薄层色谱法(TLC)

薄层色谱法(TLC)一、薄层色谱法的概述（一）平面色谱法的概念平面色谱法是将固定相涂布于平面载板上，流动相借毛细管作用流经固定相，使被分离后的物质保留在固定相上的一种色谱方法。薄层色谱法是将被分离物质点在将固定相均匀涂布于玻璃板、铝箔或塑料片上形成的薄层上而进行分离的。（二）薄层色谱与高效液相色谱的比较 薄层色谱 高效液相色谱 色谱系统 开放式 闭路 展开方式 展开 洗脱 流速控制 吸附剂的毛细管作用 由泵调节 平衡时间 短 不定 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 样品 可同时分析多个样品 每次一个样品 样品量 高 低 板高（μm） 30 2~5 有效板数 <600 ~5000 检测方式 静态 动态 溶剂用量 少 多 溶剂更换 易 难 固定相 一次弃去 反复使用二、薄层色谱法的技术参数薄层色谱保留值 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示方式有：比移值（Rf)比移值是溶质移动距离与流动相移动距离之比，是薄层色谱的基本定性参数。薄层色谱法的技术参数包括分配系数与容量因子，理论塔板数与塔板高度，分离度，保留值等。当Rf=0时，表示组分留在原点未被展开；当Rf=1时，表示组分随展开剂至前沿，即组分不被固定相吸附，所以Rf值只能在0~1之间。通常Rf值在0.2~0.8之间较适宜。高比移值（hRf=100×Rf）三、薄层色谱法的基本操作薄层板的准备点样展开定位定性与定量样品处理铺制薄层板可用的固定相有：硅胶、氧化铝、纤维素、聚酰胺、葡聚糖凝胶等，其中薄层色谱法用的固定相90%以上的分离工作都可用硅胶。为了使薄层牢固地附着在支持体上便于操作，需要时还要在固定相中加入合适的粘合剂；为了特殊的分离或检出需要，有时也需在固定相中加入某些添加剂。（一）薄层板制备薄层板的载板包括有：玻璃板、塑料片和铝箔。（1）硅胶普通硅胶和改性硅胶两种类型。1、固定相 普通硅胶硅胶为多孔性无定形粉末，表面有硅醇基成弱酸性（pH=4.5)，通过硅原子上的-OH基与极性化合物或不饱和化合物形成氢键而表现其吸附性能。有效的硅醇基数目越多，其吸附能力越强。 改性硅胶改性硅胶是借化学反应的方法，将有机分子以共价键连接在硅胶的硅醇基上，因此称为化学键合固定相。按键合有机硅烷的官能团分为极性键合相及非极性键合相。硅胶的分离效率的高低与其粒度、孔径及表面积等几何结构有关。键合有机分子中含有某种极性基团，和普通硅胶比，吸附活性降低。键合相表面都是极性很小的烃基，最常用的就是十八烷基键合硅胶。（2）氧化铝用氧化铝可分离萜类、生物碱类、脂肪类及芳香族化合物，因制备方法和处理方法的差别，氧化铝有弱碱性（pH=9~10)、酸性(pH=4~5)及中性(pH=7~7.5)之分，因此其使用范围也有所不同。它在薄层色谱法中的应用范围仅次于硅胶。（3）其他固定相 纤维素按其用途不同分为普通纤维素（天然纤维素、高纯度纤维素、微晶纤维素）、乙酰化纤维素和离子交换纤维素。 另外还包括聚酰胺，葡聚糖凝胶（亲水性葡聚糖凝胶、亲脂性葡聚糖凝胶和葡聚糖凝胶离子交换剂）和硅藻土等固定相。2、粘合剂及添加剂（1）粘合剂理想的粘合剂要求亲水性好、粘结力强且具有化学惰性。常用粘合剂有：煅石膏(CaSO4)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na)、淀粉；预制板的粘合剂包括有聚乙烯醇、聚丙烯醇或聚丙烯酰胺等高聚物。（2）添加剂为了特殊需要可在制备薄层时加入某些添加剂制备成具有特殊性能的薄层。包括有荧光指示剂，酸、碱或缓冲液，硝酸银溶液和其他。带有荧光指示剂的薄层在紫外灯下整个薄层呈现荧光，被分离化合物的斑点处的荧光被猝灭而呈暗色。吸附剂及预制板包装上部分符号及含义 符号 含义 G 以石膏作粘合剂 H 无外加粘合剂 R 特别纯化的 P 制备用 W 水可湿性的 Ｆ254,365 荧光指示剂激发波长 F254s 抗酸性荧光指示剂 40,60,…. 平均孔径3、薄层板的制备方法薄层板包括有预制板和手工制板两种。（1）预制板预制板使用方便，涂布均匀，薄层光滑及有很好的牢度，预制板有用玻璃板，塑料片或铝箔作为载板，使薄层附着在上面，塑料片或铝箔的预制板还有裁剪方便的优点。常用于薄层定量。（2）手工制板手工制板一般分为不含粘合剂的软板及含粘合剂的硬板两种。手工制板所用的玻璃板一般为5cm×20cm，10cm×20cm或20cm×20cm的2mm厚的玻璃板，要求板面平整，洗净后排列在薄层板放置架上备用。软板是将吸附剂直接于玻璃板上用干法涂成均匀的薄层即可使用，但软板疏松，操作不方便，因此目前很少使用，主要用硬板。洗净的玻璃板用乙醇擦拭干净，挥干乙醇后，用手动或自动涂布器（最好用自动涂布器）将已调制好的固定相均匀地涂铺在玻璃板上，涂布后的薄层板应水平放置，室温阴干备用。制备薄层板时的注意事项（1）必须先要制备固定相匀浆，由于固定相及粘合剂类型不同，性能也不同，匀浆时加水量也不同。匀浆搅拌时应朝同一个方向进行，以减少气泡的产生。（2）涂布时速度要快，避免固定相过度凝固给涂布带来困难，涂布速度要求均匀，涂布后的薄层晾干时应在阴凉的地方，避免因通风而导致层面产生裂纹；应保持水平放置。（3）定性定量时用的薄层固定相厚度为0.2~0.3mm，制备薄层的厚度要求约0.5~2mm。4、薄层板的活化手工制的硅胶或氧化铝薄层板，涂布晾干后有时必须经过活化才能使用。薄层分离物质与吸附剂表面及其孔隙表面的活性点的强度和数目有关。活性点的强度及数目较大时，吸附剂的活度就高，吸附剂的保留能力也较高，不同物质在吸附剂上被吸附的能力不同，则可以彼此分离。薄层板活化的原因薄层活度大小受大气相对湿度的影响，吸附剂表面能可逆地吸收水分。如果大气湿度过大，薄层活度过低，对分离效果会产生影响。为了提高薄层活度则必须将室温晾干的薄层板在点样前根据活度要求在一定温度下活化。一般晾干后的薄层板在105~120℃条件下干燥0.5~1h。（二）点样在点样前，应将薄层板在日光或紫外光下检查板面有无损坏或污染。点样时通常使用点样针和毛细管进行点样。毛细管规格(mm)：内径Φ0.1、0.2、0.3、0.4、0.5×长度100。注意：点样时点样针或毛细管不能划破载板上的固定相。点状点样：原点直径<5mm，一般为3mm（经典薄层）和1~2mm（高效薄层）。带状点样：展开后的斑点不仅分辨率明显高于点状点样，而且精密准确，为定量分析提供最佳条件。常用的点样方式：点状点样和带状点样。1.原点直径过大会降低分辨率及分离度；尽可能避免多次点样。2.点样量：经典薄层一般为1~5ul，高效薄层为100~500nl，总量不要超载。3.点样速度尽可能快，耗时尽可能短。注意：硅胶的硅醇基以氢键的形式优先吸附水，吸水速度很快，因此应用预先经过活化的薄层板。在点样时也会立即吸附空气中的水蒸气，因此在点样时可用干净的玻璃板盖住活化的薄层板，只留出原点区域以便点样。几种不同点样方式的比较 方式 优点 缺点 A 价廉 精密度差 B 很精密 需要仪器 C 很精密 仪器复杂 D 很精密 仪器很复杂（三）展开点样后的薄层需置密闭并加有展开剂的展开室中进行展开，样品与展开剂及固定相之间相互作用的结果使样品中各成分沿展开剂流动的方向被分开。1、展开室平面色谱的展开有三种几何形式即线性、环形及向心。其中最常用的有线性展开和多次展开。2、展开方式线性展开：上行展开、下行展开、双向展开、近水平展开、水平展开。 溶剂蒸发面积大，展开时易饱和 展开速度快 展开溶剂用量大 溶剂易浸没点样点3、展开剂展开剂又可称为溶剂系统、流动相或洗脱剂，是在平面色谱法中用作流动相的液体。理想的展开剂分离样品得到的Rf值应在0.2~0.8之间。（1）溶剂的分类展开剂是由单一或混合溶剂组成的，因此溶剂的性质是溶剂分类的基础，溶剂分类是确定展开剂组成的基础。溶剂分成6类：第Ⅰ类为电子授受体溶剂；第Ⅱ类为质子给予体溶剂；第Ⅲ类为强质子给予体溶剂；第Ⅳ类为质子受体溶剂；第Ⅴ类为偶极作用力溶剂；第Ⅵ类为惰性溶剂（即非极性溶剂）。（2）溶剂强度溶剂强度是指单一溶剂或混合溶剂洗脱某种溶质的能力。在正相色谱中，它随溶剂极性的增加而增大；在反相色谱中则相反。溶剂强度大的溶剂洗脱能力强。常用溶剂洗脱顺序（由弱到强）：四氯化碳（1.7），甲苯（2.3），氯仿（4.4），乙腈（6.2），乙酸乙酯（4.3），丙酮（5.4），乙醇（5.2），甲醇（6.6），水（9.0）。展开剂的选择方法：三角形法。根据展开剂、固定相及被分离物质三者间的相互影响，三者的关系如下：展开剂选择的步骤：薄层展开时展开剂的量不能太少也不能太多，太少被分离物质不能分离，太多则会淹没点样点，使被分离物从薄层板上脱离而溶于展开剂中。 第二：进一步提高展开剂的选择性，即使样品中各组分有合适的分离度。对于未知混合物，则要求分离斑点数越多越好。 第一：选择一种合适的溶剂强度的展开剂，使样品中各组分多落在最佳或至少是可用Rf范围内。4、影响薄层展开的因素（1）相对湿度的影响水蒸气与吸附剂之间有很大的亲和力，即使是微量的水蒸气对色谱分离结果也会产生较大的影响。（2）溶剂蒸气的影响平面色谱分离过程是固定相、流动相和气相共同作用的结果。在展开时展开室的饱和对分离有明显的影响。溶剂蒸气得不到饱和易引起“边缘效应”。产生边缘效应时，只需用展开剂将展开室及薄层板饱和后再展开就可以消除。饱和对展开影响很大，因此对展开室的饱和及对薄层的预平衡非常重要。此外，展开时展开室的密闭也很重要。（3）温度的影响展开时环境的温度对薄层色谱的展开影响很小。通常在室温下进行展开。（4）展开方式的影响不同的展开方式，不同的展开条件对平面色谱的分离效果有明显的影响。（5）展距的影响常规薄层展距为10~20cm，高效薄层为5~10cm。（6）展开室的放置不能放在空气对流强的地方，并且注意避光。（四）定位展开后的薄层板需挥干表面多余的展开剂，然后采用适当的方法对被分离物质进行定位。1、光学检出法化合物对可见光和紫外光有吸收，在色谱上可观察到不同颜色的斑点；对可见光和紫外光都不吸收，也没有合适的显色方法的化合物可以用荧光猝灭技术进行检测。定位方法光学检出法的使用范围：光学检出法使用方便，被检出物质不被破坏，适用于双向展开，多次展开等的定位，也宜应用于洗脱定量时定位，是平面色谱定位的首选方法。2、蒸气检出法（1）利用一些物质的蒸气与样品作用生产不同颜色或产生荧光。此法不会改变化合物性质，灵敏度高，是薄层定位常用的简便方法。（2）另一些化合物，当薄层放置在碘蒸气中几秒钟后，就立即产生不可逆的化学反应。此法常用于薄层的定位与定性。但要注意有些化合物与碘蒸气发生不可逆反应而改变原来化合物的性质。3、试剂显色法分离后的化合物在紫外光或可见光下不能显示斑点，可根据被检出化合物的理化性质选择适当的显色剂使之生成颜色或荧光稳定、轮廓清楚、灵敏度高、专属性强的斑点。这种方法是通过一种或几种试剂与被检物质产生化学反应，生成有色物质，是平面色谱广泛应用的定位方法。喷雾显色的显色剂溶液以气溶胶的形式均匀的喷洒在薄层上。（1）显色方法：喷雾显色、浸渍显色、超压衍生化等。喷雾显色法务必在通风柜中进行。自动喷雾器适用于定量。手动喷雾器用于定量分析时可能因喷雾不均匀而产生较大误差。（2）显色试剂显色试剂有通用显色剂和专属性显色剂。①通用显色剂a.硫酸喷后110℃烤15min，不同有机化合物显不同颜色。b.0.5%碘的氯仿溶液对很多化合物显黄棕色。c.中性0.05%高锰酸钾溶液易还原性化合物在淡红背景上显黄色。d.碱性高锰酸钾试剂还原性化合物在淡红色背景上显黄色。e.酸性高锰酸钾试剂喷1.6%高锰酸钾浓硫酸溶液（溶解时注意防止爆炸），喷后薄层于180℃加热15~20min。f.酸性重铬酸钾试剂喷5%重铬酸钾浓硫酸溶液，必要时150℃烤薄层。g.5%磷钼酸乙醇溶液喷后120℃烘烤，还原性化合物显蓝色，再用氨气薰，则背景变为无色。h.铁氰化钾-三氯化铁试剂还原性物质显蓝色，再喷2mol/L盐酸溶液，蓝色加深。a.甲醛/硫酸检出物：多环芳烃b.茚三酮检出物：氨基酸、胺与氨基糖类。方法：喷后于110℃加热。结果：呈红紫色斑点。c.邻氨基联苯/磷酸检出物：糖类方法：喷板后110℃加热15~20min.结果：斑点呈褐色。②专属性显色剂d.甲基黄检出物：氯化杀虫剂及抗菌化合物。方法：喷板后于室温干燥，并在无滤光片紫外光下照射5min。结果：黄色背景上呈红色斑点。e.溴/四氯化碳检出物：有机磷杀虫剂。方法：薰溴蒸气。f.三氯化铝检出物：黄酮类。方法：喷板。结果：紫外光长波下显黄色荧光。（五）定性与定量（1）斑点的Rf值经过两种以上不同组成的展开剂展开后得到的Rf值均与随行对照品一致时，才可确定该斑点与随行对照品是同一化合物。1、定性（2）斑点的显色特性在自然光或紫外光或荧光或用显色剂后观察斑点颜色与随行对照品比较可以定性。样品通过薄层分离，并用适当方法定位后，常用以下方法进行定性。待测物的含量测定方法包括半定量和定量两种。 可以从斑点的大小和颜色的深浅与随行对照品斑点比较，从而近似的估计样品中待测成分的含量。 也可在测出待测物质对照品在薄层上的检出灵敏度后，对样品中的该成分进行限量检查。（1）半定量2、定量定量方法分为间接定量（洗脱测定法）和直接定量（原位薄层扫描法）两种。（2）定量①洗脱测定此方法是取下色谱上分离的斑点，用溶剂将化合物的斑点从吸附剂上定量的洗脱下来，收集洗脱液，并用适当的方法进行测定。洗脱测定的步骤：a.斑点的定位b.斑点的洗脱c.测定方法：紫外分光光度法，比色法等。②原位薄层扫描法用一束长宽可以调节的一定波长、一定强度的光照射到薄层斑点上进行整个斑点的扫描，用仪器测量通过斑点或被斑点反射的光束强度的变化达到定量的目的。薄层扫描的基本原理薄层扫描的基本用途a.定性—光谱测定b.定量—色谱测定四、薄层色谱法的应用薄层色谱主要应用于医药方面，但在其他方面也有重要的应用。在其他方面主要又应用于环境有害物质的分析和食品分析。在环境方面应用于农药及农药残留分析、有毒金属测定和多环芳烃测定等方面，对环境保护发挥一定的作用。在食品分析方面薄层色谱法可应用于分离测定食品中所含有的碳水化合物、维生素、有机酸、氨基酸等天然营养成分，也可用于食品添加剂如色素等的分析以及对某些有毒成分的控制。