第二章 动物细胞培养

第二章动物细胞培养Hela细胞株人正常胎肝细胞系动物细胞培养的发展历史1859年,法国解剖学家Valpian最早尝试了蛙胚尾部组织的体外培养.1885年，WilhelmRoux把鸡胚的神经板在温热的盐水中维持其存活若干天；1906年，Beebe和Ewing在动物的血液中尝试培养了传染性狗淋巴肉瘤的细胞；1907，美国的哈里森使用盖玻片悬滴培养蛙胚神经组织细胞；20世纪初，Carrel将外科手术的无菌操作观念带到了体外培养的实验之中。RossGranvilleHarrison1870–1959,Americanbiologistandanatomist,b.Germantown,Pa.,Ph.D.JohnsHopkins,1894.HewenttoYaleasprofessorofcomparativeanatomyin1907andheldvarioushonorarypositionsthereuntilhisdeath.Heisknownforhisworkonnervedevelopmentintheembryoandonnerveregenerationaswellasforhisdiscoveryofamethodoftissueculturethatpermitsstudyofisolatedlivingcellsinacontrolledenvironment.Harrison：组织培养之父                 TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1912"inrecognitionofhisworkonvascularsutureandthetransplantationofbloodvesselsandorgans"AlexisCarrelFranceRockefellerInstituteforMedicalResearchNewYork,NY,USAb.1873d.1944动物细胞培养中的常用术语细胞培养；组织培养；器官培养原代培养；传代培养；代细胞系；细胞株有限细胞系；无限细胞系体外转化；体外恶性转化细胞分裂指数；克隆形成率第一节细胞培养需要具备的基本条件体外培养细胞的基本特征影响细胞体外培养的理化因素细胞培养实验室的设置设备器具的清洗与无菌操作（一）体外培养细胞的分型１.贴附型：一、体外培养细胞的基本特性2.悬浮型：成纤维型细胞上皮型细胞游走型细胞多形型细胞按照体外培养细胞的形态，可以分为：1.粘附型成纤维型细胞上皮型细胞游走型细胞多形型细胞2.悬浮型：　　形态？来源？生长特点？（二）体外培养细胞的超微结构细胞外被：糖蛋白膜，利于细胞贴壁。一、体外培养细胞的基本特性细胞骨架：正常细胞微丝微管走行有一定方向性，转化后行走紊乱。细胞核：与体内正常细胞差不多。细胞器：线粒体、内质网、高尔基体等多集中在细胞核周围。（三）体外培养细胞的生长和增殖特性一、体外培养细胞的基本特性增殖态:指细胞增殖的状态和过程功能态:细胞处于执行特定功能活动（如分泌、传导、吞噬、收缩等）时期的状态1.培养细胞的增殖态和功能态一、体外培养细胞的基本特性（三）体外培养细胞的生长和增殖特性2.培养细胞生命期（LifeSpanofCultureCells）细胞在培养中持续增殖和生长的时间，通常以体外最终可以传代的次数 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示。原代培养期：传代期：衰退期：正常细胞生命期大致经历3个阶段可见细胞分裂，但不旺盛原代培养期细胞的主要特点：细胞群是异质的（Heterogeneous）细胞克隆形成率(CloningEfficiency)很低初代培养细胞多呈二倍体核型是检测药物很好的实验对象持续时间长传代培养期细胞的主要特点：需早期冻存细胞增殖旺盛，能维持二倍体核型细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；衰退培养期细胞的主要特点：细胞形态轮廓增强，最后衰退凋亡。注:细胞永生性和恶性性非同一性状。无限细胞系或连续细胞系3.每代贴附生长细胞的生长过程　　细胞传一代后，一般要经过以下三个阶段：潜伏期指数增生期平顶期潜伏期的特点细胞由游离逐渐贴附细胞可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期　　细胞贴附现象是一个非常复杂和与多种因素相关的过程如细胞种类、支持物、促贴附物质等。潜伏期出现的原因？影响潜伏期长短的因素？是细胞增生最活跃、活力最旺盛的阶段指数增生期特点细胞群体均一，是理想的实验用细胞培养物中细胞数量呈指数增长接触抑制？肿瘤细胞接触抑制消失停滞期特点细胞数量达饱和密度，出现密度抑制细胞活动小,细胞膜的活动小生长组分下降:0－10%及时传代：（四）体内外细胞的差异一、体外培养细胞的基本特性1.形态的差异：细胞体外培养形态，难以完全反应体内情况。2.分化的差异：体内细胞听命于外源信号，体外细胞信号来源切断，出现特定基因分化表达减弱或停止。无菌、无毒：体外培养细胞的首要条件。二、影响细胞培养的理化因素支持物：表面理化性质，细胞与其接触的机会和亲和性等。营养条件：葡萄糖；氨基酸与蛋白质；维生素与生物活性因子等渗透压：260-320mmol/l水：三蒸水或超纯水，存放时间一般不超过2周气体：氧，二氧化碳pH：7.2-7.4温度：哺乳动物细胞37℃±0.5℃动物细胞培养实验室的设置设备风淋室传递窗CO2培养箱倒置显微镜大容量高压灭菌器全自动三重纯水蒸馏器超纯水装置滤器Zeiss滤器：过滤除菌：大多数培养用液，如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌酶标仪微孔板震荡器液氮罐移液器四、器具的清洁与无菌操作(一)常用器具的清洗1.玻璃器皿清水浸泡软毛刷沾洗涤剂刷洗自来水冲洗晾干酸液浸泡过夜自来水冲洗10次以上三蒸水漂洗三次烘干备用酸液的配制2.塑料及橡胶制品清水浸泡2%NaOH浸泡过夜自来水冲洗5%稀盐酸浸泡30分钟自来水冲洗10次以上三蒸水漂洗3次晾干备用3.金属制品的清洗毛刷沾洗净剂刷洗或75%酒精擦洗自来水反复冲洗三蒸水漂洗3次烘干备用无菌室与工作台消毒(二)器具的灭菌与消毒金属器械、橡胶和塑料制品的消毒玻璃器皿消毒第二节培养基及各种细胞培养用液培养液细胞培养其他常用液消化液pH调整液抗生素液天然培养液人工合成培养液无血清培养液平衡盐溶液1.平衡盐溶液（BSS）同时具备缓冲液的缓冲能力、生理盐水的等渗性以及培养液的营养供应等特点。　血清、水解乳蛋白、胚胎浸出液、组织液、淋巴液和血浆等血清种类血清质量判定 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 血清中所含的大体成分2.天然培养基血清中所含大体成分多种蛋白质（白蛋白，球蛋白，铁蛋白及转移蛋白等）多种金属离子激素促贴附物质各种生长因子不明成分血清的优缺点血清的使用 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 3.人工合成培养基：合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟而成。几种常用合成培养基MEM：低限量Eagle培养基Mccoy’s5A：原代培养、难以培养的细胞M199、109培养基：Morgan研制成功F12：具有十分复杂的组分，适合进行单细胞培养和克隆化培养RPMI1640：Moor等研制成功，悬浮、肿瘤、原代、传代等细胞DMEM：Dulbecco’sModifiedEagleMedium，贴壁细胞常用细胞系培养基的选择？天然培养基与人工合成培养基的比较缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要标准化生产，组成和含量相对固定，成本低人工合成培养基来源受限，成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 ，易发生支原体污染营养成分丰富，培养效果好天然培养基缺点优点培养基类型4.无血清培养基基本培养基+替代血清的补充成分胰蛋白酶液:牛胰脏中提取的黄白色粉末，作用强烈，对细胞伤害大。EDTA液:通过鏊合钙离子等，改变细胞间的连接，使组织或细胞分散成单个细胞胶原酶液：细菌中提取，作用温和。5.消化液　表4-1胰蛋白酶和胶原酶生物活性的差别　项目　　胰蛋白酶　　胶原酶消化特性组织　适用于消化软组织适用于消化纤维多的　用量　　0.01%～0.5%0.1～0.3mg/ml消化时间　　　0.5～2小时（小块）1～12小　　pH　8～96.5～7.0作用强度　　　强烈缓和细胞影响　　　时间过长有影响无大影响血清钙镁离子　　　有影响无影响6.pH调整液NaCO3溶液：常用浓度有7.4%，5.6%和3.7%三种Hepes液：羟乙基哌嗪乙璜酸，氢离子缓冲剂第三节原代及传代细胞培养一、原代培养也称初代培养，是从供体取得组织细胞后在体外生长环境中持续培养，中途不分割培养细胞的培养过程。组织块培养法离散细胞培养法鼠胚组织取材鸡鸭鸟类胚胎组织取材组织块培养法分散细胞培养法机械分散法方法:计数板的准备染色加悬液镜检细胞计数动物细胞原代培养过程图思考：传代前为何要换液？怎样判断污染？组织块培养结果离散细胞培养结果根据细胞生长的特点，传代方法有3种：悬浮生长细胞传代离心法传代：直接传代法：半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）贴壁生长细胞传代采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。二、传代培养三、细胞系或细胞株的命名和建系HeLa：为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）NIH3T3：美国国立卫生研究院（NationalInstituteofHealth）建立；每3天传一代，每次接种3×105细胞／毫升。CHO：中国地鼠卵巢细胞（ChineseHamsterOvary）宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立细胞的命名无严格统一规定，大多采用有一定意义的缩写字或代号表示。四、体外培养细胞的纯化悬浮细胞纯化：贴壁细胞纯化：密度梯度离心含固化抗体的细胞分离柱依据贴壁速度不同依据对消化酶敏感性不同第四节培养细胞的常规检测微生物污染的检测与排除生长与增殖特性的检测※细胞形态观察一、微生物的检测与排除（一）微生物污染的途径及预防微生物污染的途径有哪些？对细胞培养实验有何启示？1.真菌污染的检测：显微镜观察（二）微生物污染的检测2.细菌污染的检测①肉眼观察培养液是否混浊,颜色是否变黄②显微镜下观察是否有菌体③取培养液进行细菌培养是否出现菌落　3.支原体污染的检测高倍相差显微镜检测地衣红染色法检测荧光法检测电子显微镜检测3.支原体污染的检测支原体电镜照片,煎蛋状荧光染色细胞病变效应检测正常的BHK-21细胞BHK-21细胞病变图4.病毒污染的检测4.病毒污染的检测血细胞吸附检测4.病毒污染的检测细胞病变效应检测PCR检测免疫学方法检测血细胞吸附检测电子显微镜检测（三）微生物污染的排除抗生素加温法巨噬细胞吞噬法动物体内接种法二、细胞形态观察光学显微镜：细胞形状、细胞大小、核质比、核仁大小及多少等电子显微镜：微绒毛、桥粒、微管微丝、核仁的形态及数量等三、生长增殖特性的检测生长曲线：细胞群体倍增时间有丝分裂指数(MI)：MTT法：标记核苷酸(3H-TdR)掺入量：克隆形成率：第五节无限细胞系的建立癌细胞体外培养的特性※肿瘤细胞的建系方法一、癌细胞体外培养特性癌细胞形态特征：核质比增大，核仁增大增多，核糖体颗粒丰富癌细胞的遗传特性：异倍体或多倍体核型，染色体片段的移位与缺失，癌基因特异表达等癌细胞的浸润性：癌细胞的生长特性：永生性，血清依赖小，克隆形成率高体内癌细胞的原代培养：如Hela细胞株体外培养细胞的转化：如PK细胞株，IB细胞株等二、肿瘤细胞的建系方法二、肿瘤细胞的建系方法取材：尽量取瘤组织边缘 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 培养方式：与正常二倍体细胞培养相同培养基：对培养基的要求不严格适宜底物：改善贴壁条件会有好效果成纤维细胞的排除：机械刮除法，反复贴壁法，消化排除法，密度梯度离心法1.体内癌细胞的原代培养诱发转化：诱导DNA结构发生稳定性突变。有化学法、物理法、生物法自发转化：原因不明二、肿瘤细胞的建系方法2.体外培养细胞的转化细胞转化的检测培养细胞的一般特征：细胞形态、生长速度、倍增时间、克隆形成率、血清依赖性、表面抗原和接触抑制等培养细胞的遗传学特征：核型分析和染色体畸变等恶性测试：软琼脂培养、浸润性检测和异体动物接种检测2.体外培养细胞的转化第六节动物细胞培养技术的应用活细胞的生物学特性研究疫苗制备生物活性因子的制备单克隆抗体药物检测组织工程小结：1.理解体外培养细胞的基本特性：即分型、生命期及一代生长增殖过程。2.掌握动物细胞培养的常规操作技术：包括器皿的清洗、各种培养用液的用途及制备方法、原代和传代细胞培养及常规检测。3.掌握癌细胞体外培养特性及细胞转化的检测4.了解动物细胞培养技术的应用；睡醒了吗？--谢谢各位!