植物叶片中叶绿素含量测定----丙酮提取法
1、原理
叶绿素a、b在长波的最大吸收峰分别在663nm、645nm,据Lamber-Beer 定律,可得浓度C与光密度D间的关系式:
D663=82.04Ca +9.27Cb
D645=16.75Ca +45.6Cb (浓度单位:g/mL)
叶绿素a的浓度:Ca= 12.72D663 – 2.59D645
叶绿素b的浓度:Cb= 22.88D645 – 4.68 D663
总叶绿素的浓度:Ct = 20.29D645 +8.02D663 (浓度单位:mg/L) 2、试剂与材料
2.1 试剂:
丙酮、石英砂、碳酸钙
2.2 材料:
新鲜叶片。
2.3 仪器与器皿:
分光光度计、天平、剪刀、研钵、移液管、漏斗、大试管
3、实验步骤
称1.25g叶用丙酮研磨
↓
匀浆过滤(用80%丙酮洗研钵及残渣,合并滤液)
↓
滤液用80%丙酮定容至25mL
↓
适当稀释后测A645、A663
3.1 取样:称取1.25g剪碎的叶片(提供的样品即为剪碎后冻于-80℃的叶片)放入研钵中。注意取样时要避开大的叶脉。
3.2 研磨提取:向研钵中加入80%丙酮2.5ml,以及少许(约0.002g)CaCO3 (中和酸性,防止叶绿素酯酶分解叶绿素) 和石英砂,研磨成匀浆,再加入3ml 80%丙酮,继续研磨至组织变白,在暗处静止3~5min后,用一层干滤纸过滤到25ml容量瓶中,用滴管吸取80%丙酮将研钵洗净,清洗液也要过滤到容量瓶中,并用80%丙酮沿滤纸的周围洗脱色素,待滤纸和残渣全部变白后,用80%丙酮定容至刻度。
3.3 读取吸光度:取厚度为lcm的洁净比色皿,注意不要用手接触比色皿的光面,先用少量色素提取液清洗2~3次,注意清洗时要使清洗液接触比色皿内壁的所有部分,然后将色素提取液倒入比色皿中,液面高度约为比色皿高度的4/5,将撒在比色皿外面的溶液用滤纸吸掉(注意不能擦),再用擦镜纸擦干擦净。将比色
皿放入仪器的比色皿架上,注意不要将溶液撒入仪器内。第一个位置放盛有80%丙酮的比色皿,做为空白对照。将仪器波长分别调至663、645nm处,以80%丙酮做为空白对照调透光率100%,分别测定溶液在上述2个波长下的吸光度。每个样品重复测定3次。注意,每次在转换波长时,都要用80%丙酮调透光率100%。
4、结果计算
总叶绿素的浓度:Ct = 20.29D645 +8.02D663 (浓度单位:mg/L)
叶绿素含量:Chl(mg/g叶)=Ct(mg/L)×提取液总量(L)×稀释倍数/材料鲜重(g)
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