鸽副黏病毒1型的分离与鉴定

动物医学进展。2008，29(7)：44—46 Progress in Veterinary M edicine 鸽副黏病毒 1型的分离与鉴定 黄爱芳，邱深本，罗映霞 (广东科贸职业学院。广东广州 510430) 摘 要：用SPF鸡胚从疑似鸽新城疫病鸽群中分离到 1株病毒，该病毒株能凝集鸡红细胞，该凝集作用 能被抗新城疫病毒阳性血清抑制。分离株经肌肉注射能使鸽发病和死亡，出现与自然发病鸽一致的症状和 病 变。收集发病鸽的病料再进行鸡胚增殖，又重新分 离到此病毒。对该分离株进行理化特性研究，血凝素热 稳定指数为 1O，病毒对氯仿、乙醚、胰蛋白酶、盐酸(pH 5．O)敏感，O．1 甲醛溶液能完全灭活病毒。对该分 离株进行毒力测定，鸡胚平均死亡时间为7O．8 h，1日龄雏鸡脑内接种致病指数 1．6O。结果表明，分离株为 中等毒力鸽I型副黏病毒。 关键词：鸽副黏病毒 1型；分离；鉴定；鸽 中图分类号：S852．659．5；$858．39 文献标识码：A 文章编号 ：1007—5038(2008)07—0044—03 鸽新城疫是由鸽副黏病毒 1型 (Pigeon pa— ramyxo virus type 1，PPMV-1)引起的鸽的一种高 度接触性、败血性、急性传染病，临床症状主要表现 为肠炎、下痢和神经症状。 1981年在苏丹和埃及的信鸽中首先发现鸽副 黏病毒 1型，此后迅速传播，现已遍及世界许多国家 和地区。1985年，PPMV一1传人香港，同年我国大 陆从台湾引进种鸽中检出 PPMV一1。迄今，我国很 多省份都有该病的报道并分离到病毒。 2006年，某鸽场鸽群拉黄绿色水样粪，肛门周 围粘有绿粪，羽毛蓬松，食欲减退或废绝，少数鸽头 颈扭曲，剖检病死鸽。剖检病死鸽，可见鼻、气管黏 膜充血，有的布满大小不等的出血点，胃及小肠黏膜 充血或点状出血，盲肠扁桃体肿大、出血。神经症状 的病鸽，除以上剖检变化外，可见大脑、小脑严重出 血。为进一步确诊病原，进行了一系列试验，现 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 如下 。 1 材料与方法 1．1 鸡胚、鸽、毒株和 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 血清 SPF鸡胚购自北京实验动物研究中心；新城疫 阳性血清 、禽流感 阳性血清(H5、H7、H9)购 自中国 农业科学院哈尔滨兽医研究所；新城疫 F48E9株、 N?9株购自中国兽药监察所I乳鸽为增城某肉鸽场 提供的非免疫鸽，新城疫 HI抗体效价为0。 1．2 病料来源 无菌采取增城某发病鸽场的可疑病鸽的脾、肺、 脑、肠等组织。 1．3 病毒分离鉴定 1．3．1 鸡胚接种 按文献[1]方法进行。将鸽的不 同组织分别研磨，按 1：5加人无菌PBS，反复冻融3 次，加人双抗，37℃作用 2 h，3 000 r／min离心 15 min，取上清液，经尿囊腔接种 9日龄～10日龄 SPF鸡胚。每份病料各接种 4枚，每枚 0．2 mL， 37℃孵育，弃 24 h内死亡胚，逐日观察收集死亡胚 和至120 h未死胚。取尿囊液进行血凝试验(HA)， 未出现血凝者，盲传 3代。同时接种 F48E9株、N79 株作为对照试验。 1_3．2 效价测定 按常规方法测定鸡胚尿囊液的 HA效价。 1_3．3 血凝抑制试验 将 HA试验中呈阳性的尿 囊液分别用新城疫、禽流感(H5、H7、H9)阳性血清 进行 HI试验，以鉴定分离株的类型。 1．3．4 动物回归试验 将分离株的鸡胚尿囊液 1O 倍稀释，肌肉注射 1O只乳鸽，每只 0．5 mL，观察其 发病情况， 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 发病、死亡状况。剖检病死鸽，并取 病料制成匀浆离心，取上清液接种 10日龄鸡胚，重 新分离病毒。 1．4 病毒的理化特性测定 参照文献[2]方法进行理化特性血凝素热稳定 性、氯仿敏感性、乙醚敏感性、耐酸性、胰酶敏感性及 甲醛灭活试验的测定。 收稿日期：2008—04·14 作者简介：黄爱芳(1975一)，女。山东淄博人，讲师，硕士，主要从事动物传染病学研究。 维普资讯 http://www.cqvip.com 黄爱芳等：鸽副黏病毒 1型的分离与鉴定 45 1．5 病毒毒力测定 参照文献 [1]方 法测定 鸡胚平 均死亡 时间 (MDT)和鸡脑内接种指数(ICPI)。 2 结果 2．1 病毒的分离与鉴定 对照株 F48E于 36 h内全部致死鸡胚，HA滴 度 1：256，分离株首代接种鸡胚至 96 h死亡，血凝 价为 1：4，第 2代血凝价为 1：64，第 3代血凝价为 1：256。死亡胚体水肿，出血，头部出血尤为严重。 用新城疫、禽流感阳性血清进行 HI试验，发现新城 疫阳性血清能完全抑制其对鸡红细胞的血凝性，而 禽流感阳性血清则不能抑制其对鸡红细胞的血凝 性。动物回归试验结果表明，接种乳鸽第 8天开始 发病，出现不同程度的症状和病变。所有发病的鸽 都排绿色稀粪，两翅或一翅下垂，羽毛松乱，不能站 立，食欲废绝，缩颈歪头，出现神经症状。剖检见病 死鸽肝、肺出血，肾苍白肿大，脑出血且有坏死，腺胃 有出血点。收集发病鸽的病料再进行鸡胚增殖，又 重新分离到此病毒。以上结果表明，所分离的病毒 为鸽 I型副黏病毒。 2．2 病毒的理化特性测定 2．2．1 血凝素热稳定性试验 分离株、F48E9、N79 的血凝素热稳定性指数分别为 1O、3、5 min。 2．2．2 氯仿敏感性试验 分离株、F48E9、N79的 血凝效价和对照组相差 2个数量级以上，因而判定 分离株对氯仿敏感。 2．2．3 乙醚敏感 性试验 乙醚敏感性试验中分离 株、F48E9、N79血凝滴度降低至 0，显然对乙醚敏 感 。 2．2．4 耐酸性试验 分离株、F48E9、N79的尿囊 液经 pH分别为 3．0、5．0的盐酸处理后，血凝价明 显下降，因而判定分离株对酸敏感。 2．2．5 胰蛋白酶消化试验 经 pH 7．7的胰蛋白酶 处理后，F48E9(2 )的血凝效价未发生变化，说明对 胰蛋白酶有抵抗力；分离株血凝效价从 2。下降为 2。，N79，从 2。下降为 2 ，说明病毒对胰蛋白酶敏感。 2．2．6 甲醛灭活试 验 病毒尿囊液经 0．2 、 0．1 、0．05 、0．01蛐 甲醛溶液作用后，取这4个 浓度分别接种鸡胚，0．05 o／／、0．01 甲醛溶液的鸡胚 分别在 74 h、93 h全部死亡，说明甲醛浓度过低，无 法完全灭活病毒。接种 0．2 o／／、0．1 的鸡胚在120 h 仍存活，尿囊液检测无血凝性，即病毒完全灭活。 2．3 病毒毒力测定 2．3．1 鸡胚平均死亡时间(MDT)测定 从表 1可 见分离株的MDT为 7O．8 h。 2．3．2 鸡脑内接种指数(IcPI)测定 从表 2可见 分离株的ICPI为 1．60。 表 1 鸡胚平均死亡时间(MDT)的测定结果 Table 1 The results of mean-dead time in chick embryos 维普资讯 http://www.cqvip.com 46 动物医学进展 2008年 第 29卷 第 7期 (总第 179期 ) 3 讨论 本试验用 SPF鸡胚从发病鸽群中分离到 1株病 毒。经 HA、HI试验及动物回归试验证明，该分离 株属于鸽新城疫病毒。 回归动物试验表明，该分离株需要经过一个潜 伏期(人工接种后 7 d～8 d开始发病死亡)方可使人 工感染鸽发病，表现出与 自然发病鸽相同的临床症 状和病理变化。这 与这与有关学者报道[3 基本一 致 。 PPMV一1由于长期在鸽体 内传代 ，变成 了适应 鸽体寄生和增殖的病毒群，并发生了一定程度的变 异，对鸽极为敏感，具有较强的致病作用，但对鸡的 致病力低；而鸡 NDV可使鸡和鸽均发病。有人认为 引起鸽群暴发性发病的病毒属鸽副黏病毒亚群，它 有别于古典的鸡 NDV，用单克隆抗体可 以区别 PPMV一1和鸡 NDV[4 ]。因此，Collins M S等[83将 鸽 PPMV一1另立为一个群。本研究理化特性试验表 明该毒株血凝素热稳定性比 F48E9、N79高，这与有 关学者的研究结果一致[3 ；对氯仿 、乙醚 、酸和胰 蛋 白酶敏感；甲醛溶液的浓度对病毒血凝性有较大 影响，高浓度的甲醛溶液显著降低 HA滴度，当甲醛 溶液浓度大于 0．5 时，分离株完全丧失血凝性。 按照国际上规定的新城疫毒力判定标准，对分 离株进行了 MDT、ICPI等生物学特性测定。结果 分离株 MDT为 70．8 h，ICPI为 1．60。当平均死亡 时间(MDT)<60 h，脑内接种指数(ICPI)>1．6时 判定为强毒株；当 MDT>90 h，ICPI<0．8时为弱 毒株。因此，该分离株为中强毒力毒株。 通过对该分离株的分离和生物学特性研究，为 制定科学的防治措施，研制有效的鸽新城疫疫苗奠 定 了基础 。 参考文献： [1] 国际兽疫局．诊断试验和疫苗标准手册[M]．北京t 1996：140— 146． [2] 殷 震，刘景华．动物病毒学[M]．北京t科学技术 出版社， 1997：331—336． [3] 李 柠，黄引贤，李乃津，等．鸽禽 I型副黏病毒生物学特性的 比较研究[J]．中国畜禽传染病，1994，(2)；1-5． [41 Alexander D J，Russell P H．Parsons G，et 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virus． Key words：Pigeon paramyxovirus type 1；isolation；identification；pigeon 维普资讯 http://www.cqvip.com