是必需的一个反式作用因子［3］。途径中， NPＲ1水杨酸信号导致细胞内氧化还原电势的改变，被转运进入到细胞核内，并与一些转录因子相互作 ［12］［1，2，6，7，13］ 。然而，SA进而调控防御基因的转录用， 途径与其它信号途径的相互调节作用机理尚不清楚。 因此，研究NPＲ1与其它可能参与调控的蛋白质相互作用模式十分必要。 本研究利用基因重组将拟南芥NPＲ1全长CDS分别克隆到酵母表达载体pGBKT7与pGADT7中。重组质粒通过大肠杆菌转化获得了阳性克隆，经过菌落PCＲ及单、双酶切验证重组质粒构建成功。将重组质粒又转化到Gold酵母菌中，并且在相应筛选培养基上成功获得了转酵母菌成功的阳性克隆。本研究结果为利用NPＲ1进行酵母筛库以及蛋白相互作用的验证奠定了实验基础，有利于进一步研究NPＲ1与其它可能参与调控的蛋白质相互作用模式，进一步阐明NPＲ1在信号传导途径互作中行使的功能。参考文献： ［1］ ＲochonA，BoyleP，WignesT，etal.Thecoactivator