MMP3在早期骨关节炎模型软骨下骨的表达跟其意义_张荣凯新

［文章编号］1000－4718(2011)12－2391－05［收稿日期］2011－07－13［修回日期］2011－10－21*［基金项目］国家863高技术研究发展 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 资助项目(No．2008AA02Z437)△通讯作者Tel:020－85252229;E－mail:caidaozhang@gmail．comMMP3在早期骨关节炎模型软骨下骨的 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达及其意义*张荣凯1，2，方航2，卢华定2，陈郁鲜2，宋炎成2，曾春2，赵庆1，蔡道章2△(1中山大学附属第五医院骨科1区，广东珠海519000;2中山大学附属第三医院关节外科，广东广州510630)［摘要］目的:研究早期骨关节炎软骨下骨基质金属蛋白酶3(MMP3)的表达情况，为阐述其在骨关节炎致病中的重要作用提供依据。方法:大鼠分为实验组(n=30)和对照组(n=30)。实验组切除右膝内侧半月板并切断内侧副韧带，对照组仅切开关节囊。于术后1、2、4周取右膝关节标本，病理检查验证造模成功后，采用qPCR技术及免疫组化技术从基因水平及蛋白水平全面分析软骨下骨MMP3的表达情况。结果:(1)术后1周，软骨下骨的MMP3在实验组的表达量明显升高，是对照组的8．34倍(P＜0.05);术后2周，MMP3在实验组的表达量也升高，是对照组的4．85倍(P＜0.05)，但相对于术后1周，表达量有所下降;术后4周，2组的MMP3表达量无显著差异;(2)术后1周与术后2周，实验组软骨下骨区检测到大量的MMP3阳性细胞，以小单核细胞及多核巨细胞为主，术后4周实验组、对照组及阴性对照组织切片均未检测到MMP3阳性细胞。结论:软骨下骨MMP3表达在早期骨关节炎致病机制中起了重要作用。［关键词］骨关节炎;软骨下骨;基质金属蛋白酶3;大鼠［中图分类号］R363［文献标识码］Adoi:10．3969/j．issn．1000－4718．2011．12．029ExpressionofMMP3insubchondralbonesinearlyexperimentalosteoar-thritisZHANGRong－kai1，2，FANGHang2，LUHua－ding2，CHENYu－xian2，SONGYan－cheng2，ZENGChun2，ZHAOQing1，CAIDao－zhang2(1Area1ofDepartmentofOrthopedics，TheFifthAffiliatedHospitalofSunYat－senUniversity，Zhuhai519000，China;2DepartmentofOrthopedics，TheThirdAffiliatedHospitalofSunYat－senUniversity，Guangzhou510630，China．E－mail:caidaozhang@gmail．com)［ABSTRACT］AIM:Todemonstratethatmatrixmetalloproteinase3(MMP3)playsMMP3playanimportantroleinthepathogenesisofosteoarthritisbystudyingtheexpressionofMMP3insubchondralbonesinearlyexperimentalosteoar-thritisatgeneandproteinlevels．METHODS:TheSDratswererandomlydividedinto2groups:experimentalgroupandcontrolgroup，eachcontaining30ratswithsimilarbodyweight．Therightkneejointsoftheratsinexperimentalgroupun-derwentsurgery，whichinvolvedinbothmedialcollateralligament(MCL)transectionandmedialmeniscectomy，whiletheanimalsincontrolgroupwereonlycarriedoutashamoperation．Theratswerekilledatthe1st，2ndand4thweekspost－surgerytoobtaintherightkneejoints．Pathologicalanalysiswasperformedtovalidatethisearlyosteoarthriticratmodel．TheexpressionofMMP3insubchondralbonesatmRNAandproteinlevelswasevaluatedbyreal－timepolymerasechainreactionandimmunohistochemicalstaining，respectively．RESULTS:TheexpressionofMMP3insubchondralboneswassignificantlyincreasedatboththe1stand2ndweekspost－surgeryinexperimentalgroup，withthefoldchangesof8．34(P＜0.05)and4．85(P＜0.05)，respectively，ascomparedwithcontrolgroup．NodifferentiallyexpressionofMMP3wasobservedatthe4thweekpost－surgerybetweenthese2groups．AlotofMMP3positivecells，includingsmallmononuclearcellsandbiggerpolynucleargiantcells，werefoundinsubchondralbonesinexperimentalgroupatthe1stand2ndweekspost－surgery，butnotincontrolgroup．Atthe4thweekpost－surgery，noMMP3positivecellswerefoundinsubchondralbonesofbothgroups．CONCLUSION:MMP3playsanimportantroleinthepathogenesisofearlyexperimentalosteoar-thritis．［KEYWORDS］Osteoarthritis;Subchondralbone;Matrixmetalloproteinase3;Rats·1932·中国病理生理杂志ChineseJournalofPathophysiology2011，27(12):2391－2395骨性关节炎(osteoarthritis，OA)是一种退变性关节疾病，主要是关节软骨的退变降解，表现为进行性软骨变薄、纤维化、糜烂、裂隙、肉眼下溃疡及全层关节面消失等，并涉及关节的其它组织，包括关节的滑膜、软骨下骨及肌肉、韧带等结构的改变［1］。以往对OA的病因研究多集中于关节软骨的破坏，目前越来越多的研究表明，软骨下骨改变在OA发病过程中起着积极作用，软骨下骨改变有可能先于关节软骨的变化［2－3］。最近研究表明，破骨细胞在早期骨关节炎疾病进程中起了重要作用，在骨关节炎早期，软骨下骨的破骨细胞活动增强，从而导致骨吸收作用明显强于成骨作用，进而引起软骨下骨的骨量丢失，骨质量下降。在软骨下骨的骨吸收作用中，基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinases，MMPs)起了重要的作用，可降解关节中的骨基质，特别是破骨细胞表达的基质金属蛋白酶3(matrixmetalloproteinase3，MMP3)可能在软骨下骨的骨吸引中起重要作用［4－5］。然而，有关早期骨关节炎软骨下骨MMP3表达的研究在国内外报道极少。本研究利用大鼠膝关节骨关节炎模型，首次从基因及蛋白水平全面研究早期骨关节炎软骨下骨的MMP3表达情况，为阐述其在骨关节炎致病机制中的重要作用提供依据，有利于OA的早期诊断和治疗。材料和方法1动物选择与分组选取大小、体重相似(10周龄，体重300～325g)的雄性SD大鼠60只，由中山大学动物实验中心提供，并饲养于该实验中心SPF级屏蔽环境中，大鼠分笼饲养，自由饮水和进食。动物房温度(23±3)℃，相对湿度(60±5)%，每天照明12h。大鼠编号后，随机分为对照组(n=30)和实验组(n=30)。2主要的试剂及仪器MMP3多克隆抗体(Abcam);山羊抗鼠IgGⅡ抗(DA-KO)，DAB显色液(康为世纪)，蛋白酶K(Sigma)，EDTA(Sigma)，苏木素(Sigma)，E．Z．N．A．TissueRNAKit(Ome-gaBio－Tek)，All－in－OneTMqPCRMix(GeneCopoeia)，All－in－OneTMqPCRPrimer(GeneCopoeia)，SX手术显微镜(安信化学仪器制造有限公司)，电动磨钻(Strong90，NewPower)，石蜡切片机(Leica)，光学显微镜(LeicaDMI3000B)，iQ5Real－TimePCRDetectionSystem(Bio－Rad)，分光光度计(ND－1000，ThermoScientific)等。3大鼠膝关节骨关节炎模型的建立实验组大鼠用10%水合氯醛(4mL/kg)腹腔内注射麻醉后，选取右膝关节，去毛后，常规消毒铺巾，依次切开皮肤、膝关节囊，行“内侧副韧带切断+内侧半月板切除”，用5－0可吸收线独立缝合关节囊，以5－0丝线间断缝合伤口。术后肌注1次青霉素40000U抗感染，待麻醉苏醒后腹腔注射曲马多(10mg/kg)止痛。同样的方法处理对照组大鼠，但不切断内侧副韧带，也不切除内侧半月板。4标本获取及处理4．1标本的初步处理于术后1、2、4周分别随机抓取大鼠，对照组、实验组各10只。于每一时点，对照组、实验组各5只解剖分离右膝关节，在解剖显微镜下对膝关节面进行观察，大体观察后立即将骨组织置10%多聚甲醛4℃固定保存。另5只分离出膝关节后将股骨髁从骺板处折断后立即将股骨髁放入液氮保存，用于进一步分离软骨下骨组织及提取骨RNA。4．2标本的进一步处理膝关节标本置10%多聚甲醛4℃固定48h后，放入20%EDTA液于4℃冰箱内脱钙4周，每3d换脱钙液1次。常规脱水、浸蜡后包埋，沿膝关节矢状面切片，每隔300μm切片1次，每张切片厚度5μm，行苏木精－伊红(HE)及番红O－固绿(SafraninO－fastgreen)染色进行组织学观察。4．3软骨下骨的分离及其RNA的提取将保存于液氮下的股骨髁拿出，放入液氮容器内并固定，使用微动力磨钻于液氮保护下打磨清除关节软骨及骺板组织，操作中使用手术显微镜确保完全清除其它组织。将分离得到的软骨下骨放入液氮研磨器中，将骨块研磨成粉末后，使用E．Z．N．A．Tis-sueRNAKit，按试剂盒操作说明提取软骨下骨RNA，用分光光度计法及琼脂糖凝胶电泳法鉴定RNA的质量。5实时荧光定量PCR采用染料法(SYBRGreenI)进行相对定量分析，按照ΔΔCt解析法来进行实验设计，以GAPDH作为内参照基因。MMP3上游引物5'－CGGTGGCTTCAGTACCTTTC－3'，下游引物5'－ACCTCCTCCCAGACCTTCA－3'。标本RNA反转录、qPCR反应体系建立实验步骤按试剂盒说明操作。PCR反应条件，采用了 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 的三步法程序进行反应:95℃预变10min1个循环;95℃10s，60℃20s，72℃10s，40个循环。6免疫组化检测每块骨组织连续切取5张切片(每张厚度5μm，相距300μm)行免疫组化染色:采用SABC(链霉亲和素生物素酶复合物)法，阴性对照以PBS代替Ⅰ抗，以人乳腺癌组织切片为阳性对照。切片常规脱蜡，水化，用3%H2O2避光封闭15min，柠檬酸高温高压8min和蛋白酶K修复抗原后，加MMP3Ⅰ抗4℃下孵育过夜，将带辣根过氧化酶Ⅱ抗37℃下孵育20min，DAB溶液光镜下控制显色，漂洗后苏木素复染、脱水、透明，中性树脂封片，切片置于40倍显微镜下观察切片。7统计学处理采用SPSS16．0软件进行统计学分析，数据以均数±标准差(珋x±s)，均数比较采用t检验，α=0.05。结果1SD大鼠膝关节骨关节炎模型的成功建立1．1术后膝关节大体标本观察结果术后1周，实验组与对照组与股骨髁软骨面光滑如常，关节面无破损;术后2周，实验组股骨内侧髁与胫骨内侧平台软骨表面稍显粗糙，极少关节面见轻微糜烂，外侧股骨髁光滑如常;术后4周，实验组双侧股骨髁均见明显的软骨面轻度糜烂，部分关节溃疡磨损，而且内侧股骨髁比外侧更严重，无骨赘形成。1．2术后膝关节病理切片观察结果术后1周，实验组与对照组软骨表面光滑平整，细胞数目和软骨细胞排列无明显差异，番红O－固绿染色不均匀，特别是表层染色减退，但潮线·2932·尚完整，见图1A、B、G、H;术后2周，软骨表面见较多裂隙，有的甚至伸入辐射层，软骨细胞数量明显增多，结构开始有点紊乱，可见软骨细胞簇集，表层细胞变圆及其片状剥脱现象，软骨破坏较重的关节面可见表层软骨变薄，部分关节面纤维组织覆盖，见图1C、D、I、J;术后4周，看见局部表面，软骨细胞脱落消失，直到钙化层和软骨下骨交界处，此处表层覆盖大量的纤维素，细胞数目整体明显增多，细胞簇集现象明显，见图1E、F、K、L。Figure1．Histologicalanalysisofcartilagedegradationateachtimepointpost－surgery(×20)．A，C，E，G，I，K:sectionsstainedwithHE;B，D，F，H，J，L:sectionsstainedwithsafraninO－fastgreen．Scalebar=100μm．图1实验组与对照组标本切片苏木精－伊红(HE)及番红O－固绿染色以上观察结果表明:以“内侧副韧带切断+内侧半月板切除”造成的膝关节不稳，大鼠膝关节骨关节炎表现随着术后时间进展，关节面的损伤慢慢加重，本实验成功建立大鼠膝关节骨关节炎模型［6］。2软骨下骨RNA提取结果实验组与对照组股骨髁标本，用液氮下微动力磨钻打磨的方法分离得到的软骨下骨，进一步提取的骨RNA浓度为(357.71±157.74)mg/L，A260/A280值为2.030±0.014;琼脂糖凝胶电泳法对每个标本RNA分析显示:RNA电泳条带清晰，28S∶18S约为2∶1，表明RNA完整无降解。以上结果表明:本方法在分离软骨下骨时能有效避免骨RNA的降解，确保得到高质量的骨RNA用于后继的qPCR实验。3软骨下骨MMP3mRNA的表达量分析结果实时荧光定量PCR结果示:实验组与假手术组相比较，在术后1周，软骨下骨的MMP3在实验组的表达量明显升高，是对照组的8.34倍(P＜0.05);术后2周，MMP3在实验组的表达量也升高，是对照组的4.85倍(P＜0.05)，但相对于术后1周，表达量有所下降;术后4周，2组的MMP3表达量无差异表达，见图2。以上结果表明，软骨下骨中的MMP3在极早期骨关节炎的表达量明显增加，提示了MMP3在极早期骨关节炎的软骨下骨中可能起了重要的作用。4软骨下骨的MMP3免疫组化结果如图3所示，术后1、2周，实验组软骨下骨区检测到大量的MMP3阳性细胞，以小单核细胞及多核巨细胞为主，其中多核巨细胞胞浆MMP3阳性较明显;特别在靠近骨小梁区，破骨细胞样MMP3阳性多核巨细胞明显增多。而且，术后1周阳性细胞比例明显高于术后2周，阳性的强度也较高。术后4周实验组、对照组及阴性对照组织切片均未检测到MMP3阳性细胞。免疫组化检测结果从蛋白水平验证了早期骨关节炎软骨下骨MMP3的表达，而且与荧光定量PCR的结果相一致。Figure2．MMP3mRNAexpressiondetectedbyreal－timePCRateachtimepoint．*P＜0.05vscontrolgroup．图2实验组与假手术组软骨下骨MMP3mRNA的表达讨论软骨下骨改变在OA发病过程中起着积极作用，特别是与关节软骨紧靠的软骨下骨，其与软骨的相互作用可能也越密切。研究早期OA的软骨下骨改变对于OA的早期诊断、早期治疗有着重大意义［7］。软骨下骨包括软骨下骨板以及紧靠其下方的骨小梁、血管和小梁间的腔隙，在OA病例中，常可以观察到软骨下骨硬化、囊性化、无菌性坏死等改变［8］。有研究表明软骨下骨中产生的炎症因子，可改变软骨细胞的代谢，进而引起关节软骨破坏及进行性恶化［9－10］。然而，目前缺乏早期骨关节炎软骨下骨活体组织的相关研究报道，其原因主要是:(1)获取合适的早期OA的人软骨下骨标本十分困难，而研究晚期OA的软骨下骨标本因硬化、囊性变等晚期改变导致难以推断其早期的分子机制;(2)利·3932·Figure3．ImmunohistochemicalstainingofMMP3insubchondralbones(A，C，E，G，I，K)andpolynucleargiantcells(B，D，F，H，J，L)inexperimentalgroupandcontrolgroupateachtimepointpost－surgery(×40)．图3软骨下骨MMP3免疫组化图用细胞培养技术研究的破骨细胞及成骨细胞的功能容易受培养环境影响，并不能真正地反映活体组织软骨下骨细胞功能改变;(3)获取能用于后继研究的高质量软骨下骨RNA难度较大。因此，本实验设计使用的SD大鼠膝关节骨关节炎模型，结合首创的液氮下微动力磨钻打磨分离膝关节软骨下骨的方法，有效避免了软骨下骨RNA的降解，很好地解决以上矛盾，是软骨下骨基因表达相关研究值得推广的方法。本骨关节炎动物模型与其它动物模型相比，具有体积小、价廉、易饲养、解剖及生理学特点与人类相似的特点。有研究表明，使用前交叉韧带+内侧半月板切除建立的膝关节骨关节炎模型在术后4周与人类的早期膝关节骨关节炎，特别是创伤后(如半月板损伤、交叉韧带损伤等)膝关节骨关节炎，在病理、病生以及形态学改变等方面极为相似［6，11］，更重要的是大鼠的基因组已明确，可以利用该动物模型从基因水平研究软骨下骨在骨关节炎疾病进程不同时点的分子机制。MMP3属于基质溶解酶，广泛参与包括蛋白聚糖、纤维结合蛋白、层黏连蛋白、凝胶、Ⅳ型胶原和Ⅸ型胶原等各种细胞外基质的降解过程，是破骨细胞骨吸收作用的重要因素之一。Hayami等［6］研究指出本动物模型在术后2周软骨下骨骨量明显减少，本研究中，关节不稳定因素导致膝关节的应力改变是唯一的实验因素，这一因素启动了软骨下骨表达MMP3，MMP3参与骨基质的降解，导致骨量减少并在术后2周引起了形态学改变，这个实验结果与其他学者研究的结果相似［5］。有趣的是，Shibakawa等［4］利用人类晚期膝关节骨关节炎标本，用免疫组化技术在紧靠钙化软骨层的软骨下骨部位也检测到MMP3的高表达，并指出MMP3的表达进一步引起了关节软骨的退变，提示了本实验结果与人类骨关节炎疾病极为相似。但是，本实验只研究了早期骨关节炎软骨下骨MMP3的表达，缺乏在更早期及更晚期的软骨下骨MMP3表达信息;此外，MMP3的基因及蛋白表达是如何调控的，目前尚不清楚，这些都值得进一步深入研究。［参考文献］［1］LohmanderLS．Whatcanwedoaboutosteoarthritis?［J］．·4932·ArthritisRes，2000，2(2):95－100．［2］RadinEL，RoseRM．Roleofsubchondralboneintheini-tiationandprogressionofcartilagedamage［J］．ClinOr-thopRelatRes，1986，(213):34－40．［3］LajeunesseD，ReboulP．Subchondralboneinosteoarthri-tis:abiologiclinkwitharticularcartilageleadingtoabnor-malremodeling［J］．CurrOpinRheumatol，2003，15(5):628－633．［4］ShibakawaA，YudohK，Masuko－HongoK，etal．Theroleofsubchondralboneresorptionpitsinosteoarthritis:MMPproductionbycellsderivedfrombonemarrow［J］．OsteoarthritisCartilage，2005，13(8):679－687．［5］ChangHH，WuCB，ChenYJ，etal．MMP－3responsetocompressiveforcesinvitroandinvivo［J］．JDentRes，2008，87(7):692－696．［6］HayamiT，PickarskiM，ZhuoY，etal．Characterizationofarticularcartilageandsubchondralbonechangesintheratanteriorcruciateligamenttransectionandmeniscectomizedmodelsofosteoarthritis［J］．Bone，2006，38(2):234－243．［7］MuraokaT，HaginoH，OkanoT，etal．Roleofsubchon-dralboneinosteoarthritisdevelopment:acomparativestudyoftwostrainsofguineapigswithandwithoutsponta-neouslyoccurringosteoarthritis［J］．ArthritisRheum，2007，56(10):3366－3374．［8］MadryH，vanDijkCN，Mueller－GerblM，etal．Thebasicscienceofthesubchondralbone［J］．KneeSurgSportsTraumatolArthrosc，2010，18(4):419－433．［9］WestacottCI，WebbGR，WarnockMG，etal．Alterationofcartilagemetabolismbycellsfromosteoarthriticbone［J］．ArthritisRheum，1997，40(7):1282－1291．［10］HayamiT，PickarskiM，WesolowskiGA，etal．Theroleofsubchondralboneremodelinginosteoarthritis:reductionofcartilagedegenerationandpreventionofosteophytefor-mationbyalendronateintheratanteriorcruciateligamenttransectionmodel［J］．ArthritisRheum，2004，50(4):1193－1206．［11］查振刚，姚平，吴昊．维骨力预防骨关节炎软骨退变的实验研究［J］．中国病理生理杂志，2004，20(6):櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆櫆1030－1034．(上接第2390页)综上所述，由LPS诱发的ALI中存在过度放大的炎症反应而导致结构细胞的损伤。TNFR－Fc通过中和过量的TNF－α，下调由TNF－α介导的炎症反应放大过程，重建以IL－6与IL－10为代表的促炎/抑炎平衡，从而减轻LPS引起的全身与肺局部炎症反应，有效地减轻肺泡渗出与肺组织结构破坏，提示对ALI的病理生理过程进行适当的免疫干预有可能成为治疗ALI的新策略。［参考文献］［1］MurphyTJ，PatersonHM，KriynovichS，etal．Linkingthe“two－hit”responsefollowinginjurytoenhancedTLR4reactivity［J］．JLeukocBiol，2005，77(1):16－23．［2］MikawaK，NishinaK，TakaoY，etal．ONO－1714，anitricoxidesynthaseinhibitor，attenuatesendotoxin－in-ducedacutelunginjuryinrabbits［J］．AnesthAnalg，2003，97(6):1751－1755．［3］陈业民，黄文杰，李胜利，等．重症肺炎大鼠干扰素－γ、白细胞介素－6和肿瘤坏死因子－α含量变化［J］．中国病理生理杂志，2007，23(3):492－494．［4］DentenerMA，CreutzbergEC，PenningsHJ，etal．Effectofinfliximabonlocalandsystemicinflammationinchronicobstructivepulmonarydisease:apilotstudy［J］．Respi-ration，2008，76(3):275－282．［5］DeveciF，MuzMH，IlhanN，etal．Evaluationoftheanti－inflammatoryeffectofinfliximabinamousemodelofa-cuteasthma［J］．Respirology，2008，13(4):488－497．［6］GenoveseMC，CohenS，MorelandL，etal．Combinationtherapywithetanerceptandanakinrainthetreatmentofpatientswithrheumatoidarthritiswhohavebeentreatedunsuccessfullywithmethotrexate［J］．ArthritisRheum，2004，50(5):1412－1419．［7］Lyseng－WilliamsonKA，FosterRH．Infliximab:aphar-macoeconomicreviewofitsuseinrheumatoidarthritis［J］．Pharmacoeconomics，2004，22(2):107－132．［8］ImaiY，KubaK，NeelyGG，etal．Identificationofoxida-tivestressandToll－likereceptor4signalingasakeypathwayofacutelunginjury［J］．Cell，2008，133(2):235－249．［9］BarriereSL，LowrySF．Anoverviewofmortalityriskpre-dictioninsepsis［J］．CritCareMed，1995，23(2):376－393．［10］CouperKN，BlountDG，RileyEM．IL－10:themasterregulatorofimmunitytoinfection［J］．JImmunol，2008，180(9):5771－5777．·5932·