Tn 转座酶建库原理

Tn5引爆极速建库和长片段之战近10年间，NGS（NextGenerationSequencing）技术高速发展，测序仪器不断更新迭代，形成规模化。在测序模式产业化的大环境下，测序样本制备成为其中很重要的一环。样本起始量要求过高、建库 流程 快递问题件怎么处理流程河南自建厂房流程下载关于规范招聘需求审批流程制作流程表下载邮件下载流程设计 繁琐等都会限制NGS技术的应用。科学家们一直在不断探索，试图突破此类限制，其中转座酶（Transposase）技术引入建库中就是很大的进步，不仅解决了上述问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 ，转座酶也在NGS上开发了多个技术应用，拓展了NGS的适用范围。20世纪40年代，美国遗传学家芭芭拉.麦克林托克在玉米的研究中发现了转座子（Transposon），随后，她花了整整6年的时间来研究转座子的奥秘。在50年代，当麦克林托克向世人公布她的发现时，学术界并没有多少人认可，但是真理是经得起时间检验的，随后的几十年间科学家们在生物界各个领域证实了转座子系统的广泛存在。1983年，瑞典皇家科学院诺贝尔奖金评定委员会终于把该年度的生理学和医学奖授予这位81岁高龄的、不屈不挠的女科学家。麦克林托克是在遗传学研究领域第一位独立获得诺贝尔奖的女科学家，她的名字将和转座基因一起被载入科学史册。转座基因俗称跳跃基因，它的发现改变了人们对基因组序列稳定性的认识。理论上的突破也带来了应用上的拓展，科学家们群策群力，将转座子系统开发成基因研究的各种工具，这又反过来促进了遗传学理论的研究。转座子标签(transposontagging)技术是研究功能基因的有效工具之一。比如模式植物大多都有很好的突变体库，其中玉米的两个应用最为广泛的突变体库（uniformMu和Ac/Ds突变体库）就是利用转座子创建的。转座子标签技术克隆基因的基本原理：转座子是染色体上一段可移动的DNA片段，它可从染色体的一个位置跳到另一个位置。当转座子跳跃而插入到某个功能基因时，就会引起该基因的失活，并诱导产生突变型。通过遗传分析可确定某基因的突变是否由转座子引起，由转座子引起的突变便可以转座子DNA为探针，从突变株的基因组文库中钓出含该转座子的DNA片段，并获得含有部分突变株DNA序列的克隆，进而以该DNA为探针，筛选野生型的基因组文库，最终得到完整的基因。在基因工程中，来源于微生物的转座子运用的更为广泛，Tn5就是一个很好例子。Tn5因其转座的随机性好、稳定性高、插入位点容易测序等特点，已经成为分子遗传学及基因诊断学研究的热门工具。Tn5asaMolecularGeneticsTool作为经典的方法，被收录进了Springer大名鼎鼎的《MethodsinMolecularBiology》。Epicentre的专利产品EZ-Tn5转座子突变系统无疑是其中的佼佼者，是公认的易操作系统。该系统经过工程改造，使得Tn5转座酶比天然转座酶的活性强100倍。EZ-Tn5转座子可在体外插入到含有靶DNA的载体上，在没有镁离子孵育时，EZ-Tn5转座子能够形成稳定的EZ-Tn5转座体复合体，可以通过电击进入活细胞，转座体经细胞内镁离子活化后，就能随机插入到宿主的基因组DNA中。图1A.Tn5的结构图1B.Tn5插入基因组示意图2000年，science上发表的Three-DimensionalStructureoftheTn5SynapticComplexTranspositionIntermediate解析了Tn5插入基因组的机理。Tn5全长约5.8kb，由编码三个抗生素（新霉素、博莱霉素、链霉素）的核心序列和两条倒置的IS50序列组成（如图1A），其中IS50R和IS50L的序列高度同源，只有IS50L的一个碱基存在突变。IS50具有19bp的倒置末端（外末端outsideend，OE和内末端insideend，IE），两倒置末端有7个bp不同，此倒置末端是转座酶（Tnp）的作用位点。转座发生时，两个转座酶分子结合到Tn5转座子的OE末端，形成两个Tnp-OE复合体，随后两个复合体联会，Tnp的C末端相互作用而二聚体化，形成由一个二聚体蛋白质和两分子DNA组成的联会复合体（如图1B）。形成该联会复合体后，Tnp才具有切割DNA的活性。形成这种结构有利于协同Tn5DNA链的切割和转移，有利于防止Tnp只对转座子DNA链的一端进行切割。结合在左末端的Tnp负责催化右末端的磷酸二酯键水解，而结合在右末端的Tnp负责催化左末端的磷酸二酯键水解。Tnp活化水分子，此活化的水分子水解DNA链，在Tn5的两末端分别形成两个3`-OH亲核基团，该亲核基团进而攻击互补链形成发夹结构。随后另一活化的水分子水解该发夹结构,形成平末端的Tn5，整个联会复合体离开供体链，并结合到靶DNA上。Tn5的3`-OH亲核攻击靶序列，在转座子插入位点之间形成9bp的粘性末端，转座子的3`-OH同靶DNA的5`-P之间形成共价键，转座子就插入到靶序列之中。在DNA聚合酶的作用下补平缺口，转座子的两端形成9bp的正向重复序列。整个转座过程完成了基因从原始DNA被剪切之后粘贴在另一受体DNA的过程，实现了基因的“跳跃”（如图2）。图2Tn5插入基因组的机理后来研究人员发现，整个转座子序列并不是转座必须的，只需转座子的末端核心序列，转座酶便能将该部分序列插入并连接至基因组内。根据这个原理，将测序接头序列加入末端核心序列中，可简捷地引入测序接头，完成文库构建。Epicentre这次又走到了前面，它的核心专利Nextera™技术，相信大家都很清楚。图3Tn5进行DNA打断这一次，最大的赢家是Illumina。2011年1月，Illumina宣布收购了Epicentre生物技术公司。尽管Illumina公司已经有常规的物理打断试剂盒（Truseq系列），但是Nextera系列中，Tn5打断技术的革新极大地减少了操作时间和操作步骤，在简便程度上有非常大的竞争力。比如WES（全外显子测序），Tn5建库加上快速杂交，理论上一天即可完成文库构建，速度不可谓不快。将P5、P7端部分接头序列（Adapter1/2）和转座子末端序列形成包被接头，与Tnp形成Tn5转座复合体。该复合体打断受体DNA，会形成一端带有P5部分接头Adapter1，一端带有P7部分接头Adapter2的DNA，之后通过PCR加上Barcode以及接头其余部分，形成含P5端与P7端完整接头的DNA文库（如图4）。图4Nextera系列建库示意图顺便提一下，收购了Epicentre后，Illumina拥有了其公司的Ribo-zerorRNA去除试剂盒系列，基于该系列产品开发的TruSeqRibo-Zero系列LncRNA建库试剂盒，大大提升了Illumina在RNA方向建库试剂盒的竞争力。Tn5用于测序文库构建时，将DNA片段化、末修加Ａ、接头连接等多步反应转变为1步反应，极大缩短建库时间，提高工作效率。但是这一步之后，接头与插入片段之间有9bp的gab需要补平（如图5），这就是为什么Tn5建库在PCR之前必须72℃反应5min，而且所用的PCR酶需要是具有链置换功能的非热启动酶。图5Tn5文库缺口补平从图5也可以看出插入片段两端序列是19bp的固定序列，与常规物理打断法所构建的文库结构是不同的，所以测序引物不同。图6诺唯赞的Tn5测序文库结构在磁珠起源一文中提到的Nextera™DNAFlexLibraryPreparationKit，从这项技术可以看出Illumina公司把文库制备的简便性做到了极致。Tn5引爆了极速建库的战争，而竞争对手也没有坐以待毙，Mu转座子、Mos1转座子、哈氏弧菌(Vibrioharvey)转座子纷纷被用于文库构建。赛默飞用Mu转座酶推出了MuSeekLibraryPreparationKitforIonTorrent，安捷伦推出了Vibrio，哈氏弧菌转座酶与Tn5之间的同源性高达40%。可惜这些转座子的市场效果都不如Tn5，而且转座酶打断识别特异性的问题经常受到竞争对手的诟病。全式金有数据统计，测序的前9bp有明显的偏好性（如表1）（顺便说一下，全式金也有自己Tn5建库试剂盒并有不错的创新，大概是为了规避专利，看过的都知道Epicentre在Tn5建库专利的保护十分严密）。尽管突变Tn5转座酶部分氨基酸位点可以降低DNA偏好性，但无法完全消除bais。表1全式金统计转座酶识别位点偏好性因此，也有不少对手放弃仿制，与其推出一个效果较差的山寨版，不如另辟蹊径。摆脱物理打断，不只有转座酶法。NEB和KAPA等推出了酶解法建库 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ：NEB推出的NEBNextDNA双链片段化酶是时间依赖型酶，能根据不同作用时间将dsDNA切割成50-1000bp片段。NEBNextDNA双链片段化酶由两种酶组成，一种酶随机的在dsDNA上产生切刻，另一种酶识别切刻处并在对链进行切割，产生dsDNA片段（ZYMO也有一款效果不错的类似的产品：dsDNAShearasePlus，当然用这些打断酶要注意DNA溶液EDTA含量，否则影响打断效果）。Qiagen也推出了QIAseqFXDNALibraryKit，这个试剂盒采用FX酶混合液将DNA样品剪切为较小的片段，并开展末端修复，在3’端加A尾，让DNA片段可立即用于连接，只需3步反应即可完成建库，似乎比转座酶更快速（用“似乎”是因为小编没有真正用过）。当然转座酶法也有一些劣势。在液态活检或是NIPT方面，由于cfDNA都是~170bp的短片段，并不特别适合于转座酶建库。Tn5建库是酶量依赖型，在纯化前是不会脱落的（随后长片段之争会说），对DNA定量要求高，否则酶和DNA比例不准确。Tn5酶对DNA溶液中的一些杂质也可能不耐受，影响打断效果。虽然Tn5在极速建库的优势被削弱，但是它还有不少其他优秀的应用。Tn5用于DNA打断，直到它们被化学方法去除掉之前，转座子和DNA序列片段一直是连接起来的（如图7）。利用Tn5的这一特性，研究人员研发了使用短读序列组装成长读长片段，弥补二代测序读长短这一最大的软肋。即长片段物理分隔稀释后，Co-barcode打断，最后根据barcode信息确定片段来源，具有相同barcode的reads可拼接成超长Linked-Reads，Linked-Reads更好地覆盖基因组结构变异信息，跨越基因组复杂结构区域。图7Co-barcode打断原理Co-barcode起源于2012年，这一年CompleteGenomics公司在《Nature》上在线发表了Accuratewhole-genomesequencingandhaplotypingfrom10to20humancells，文章介绍了一种名为长片段读取（LongFragmentRead，简称LFR）的技术（如图8），将DNA长度为10kb到300kb分配到384孔里面，MDA扩增，然后进行Co-Barcode标记，打断成小片段，再合并构建高通量测序文库，测序后利用Barcode序列进行单倍型的组装。（单体分型Haplotyping一直就是研究热点）图8LFR技术建库原理CompleteGenomics就是现在大家熟知的被华大基因收购的CG公司，哈佛大学的GeorgeM.Church也参与了LFR的开发。乔治.邱奇，大家都认识，去年访问中国时他被各大公司聘为顾问，刷爆朋友圈，就不用介绍了。在同一年，来自斯坦福大学的StephenQuake实验室也发布了称为Moleculo的长片段测序技术，与CG的技术不同，Moleculo的技术将Tn5打断的片段锁定在10kb。StephenQuake也是同一级别的大牛，1999年他创办了Flulidigm公司（单细胞测序都知道），也是他完成了第一例人类单细胞测序（Genome-wideSingle-CellAnalysisofRecombinationActivityandDeNovoMutationRatesinHumanSperm）；2015年他在NatureReviewsGenetics上发表的Single-cellgenomesequencing:currentstateofthescience，一直被认为是单细胞测序领域的最权威综述。瀚海基因的三代技术前身就是来源于StephenQuake教授参与成立的HelicosBiosciences公司，StephenQuake教授正是贺建奎博士的博后导师。无创产前筛查技术最早也是由斯坦福大学的StephenQuake实验室和香港中文大学的卢煜明教授分别独立提出的，最近sicence上用孕妇血浆游离RNA预测胎儿早产可能性的文章也是出自他们实验室。Moleculo这一技术2012年被Illumina收购（从收购Solexa到Epicentre，不得不佩服Illumina的眼光），从而开发为TruSeqSyntheticLong-ReadDNALibraryPrepSequencing（是的，这两个技术一个去了华大，另一个去了Illumina）。后来Illumina团队在此基础上开发了CPT-seq，这一技术发表在NatureGenetics杂志上（如图9）。图9CPT-seq技术原理但是这两种长片段测序技术由于技术封闭和手工操作过于复杂，而没有得到很好的推广。将物理分割的Co-barcode技术做到最好的，是借助仪器实现的10XGenomics公司。2015年，10XGenomics公司正式发售GemCode测序平台（技术细节磁珠起源一文说过）。长片段之战，二代测序明显劣于三代，但是10XGenomics的出现，加上PacBio测序的价格昂贵、数据产出不稳定，OxfordNanopore迟迟未商业化，二代测序公司有望和三代暂时扳扳手腕，相争与之合作。10XGenomics公司异军突起，堪称测序界的黑马，这几年风光无限。10XGenomics创立于2012年，它的创始人源于数字PCR公司QuantaLife的高管。又是一次大鱼吃小鱼，Bio-Rad收购了QuantaLife，并推出了QX100微滴式数字PCR平台。看来10XGenomics做微流控技术是有底蕴的。10XGenomics的长读长需要仪器的支持，当然这台仪器还可以用于单细胞转录组测序。不过10XGenomics的技术是基于微流控技术（microfluidics），在单细胞转录组测序上微孔板技术（microwelltechnology）的兴起，在成本上给微流控很大的冲击。最近浙大郭国骥老师在cell的文章就是很好的证明，技术的革新往往会打开一片新天地。最近在长读长上，10XGenomics同样遇到来自华大的挑战。华大并没有放弃LFR这一技术（毕竟cPAL、DNB、PatternedArray、LFR是GC的几大看家本领）。就像cPAL升级为cPAS一样，华大几年如一日的优化研究终于推出了LFR的革新版stLFR（SingleTubeLongFragmentRead，简称stLFR），stLFR技术作为一款突破性的技术，能够在一管中完成所有反应，极大地降低长片段文库构建复杂程度和成本消耗。整个操作无需微量自动化移液设备，无需进行MDA扩增，无需微流控液滴生成装置和芯片，样本起始量低至1ng。基于无分隔共标记的理念，该方法利用磁珠表面形成数千万个虚拟分隔，不同虚拟分隔均携带不同的分子标签。经过酶反应后，高分子量DNA（longfragments）被片段化，同时来源于相同高分子量的片段化短DNA（subfragments）被标记上相同的分子标签，从而实现在测序后通过分子标签还原长片段信息（如图10）。图10stLFR技术原理如果说Nextera™DNAFlexLibraryPreparationKit将极速建库做到了极致，stLFR则是目前基于二代测序的长读长技术的典范，它近期推出了成熟的试剂盒，我们马上就能看到它的能量。Tn5引爆了极速建库和长片段之战，但是Tn5的花样不止于此，ATAC-seq、单细胞测序、matepair文库构建，等等。ATAC-seq利用转座酶代替DNaseI核酸酶分析染色质可接近性，更加简便、投入量更低、通量更高。理论上简单到：ATAC-seq只要加一步细胞核提取，既可以用普通Tn5建库试剂盒完成建库。当然优化上会有一堆的事情，比例配合清华大学颉伟课题组开发CARM技术（CRISPR/Cas9--assistedremovalofmitochondrialDNA），能去除线粒体DNA的污染，极大地提高数据利用率。在单细胞基因组扩增中，2017年谢晓亮课题组发表的LIANTI方法，替换了phi29，用的就是带T7启动子的Tn5转座子打断，然后用T7启动子体外线性扩增。单细胞转录组，由于转录组产物量少，后续的DNA建库一般是用Tn5进行微量建库（1ng起始）。NexteraMatePairLibraryKit（Illumina的Nextera系列）采用转座酶将其含有生物素标记的识别序列随机插入基因组DNA中，使DNA片段打断至合适大小（2-15K），补平后，采用平末端自身环化构建MatePair文库。利用转座酶反应，同时完成DNA片段化与结合biotin标签，极大提高了样本DNA的利用率，同时也缩短了实验周期；通过在打断的基因组DNA两端加上含有生物素标记的接头序列，避免生物素标记的dNTP掺入到DNA片段的中间，减少了非特异性标记，提高数据准确性和利用率。诺唯赞也有类似的试剂盒，性价比很高。可以说NGS的发展，Tn5会被玩出越来越多的花样……作者简介：csp:熟悉NGS各类建库技术，主攻DNA方向；杨婷婷：擅长转录组建库试剂盒开发，熟知竞品性能相关文章链接：磁珠起源微信公众号——NGS实验起源