双分子荧光互补

双分子荧光互补开放分类：生物技术科学编辑词条分享新知社新浪微博人人网腾讯微博移动说客网易微博开心001天涯MSN*词条由小破孩有些创建,共有2位协作者编辑了4次。最新协作者：51541489,小破孩有些。请用一段简单的话描述该词条，马上添加摘要。目录1BiFC技术原理2BiFC技术缘起3BiFC技术研究进展4BiFC技术的优缺点5BiFC技术的应用双分子荧光互补-BiFC技术原理将荧光蛋白在某些特定的位点切开，形成不发荧光的N和C端2个多肽，称为N片段(N-fragment)和C片段(C-fragment)。这2个片段在细胞内共 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 达或体外混合时，不能自发地组装成完整的荧光蛋白，在该荧光蛋白的激发光激发时不能产生荧光。但是，当这2个荧光蛋白的片段分别连接到1组有相互作用的目标蛋白上，在细胞内共表达或体外混合这2个融合蛋白时，由于目标蛋白质的相互作用，荧光蛋白的2个片段在空间上互相靠近互补，重新构建成完整的具有活性的荧光蛋白分子，并在该荧光蛋白的激发光激发下，发射荧光。简言之，如果目标蛋白质之间有相互作用，则在激发光的激发下，产生该荧光蛋白的荧光。反之，若蛋白质之间没有相互作用，则不能被激发产生荧光。双分子荧光互补-BiFC技术缘起蛋白质片段互补技术蛋白质片段互补BiFC起源于蛋白质片段互补技术。所谓蛋白质片段互补技术(proteinfragmentcomplementation)是将某个功能蛋白切成2段，分别与另外2种目标蛋白相连，形成2个融合蛋白。在1个反应体系中，2个目标蛋白的相互作用使得2个功能蛋白质片段靠近、互补，并重建功能蛋白质的活性，通过检测功能蛋白质的活性来判断目标蛋白质的相互作用。已经尝试用于该目的的功能蛋白包括泛素蛋白(ubiquitin),3-半乳糖甘酶(3-galactosidase),二氢叶酸还原酶(dihydrofolatereductase),3-内酰胺酶(3-lactamase),以及几种荧光素酶，如萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase),海肾萤光素酶(renillaluciferase),甲虫荧光素酶(beetleluciferase)和长腹水蚤荧光素酶(gaussialuciferase)。BiFC沿袭了蛋白质片段互补的技术原理。所不同的是蛋白质片段互补技术需要重建断裂蛋白的活性，蛋白活性由底物反应所体现，通过检测底物变化，来判断蛋白质的相互作用。而基于断裂荧光蛋白的BiFC技术则是利用荧光蛋白本身的一个特点，即荧光蛋白活性被重建后，能自我催化形成荧光活性中心，重新恢复荧光蛋白的特征光谱，自身作为报告蛋白，直接反映蛋白质之间的相互作用。因此技术过程更加简单，结果更加直观。绿色荧光蛋白(GFP)及外源片段插入和循环排列实验GFP是由238个氨基酸残基组成的1个单体蛋白，其三维结构是由11个反向平行的3折叠环绕成1个桶状结构，1个较长的a2螺旋从桶的中心穿过，这些3折叠和a螺旋之间通过Loop环链接起来。荧光蛋白的发色团位于桶中心的a螺旋上，由荧光蛋白通过自体催化，将3个氨基酸残基Ser652Tyr662Gly67进行环化，氧化后形成。由于GFP结构致密，不易被蛋白酶水解，且在厌氧细胞以外的任何细胞中都能自我催化发射荧光，所以很快被应用于生命科学研究，将其融合于形形色色的蛋白上，用来研究蛋白质的功能。最初将GFP融合到目标蛋白的方式主要有3种，即N端融合、C端融合、或将整个荧光蛋白插入到目标蛋白中，这3种方式中，GFP蛋白都是完整的。1998年，Abedi等首次尝试了GFP的另类使用方式，即将目标短肽插入到GFP中。他们从GFP的Loop区域选择了10个位点，将20个左右氨基酸组成的短肽分别插入，通过能否重新发射GFP的特征光谱，来筛选合适的插入位点(Fig12A)。结果发现，在氨基酸Gln1572Lys158以及Glu1722Asp173之间插入短肽时，GFP仍然能发射荧光。于是，他们以GFP作为支架蛋白(scaffoldprotein),用其Gln1572Lys158(此位点较Glu1722Asp173位点更能适应外源短肽)位点来筛选短肽库。1999年，Baird等在对GFP的突变体增强型青色荧光蛋白(ECFP)进行半随机突变时，偶尔发现在一个突变体的Y145位插入了6个新的氨基酸残基FKTRHN但是该突变体仍然发射荧光。这个偶然的发现表明，GFP在某些位点插入外源片段时，仍能自发组装形成GFP的完整的三维结构。于是他们设计了1个循环排列（circularpermutation）实验，来验证GFP上还有哪些位点适合插入外源片段。循环排列方法通常被用来评估1个蛋白质的结构元件的功能，比如钱链区（hingeregions）,松散的环（Loops）以及结构域间或亚基间的界面对于蛋白质的折叠和稳定性的作用。循环排列是将蛋白质的N端和C端通过1个短肽（linker）连接起来，形成1个环状的中间态，然后在另外的位置将蛋白质切开，形成新的N端和C端。重新排列后的某些突变体蛋白质在体内或体外仍能形成类似该蛋白质的天然结构，并具有野生型蛋白质的活性。在对GFP及其突变体的循环排列研究中，将GFP的cDNA通过1个编码6个氨基酸短肽（GGTGGS）核甘酸序列连成一个环状的cDNA然后从环状cDNA的任何地方切开，形成1个编码新N端和C端的蛋白质阅读框，插入到质粒中。在大肠杆菌中筛选能发射GFP荧光的单菌落。通过这种循环排列，他们发现有10个位点重排的GFP突变体仍能正确折叠并发射荧光。这10个位点既有存在于Loop区域的，也有处于3折叠片上的（Fig12B）。这些位点被认为是可以插入外源片段的，并在部分位点得到验证。比较上述实验可以看出，2个实验室所得出的可插入位点大致相符，但后者（Baird等）的实验更加精细，他们将GFP的任何1个位点都进行了筛选。从上述实验可以看出，插入外源片段的位点都位于氨基酸142位点以后，即发色团所在的“螺旋之后的第3个3折叠片之后。由此可见，发色团所在的N端的大部分区域对于荧光蛋白的正确折叠及保护活性中心很重要。从序列重排实验的结果还得到一个启示：既然重排后的突变体荧光蛋白仍然具有荧光活性，那么新形成的N端和C端也是可以融合外源蛋白质的。荧光蛋白质的外源片段插入及循环排列实验为BiFC奠定了基础，BiFC在拆分GFP蛋白时所选用的位点也都在GFP循环排列所鉴定的位点附近或其上。BiFC的提出2000年，Ghosh等首次报道了1个借助反向平行的亮氨酸拉链介导的GFPM组实验。该实验选用了易被检测的GFP蛋白，将其从氨基酸Gln1572Lys158位切开，把1组反向平行的亮氨酸拉链分别连接到GFP的N端和C端。如Fig13所示，将1个亮氨酸拉链（NZ）通过1个连接肽连接到GFP的N片段的第157个氨基酸上，另1个亮氨酸拉链（CZ）连接到C端片段的第158位氨基酸。在体外和体内（大肠杆菌BL21中）分别 证明 住所证明下载场所使用证明下载诊断证明下载住所证明下载爱问住所证明下载爱问 了，只有借助亮氨酸拉链的相互作用，GFP的2个多肽片段才能够靠近，重新形成完整的GFP^白，并发射荧光。任何1个单独的融合多肽或任何1组只包含1个或零个融合多肽的组合均不能将绿色荧光蛋白的N端和C端片段重组成完整的GF琳白结构，亦不能发射荧光。2年之后，Hu等首次提出BiFC概念。他们将1个GFP的突变子增强型黄色荧光蛋白（EYFP）从不同位点切开，用1组相互作用的同向平行的亮氨酸拉链（多肽bFos和bJun）融合到切开的GFP蛋白的N片段和C片段，分别在大肠杆菌中共表达不同组合的融合多肽。他们发现，当EFYP从氨基酸Ala1542Asp155间切时开时所构建的1组融合多肽，能够在细菌或细胞中产生GFP的荧光。于是，BiFC技术建立起来。双分子荧光互补-BiFC技术研究进展各类BiFC系统近几年，BiFC技术迅速发展。2003年，Hu和Kerppola系统地研究了GFP及其3个不同颜色的突变体蓝色荧光蛋白（BFP）,青色荧光蛋白（CFP）以及黄色荧光蛋白（YFP）的BiFC现象。他们把GFPBFP,CFPYFP从氨基酸155位和173位分别切开，把切开的N端片段用其颜色和位点命名，如NY155,NG173等。同样命名原则用于C端片段，如CY155,CG155等。用2条碱性的亮氨酸拉链短肽bJun和bFos筛选出不同片段组合的BiFC系统，这些双分子荧光互补系统的特征波长有7种，即组合YN155PYC15则YN173PYC173勺特征波长为515P527nm;YN155PCC15手口YN173PCC155勺特征波长为503P515nm;CN155PCC15于口CN173PCC155452P478nm;组合GN173PYC173513P521nm;GN173PCC155488P512nm;CN173PYC173466P497nm;BN172PCC155这一组未给出特征光谱，但是从文章中可以看出，这一组和上述组合的激发及发射光谱不同。从C端的173位切开上述4中荧光蛋白所产生的氨基酸序列完全相同，因此YC173也可以是（G,B,C）C173o2006年，Shyu等将GFP的另外3个突变体，黄色的venus和citrine,青色的cerulean发展成可以用于生理条件下的BiFC系统。这3个蛋白也是从155或173位氨基酸切开，用bJun和bFos筛选出下列组合可以形成BiFC系统，即citrineN155PcitrineC155,citrineN173PcitrineC173,venusN155PvenusC155,venusN173PvenusC173,venusN173PYC155,citrineN173PvenusC155,citrineN173PYC155,venusN173PCC155,ceruleanN173PvenusC155,ceruleanN173PCC155,这些组合的特征波长见Table1。为了更好地实现多组蛋白质相互作用的同时检测，2006年Jach等将他们自己突变的1个红色单体荧光蛋白mRFP2Q66或展成1个红色的双分子荧光互补系统。他们把mRFP2Q661^氨基酸序列的154和168位点切开，筛选了2个片段组合，即mRFP2Q66TN168PmRFP2Q66TC169mRFP2Q66TN168PmRFP2Q66TQ1弱可形成BiFC系统。最近，Fan等将1个特征波长更长的第二代单体荧光蛋白mCherry从159位切开，形成片段组合mCherryN159PmCherryC160,构建了1个长波长的红色BiFC系统。BiFC系统的扩展目前，BiFC系统不仅可以直观地检测到1对蛋白质在体内或体外的相互作用，也可以由不同颜色的BiFC系统在同1个细胞中共用实现多组蛋白质相互作用的同时检测。2008年，Shyu等又将BiFC技术和FRET技术结合起来，建立了基于双分子荧光互补的荧光共振能量转移技术(BiFC-FRET),BiFC2FRET采用了青色的荧光蛋白cerulean和1个黄色的基于venus的BiFC系统联用，能同时检测3个蛋白之间的相互作用。其做法是，将bJun和bFos分别和venus荧光蛋白的N,C端片段相连，bJun和bFos的相互作用使得venus蛋白重建；当和cerulean融合的蛋白NFAT1和bJun和bFos异源二聚体相互作用时，cerulean可以作为供体将能量共振转移至重建后的venus荧光蛋白，实现3个蛋白质相互作用的共检测。双分子荧光互补-BiFC技术的优缺点一项技术的优缺点体现在和其他不同技术的比较中。和其它多数技术相比，双分子荧光互补技术适用范围广，既可以用于体内也可以用于体外的蛋白质相互作用研究，是其优点之一。本文仅基于体内蛋白质相互作用来进行比较。用于体内蛋白质相互作用研究的技术有多种，其中酵母双杂交技术应用最为广泛。酵母双杂交技术不仅可以用于已知蛋白之间的相互作用，还能用其中1种蛋白去筛选与之相互作用的蛋白，但是这项技术仍然存在几个固有的不足:1)相互作用必须在酵母中进行，许多外源目标蛋白在酵母中表达天然活性已经发生变化;2)各种原因造成的假阳性，例如一些受试蛋白本身可能激活了报告基因的转录或在酵母双杂交系统中相互作用的蛋白在其天然环境中处于不同的细胞器，并不发生相互作用;3)必须通过酵母细胞培养才能观察到结果，耗时较长。与之相比，BiFC系统可以在细菌，真菌，以及真核细胞中实施，所研究的蛋白处于其天然的环境中，并且能够直观地报道蛋白质相互作用在细胞中的位置，即定位(localization研究，此外，BiFC技术耗时比较短。目前，研究体内蛋白质相互作用的主流方法是荧光能量共振转移技术(FRET)或生物发光能量共振转移(bioluminescenceresonanceenergytransfer,BRET)。2种方法都要求供体荧光团的发射波谱和受体荧光团的激发波谱有一定程度的重叠，并且距离在10纳米以内，以及受体发射的荧光强度是在假定受体没有吸收其它的光能量而只吸收了供体处于激发态时转移的能量，而供体需获取有或无受体时发射的荧光强度，因此，FRET和BRET技术对仪器的要求高，需要复杂的数据分析。同时，这类方法检测的是供体和受体的荧光强度的变化。相比之下，BiFC系统对仪器要求低、数据处理相对简单，由于只是检测荧光的有无，因而背景干净，检测更加灵敏。其他蛋白质片段互补技术主要通过检测底物的变化来间接的反映蛋白质间的相互作用，不能确定蛋白质相互作用的位置。由于重建后的荧光蛋白结构较稳定，双分子荧光互补技术还可以用于研究蛋白质之间的弱相互作用或瞬间相互作用。BiFC技术的最大缺陷是多个BiFC系统对温度敏感。温度高时，片段间不易互补形成完整的荧光蛋白。一般在30c以下形成互补效应好，温度越低，越有利于片段之间的互补，这就对研究细胞在生理条件下的蛋白质相互作用带来不利因素。目前，只有基于venus、citrine和cerulean的3个双分子荧光互补系统可以在生理温度条件下实现片段互补。此外，BiFC系统需要2个荧光蛋白片段互补，重新形成完整的活性蛋白以及发生荧光蛋白自体催化过程，不同的BiFC系统往往需要几分钟到几小时完成该过程，因此观察到的双分子荧光信号滞后于蛋白质的相互作用过程，不能实时地观察蛋白的相互作用或蛋白复合物的形成过程。双分子荧光互补-BiFC技术的应用BiFC系统虽然出现较晚，但迅速获得应用。迄今，各种BiFC系统已经被成功用于多种蛋白质的相互作用，例如体外、病毒、大肠杆菌、酵母细胞、丝状真菌、哺乳动物细胞、植物细胞、甚至个体水平的蛋白质之间相互作用研究。BiFC也用于细胞内多个蛋白质之间的相互作用。不同颜色的双分子互补系统共用可以检测体内2组或多组的蛋白质相互作用[10,29],而BiFC2FRET联用可以实现3个蛋白之间的相互作用。BiFC也被用于筛选相互作用的目标蛋白以及研究蛋白质构象的变化。Magliery等将基于GFP的BiFC系统发展成为可以在大肠杆菌中筛选蛋白相互作用的系统。将GFP的2个片段分别构建到2个可以在大肠杆菌中相容复制的质粒pET11a和pMRBADt,彳#到2个质粒pET11a2link2NGFP和pMRBAD2link2CGFP并用这个系统从1个反向平行的亮氨酸拉链肽库中筛选出可以相互作用的多肽。Park等将基于GFP的BiFC系统发展成可以在酵母中筛选相互作用蛋白的类似于酵母双杂交的系统。此外，BiFC系统还被用于蛋白质构象研究。Jeong等将GFP的2个片段连接到麦芽糖结合蛋白(maltosebindingprotein,MBP)的N端和C端。当没有麦芽糖存在时，2个荧光片段相距较远，不能形成片段互补，而当加入麦芽糖时，MBP勾象发生改变，钱链区域彼此缠绕，将MB昧端的2个GFP片段拉近，重新形成具活性的GFP^白，通过检测GFP荧光的变化，考察MBP的构象变化。BiFC用于特异性标记细胞内RNA研究RNA在细胞内的定位及动态行为。Valencia2Burton等用基于GFP的BiFC系统成功的标记了大肠杆菌内mRN保口5s核糖体RNA他们将真核生物白翻译起始因子eIF4A切成2部分(这2部分分别是eIF4A的2个结构域)，分别融合到GFP的N片段和C片段，形成2个融合蛋白。将eIF4A蛋白的RNA适配子(aptamer)连接到RNA的末端。当2个融合蛋白在细菌内表达时能够特异的定位到eIF4A的适配子上，2个荧光片段彼此靠近互补，可以被激发产生荧光，从而照亮连接有eIF4A适配子的RNAOzawa等用基于GFP的BiFC系统标记并研究了真核细胞线粒体RNA将GFP的2个片段分别连接到2个特异性结合RNA^歹U的2个蛋白结构域(pumiliohomologydomain,PUM2HD)即mPUM并口mPUM2t。将编码NADH兑氢酶的亚基6的线粒体RNA(ND6mtRNA)上2个串联的RN附列单元(8个核甘酸)进行一些点突变，使mPUM和mPUMST以特异性的结合这2个序列单元。当在细胞内表达BiFC的2个融合蛋白，mPUM和mPUM分别特异性结合到2个RNA^列单元上，融合于其上的GFP片段靠近互补，产生绿色荧光，从而标记ND6的线粒体RNA借助双分子荧光互补技术来标记RNA寸，由于没有背景荧光的干扰，为研究RNA提供了新的工具，也拓宽了BiFC技术的使用范围，从研究蛋白质到研究RNA根据文献报道和作者的经验，使用BiFC技术时需要注意一些事项:1）荧光片段和目标蛋白质之间最好加1个连接肽，以避免蛋白质空间位阻所导致的片段间不能相互靠近。常用的连接肽氨基酸序列有RSIAT,RPACKIPNDLKQKVMNHGGGG等;2）温度对片段间互补影响很大，可以有两种解决 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