蛋白质标准曲线测试方法
试剂与器材 一、试剂
考马斯亮蓝试剂:
考马斯亮蓝G―250 100 mg溶于50 mL 95%乙醇中,加入100 mL 85%磷酸,用蒸馏水稀释至1000 mL。
二、标准和待测蛋白质溶液 1. 标准蛋白质溶液
结晶牛血清蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度用9gl/L NaCl配制成0.1 mg/mL蛋白溶液。 三、器材
试管1.5×15 cm(×6),试管架,移液管管0.5 mL(×2);1 mL(×2);5 mL(×1);恒温水浴;分光光度计。 操作方法
一、制作标准曲线
取7支试管,按下表平行操作。 试管编号 标准蛋白溶液(mL) 9gl/LNaCl(mL) 考马斯亮蓝试剂 蛋白质浓度ug/ml
10
20
30
40
0 0
1 0.1
2 0.2
3 0.3
4 0.4
5 0.5
6 0.6
7 0.7
8 0.8
9 0.9
10 1.0
0.1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
4mL
50 60 70 80 90 100
摇匀,1h内以0号管为空白对照,在595 nm处比色
绘制标准曲线:以A595 nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标,在坐标纸上绘制标准曲线。 二、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上,取1样品,加4ml考马斯亮蓝溶液,使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595 nm值,在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量,从而计算出未知样品的蛋白质浓度(ug/mL)。(超出范围应稀释样品。) 注意事项
在试剂加入后的5-20 min内测定光吸收,因为在这段时间内颜色是最稳定的。
测定中,蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上,测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
利用考马斯亮蓝法分析蛋白必须要掌握好分光光度计的正确使用,重复测定吸光度时,比色杯一定要冲洗干净,制作蛋白标准曲线的时候,蛋白标准品最好是从低浓度到高浓度测定,防止误差。
Oorigin做直线图,直线拟合后出如下图,R2=-0.997 Y=0.00687 X + 0.0527,应用公式计算未知样品蛋白质浓度。
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