20140709(定稿)玻璃酸钠及制剂分子量与分子量分布测定方法研究

修改内容：4.小结中的2个“分子量”改为“分子质量”。 其它未修改。 玻璃酸钠及制剂分子质量与分子质量分布测定方法研究* 宋玉娟，李颖颖，范慧红** (中国食品药品检定研究院，北京 100050) 摘要目的:分析玻璃酸钠(SH)及制剂分子质量和分子质量分布测定不同模式的特点，重点研究折光指数增量(dn/dc值)、对照品等对测定结果的影响。方法:采用凝胶色谱法(SEC)，色谱柱为ShodexSB806HQ(300 mm×8 mm)，流动相为0.2 moL·L-1的氯化钠溶液(含0.02％叠氮化钠)，流速为0.5mL?min-1，柱温为35℃，进样量100μL，检测采用2种方法，单一示差折光检测器及采用示差折光检测器和激光光散射仪(MALLS)联用。结果:玻璃酸钠及制剂相对分子质量和绝对分子质量测定结果存在约30%的误差，dn/dc值、对照品等对测定结果产生一定影响。结论:凝胶色谱示差折光检测法和凝胶色谱激光光散射联用法，2种方法均可用于玻璃酸钠及制剂分子质量控制。 关键词：玻璃酸钠(SH)；分子质量；分子质量分布;凝胶色谱法(SEC)；凝胶色谱激光光散射联用法(SEC-MALLS)；折光指数增量(dn/dc) 中图分类号：R917    文献标识码：A    文章编号：0254-1793(2014)08 Determination of molecular weight and molecular weight distribution of sodium hyaluronate and its preparations* SONG Yu-juan, LI Ying-ying, FAN Hui-hong** (National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050，China) Abstract Objective: To analyze the different determination modes of molecular weight and molecular weight distribution of sodium hyaluronate (SH) and its preparations, especially the influence of dn/dc value and standards on the determination results. Methods: Using SEC method，samples were analyzed on a ShodexSB806HQ column(300 mm×8 mm)，the mobile phase was 0.2 moL?L-1 sodium chloride (containing 0.2％sodium azide) at a flow rate of 0.5 mL?min-1, the injection was 100 μL, the column temperature was 35 °C, and the signals were detected by RI detector (used by SEC method) or RI coupled with MALLS detectors (used by SEC-MALLS method). Results: The results showed that there were about 30% differences between the molecular weight and molecular weight distribution results determined by SEC-RI and SEC-MALLS methods, and the dn/dc value and standards had certain influences on the determination results. Conclusion: SEC-RI and SEC-MALLS methods could both be used for quality control of SH and its preparations.  Key words: sodium hyaluronate (SH); molecular weight; distribution of molecular weight; size exclusion chromatography (SEC)；size exclusion chromatography–multi angle laser light scattering (SEC－MALLS)；refractive index increment (dn/dc) 玻璃酸钠(sodium hyaluronate, SH)是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-氨基葡萄糖双糖单位构成的糖胺聚糖的钠盐，广泛用做眼科的保护剂、关节腔内注射剂和药用辅料等,并且在预防和减少外科术后粘连中取得了较大进展[1-5]。不同的用途对分子质量大小有不同的要求，因此分子质量与分子质量分布是SH质控的重要指标。 用于玻璃酸钠分子质量测定的方法主要有特性黏度法，SEC法，SEC-MALLS法[6-7],美国药典未收录该品种，欧洲药典7.0[8]和日本药局方16版增补本[9]中均采用黏度法来控制分子质量。之前笔者已对各种方法的优劣进行分析，建立了相对子质量测定方法和绝对分子质量测定方法测玻璃酸钠分子质量，确立了合适的样品浓度[10]。本文主要针对相对法尚无国家对照品，绝对分子质量测定方法需准确测定玻璃酸钠的dn/dc值这2个难题进行大量数据分析，重点研究dn/dc值、对照品等对测定结果的影响，以期对多糖类药物分子质量测定提供参考。 1 仪器与试药 高效液相色谱仪1(岛津LC-10AD泵，RID-10A示差折光检测器，DGU-14A脱气装置，Sil-10AD自动进样器，CTO-10AVP柱温箱，龙智达软件)；高效液相色谱仪2(岛津LC-20AD泵，DGU-20A3脱气装置，SIL-20AC自动进样器，CTO-20A柱温箱)；美国Wyatt十八角度激光光散射仪(Hellos 11)及DNDC仪(Optilab REX)；ASTRA V5.3.2软件；Mittler电子天平；Millipore超纯水机。 对照品聚苯乙烯磺酸钠盐，智达公司提供的该对照品(Polystyrene Sulfonate Standards，批号9004-54-07)的相对分子质量Mr分别为63900、145000、282000、666000、976000、2260000、5640000；美国Phenomenex公司提供的该对照品(Poly Styrene Sulfonate，货号AL0-4423)相对分子质量Mr分别为12900、43300、81800、152300、333000、940000、1310000、2480000；归一化对照品(Wyatt公司)；叠氮化钠(Merck公司)；氯化钠为国产分析纯试剂；国内外企业提供的样品37批。 2方法 2.1dn/dc值测定方法 精密称取玻璃酸钠(按干燥品计)10 mg，置25mL量瓶中，用含0.02％叠氮化钠的0.2moL·L-1的氯化钠溶液(取氯化钠11.9g、叠氮化钠0.2g，加纯水溶解至1000mL，0.22μm滤膜过滤，即得)溶解至刻度，静置过夜，混匀。分别称取该溶液0、1、2、3、4、5、6 mL，流动相6、5、4、3、2、1、0mL，配成7个浓度梯度，依次注入怀雅特的示差折光检测器OptilabrEX，通过怀雅特ASTRA V5.3.2软件计算其结果。 2.2绝对分子质量测定 高效液相色谱仪,岛津LC-20AD泵，DGU-20A3脱气装置，SIL-20AC自动进样器，CTO-20A柱温箱；美国Wyatt十八角度激光光散射仪(Hellos 11)及DNDC仪(Optilab REX)；ASTRA V5.3.2软件；Mittler电子天平；Millipore超纯水机。 供试品溶液的制备：取样品适量，加流动相1mL溶解，得到0.1 mg·mL-1的溶液，0.22μm滤膜过滤，即得。 色谱条件和系统适用性试验：采用ShodexSB806HQ(300 mm×8 mm)色谱柱，流动相为含0.02％叠氮化钠的0.2 moL·L-1的氯化钠溶液，流速0.5mL·min-1，柱温为35℃，进样量100μL，SEC-MALLS法用示差折光检测器和激光光散射仪联用检测。用怀雅特归一化样品进行系统适用性校正。 2.3 相对分子质量测定 高效液相色谱仪，岛津LC-10AD泵，RID-10A示差折光检测器，DGU-14A脱气装置，Sil-10AD自动进样器，CTO-10AVP柱温箱，龙智达软件；Mittler电子天平；Millipore超纯水机。 供试品溶液的制备同“2.2”项。另取5个已知相对分子质量范围1万～500万的对照品，同法制成每1mL中约含0.1mg的溶液作为系列对照品溶液。 色谱条件和系统适用性试验：采用ShodexSB806HQ(300 mm×8 mm)色谱柱，流动相为含0.02％叠氮化钠的0.2 moL·L -1的氯化钠溶液，流速为0.5mL·min-1，柱温为35℃，进样量100μL，示差折光检测器，由GPC软件进行普适校正计算线性回归方程，对照品比例常数K为0.00018，扩张因子α为0.65；本品K为0.00057，α为0.75。理论塔板数按葡萄糖峰计应不低于5000。 3结果与讨论 3.1  dn/dc值测定结果及讨论 结果见 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 1和图1。dn/dc值是样品固有的物理常数，理论上不同企业的样品测定结果应一致。实验发现进口企业不同批次间结果一致。企业之间甚至同一国产企业不同批次间差异较大。在无法获知哪家企业样品更纯的情况下，最终采用不同企业结果平均值0.156mL·mg-1进行计算。 图1玻璃酸钠dn/dc值测定色谱图 Fig 1  Chromatograms of dn/dc value of SH 表1玻璃酸钠dn/dc值测定结果 Tab 1 The results of dn/dc value of SH   原料生产企业 样品编号 dn/dc/mL·g-1 (factory) (sample number)   1 1 0.157   2 0.159 2 3 0.158   4 0.157 3 5 0.152   6 0.158   7 0.158   8 0.154   9 0.165 4 10 0.150   11 0.150 平均值(average) 0.156       3.2绝对分子质量与相对分子质量测定结果及讨论 玻璃酸钠及其制剂绝对分子质量和相对分子质量测定数据见表2，测定图谱见图2和图3。 因为目前国内没有玻璃酸钠分子质量测定用国家对照品，相对分子质量测定方法中笔者采用了龙智达提供日本对照品及美国Phenomenex公司提供的对照品分别进行了测定。结果2种对照品的测定结果存在10%左右的误差。绝对分子质量和相对分子质量的测定结果存在较大差异。 表2玻璃酸钠及其制剂分子质量测定结果 Tab 2  The determination results of molecular weight of SH and its preparations 生产企业 样品编号 绝对分子质量 相对分子质量 (factory) (sample No) (abosalute molecular weight) (relative molecular weight) 样品(sample)   绝对分子质量 分布系数 日本对照品 分布系数 菲罗门对照品 分布系数   (abosalute molecular weight) (distribution coefficient) (Japanese standars) (DC) (Phenomenexstandars) (distribution coefficient) 原料(material)               1 1 1489000 1.6 1102000 1.9 1030000 1.8   2 1513000 1.5 1128000 1.8 1054000 1.8   3 1598000 1.5 1083000 1.8 1016000 1.7 2 4 1129000 1.6 875000 2 828000 1.9   5 1583000 1.6 1120000 2.2 1048000 2.1   6 1533000 1.6 1219000 1.9 1138000 1.8 3 7 1552000 1.5 1103000 2.2 1034000 2   8 1582000 1.6 1270000 2.1 1187000 1.9   9 1542000 1.5 1214000 2 1131000 1.9   10 2240000 1.3 1609000 1.6 1504000 1.5   11 2227000 1.2 1689000 1.6 1567000 1.6   12 1957000 1.3 1586000 1.6 1520000 1.5 4 13 1492000 1.7 754000 1.8 712000 1.7   14 1505000 1.7 725000 1.7 690000 1.6 注射液(injection)               A 1 1936000 1.4 1558000 1.8 1446000 1.7   2 1683000 1.5 1352000 1.8 1260000 1.8   3 2001000 1.4 1407000 1.8 1312000 1.7 B 4 1585000 1.6 1203000 1.8 1132000 1.7   5 1582000 1.8 1209000 1.7 1125000 1.7   6 1653000 1.5 1261000 2.1 1178000 2.1   7 1585000 1.5 1247000 1.9 1165000 1.8 C 8 1421000 1.5 1128000 2 1057000 1.9   9 1338000 1.6 1013000 1.7 951000 1.7   10 1882000 1.5 1579000 1.6 1467000 1.6 滴眼液(eye drops)               Ⅰ 1 1238000 1.5 696000 1.8 661000 1.8   2 1278000 1.4 944000 1.8 892000 1.7   3 1279000 1.7 945000 1.7 890000 1.7 Ⅱ 4 1655000 1.5 1149000 1.9 1078000 1.8   5 1611000 1.5 1086000 1.8 1020000 1.8   6 1632000 1.5 1213000 1.9 1132000 1.8 Ⅲ 7 1121000 1.6 781000 1.7 737000 1.7 Ⅳ 8 1005000 1.4 721000 1.5 691000 1.5   9 1004000 1.4 760000 1.6 720000 1.6   10 1006000 1.4 728000 1.6 692000 1.5   11 1027000 1.4 709000 1.8 670000 1.7   12 1027000 1.4 709000 1.6 673000 1.6   13 1025000 1.4 699000 1.7 666000 1.7                 A                    B                    C 图2 玻璃酸钠及制剂绝对分子质量测定色谱图 Fig 2  Chromatograms of absolute molecular weight of SH and its preparations A.原料(Active Pharmaceutical Ingredient)    B.注射液(injection)    C.滴眼液(eye drops) A                        B                  C 图3玻璃酸钠及制剂相对分子质量测定色谱图 Fig 3  Chromatograms of relative molecular weight of SH and its preparations A.原料(Active Pharmaceutical Ingredient)    B.注射液(injection)    C.滴眼液(eye drops) 3.3绝对分子质量测定结果与另一实验室测定结果比较 本文的测定结果与另一实验室结果比较见表3，可以看出有一定误差，产生误差的原因主要是另一实验室的dn/dc值采用0.160 mL·mg-1，而本文采用0.156 mL·mg-1，对分子质量200万的样品，dn/dc值由0.156mL·mg-1变为0.160mL·mg-1，在其他参数不变的情况下分子质量结果将减小6万左右。另外参与分子质量计算的示差和折光检测器的仪器参数也对结果产生较大影响，其他色谱条件也对结果产生一定影响。 表3与另一实验室绝对分子质量测定结果比较 Tab 3 The comparison of absolute molecular weight determined in this study with that determined in another lab 样品编号 (sample number) 1 2 3 4 5 另一实验室(another lab)×104 169.5 160.3 194.5 189.4 172.8 ×104 158.2 154.2 222.7 224 195.7             4.小结 要建立绝对分子质量测定方法，必须准确测定样品的dn/dc值。本文对玻璃酸钠的dn/dc值进行了分析测定，结果显示进口企业不同批次间结果一致。企业之间甚至同一国产企业不同批次间差异较大。在测定其他品种的dn/dc值时发现，有的品种该值在不同流动相中没变化，如肝素钠；而有的品种在不同流动相中有较大变化，如羟乙基淀粉。在肝素钠分子质量国际协作标定中，不同协作方提供的dn/dc有较大差异，结果均被采纳。国内有的文章采用文献值[11-12]但未标注流动相的不同。羟乙基淀粉(EP 7.0)是目前唯一在药典中采用绝对分子质量测定方法的品种， 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 中也未对dn/dc值做出规定，所以有必要对国内标准中的dn/dc值进行深入的分析研究，希望本文提供的大量实验数据能为该值测定提供参考。 实验结果显示相对分子质量测定方法（凝胶色谱示差折光检测法）和绝对分子质量测定方法（凝胶色谱激光光散射联用法）的测定结果存在较大差异，对照品的选择会对相对分子质量测定结果产生一定影响。2种测定方法均可用于玻璃酸钠及制剂分子质量的质量控制。 继续完善分子质量与分子质量分布检查项的 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 有2个，一是建立相对分子质量国家对照品；二是采用绝对分子质量测定法，统一dn/dc值及仪器校正用对照品。 参考文献 [1] YANG Xiao-hong(杨晓红),LING Pei-xue(凌沛学),WANG Feng-shan(王凤山).The developing progress of sodium hyaluronate in clinical application(透明质酸预防外科术后粘连的研究进展)[J].Chin J Biochem Pharm(中国生化药物杂志),1998,19(4):205 [2] WANG Yan-hou(王彦厚),WANG Feng-shan(王凤山),GUO Xue-ping(郭学平). 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