超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化 及活力测定、同工酶电泳

实验二 猪血中超氧化物歧化酶(SOD)的分离纯化 及活力测定、同工酶电泳 一、实验原理 超氧化物岐化酶SOD广泛存在于生物体内的含Cu、Zn、Mn、Fe的金属类酶。它作为生物体内重要的自由基清除剂，可以清除体内多余的超氧阴离子，在防御生物体氧化损伤方面起着重要作用。 SOD是一种酸性蛋白，对热、pH和蛋白酶的水解较一般酶稳定。根据金属辅基的不同，它可以分为四类，分别为Mn-SOD、Cu-Zn-SOD、Fe-SOD、Ni-SOD，其中最常见是(CuZn-SOD)，主要存在于真核细胞的细胞质中。CuZn-S0D酶蛋白的分子量约为3.2×104，每个酶分子由2个亚基通过非共价键的疏水基相互作用缔合成二聚体，每个亚基(肽链)含有铜、锌原子各一个，活性中心的核心是铜。SOD作为机体内最重要的抗氧化酶体之一，可以直接清除过量的超氧自由基，阻止机体的过氧化，对机体有较高的防护作用及保健价值。 本实验采用有机溶剂沉淀法以新鲜猪血为原料，从中提取SOD硬进行纯化。酶活力测定可用以下方法：黄嘌呤氧化酶法、细胞色素C法、肾上腺素自氧化法亚硝酸法、NBT光还原法、化学发光法以及邻苯三酚自氧化法等。而该实验SOD酶活性采用邻苯三酚自氧化法测定。酶活性单位定义为:在1ml的反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定义为一个活力单位。SOD同工酶奠定采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术分离鉴定。用“负”显色法显示。由于SOD能够抑制O2-的作用，因此，电泳分离SOD后，凝胶上无SOD处显示为蓝色，又SOD处为无色透明，由此可以鉴定SOD同工酶酶谱。 二、 实验试剂与器材 ACD抗凝剂、0.9%Nacl、丙酮、95%乙醇、氯仿、考马斯亮蓝G-250、50mmol/L pH8.3磷酸缓冲液、10mmol/L EDTA钠盐溶液、3mmol/L 邻苯三酚溶液等以及752分光光度计、 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 天平、具塞试管、刻度吸管、离心机、烧杯、电泳装置、微量进样器、注射器等。 三、 操作步骤 1、 SOD提取 取新鲜猪血20ml，加入到檬酸三钠抗凝液中，新鲜猪血与抗凝液的比例为0.15：1，轻轻搅拌均匀，4 000r/min离心10min，收集红血球。然后用2倍体积生理盐水洗涤，4 000r/min离心10min，弃上清液；重复2次，得洗净的血红球浓稠液。 然后向洗净的红血球加入等倍体积去蒸馏水，搅拌溶血30min，再向溶血液中分别缓慢加入0.25倍体积的预冷95%乙醇和0.15倍体积的预冷氯仿，剧烈搅拌15min左右，4 000r/min离心10min，除去变性蛋白沉淀，取清液0.5mL。过滤，收集滤液（记录体积，测酶活性和蛋白浓度），上清液加热到65℃-70℃，保温15min，然后迅速冷却到室温，4 000r/min离心5min，弃去沉淀物，收集上清液（样品2记录体积，测酶活性和蛋白浓度）。 粗酶液中加入等量预冷丙酮，边加边搅拌均匀，冰箱中静置1h，然后4000r/min离心10min，弃去滤液得沉淀。讲沉淀用丙酮洗两次，离心收集沉淀，自然干燥得绿色成品，称重。按1mg/1mL溶于蒸馏水，备用。 2、SOD酶活性测定 （1）邻苯三酚自氧化速率的测定。 取两支试管按下 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 加入25℃预热过的缓冲液,然后加入预热过的邻苯三酚（空白管用10mmol/L HCl代替邻苯三酚 ），迅速摇匀，立即倾入1cm比色杯中，在325nm波长处测定光吸收值，每隔30s读数一次，测定4min内每分钟光吸收值的变化。要求自氧化速率控制在每分钟的光吸收值为0.07。 （2）酶活力测定 样品管取代自氧化管。样品管测定时先加入预热的待测酶液，再加邻苯三酚。其余步骤同邻苯三酚自氧化速率的测定。 （3）酶活性单位的计算 根据酶活性单位的定义，按照下列公式计算酶活性： 单位活性(u/ml)=(    Ao-Am)/Ao×100% ×反应液总体积数×    样液稀释倍数样液稀释倍数 50%    样液体积 其中Ao为邻苯三酚自氧化率；Am为加酶后的邻苯三酚自氧化率 总活性（U）=单位活性×酶原液总体积 （4）蛋白质浓度测定（考马斯亮蓝G-250法） a 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 曲线制作：6支试管 试剂 试管 1 2 3 4 5 6 蛋白标准液（ml） 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 蒸馏水（ml） 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝（ml） 5 5 5 5 5 5 蛋白质含量（ug） 0 20 40 60 80 100               盖上塞子，摇匀。在595nm下闭塞测定光密度值，1h内完成。以牛血清蛋白（ug）为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。 b样品中蛋白质含量测定 讲待测的SOD溶解病稀释到一定浓度，取一直具塞试管，移液抢加入0.1mL样品提取液，加入0.9mL蒸馏水和考马斯亮蓝试剂，其余操作同上。 c蛋白质含量计算 根据所测样品提取液的光密度，在标准曲线上查的相应的蛋白质含量，计算其浓度。 （5）结果处理 利用考马斯亮蓝法测定没毫升酶原液蛋白质毫克数。 将测得的数据或计算结果填入下表 提纯步骤 酶液总体积（mL） 蛋白质（mg/mL） 酶活性 U/mL 总活性 U 比活性 U/mg 回收率 % 纯化倍数 除血蛋白上清               热变性后上清               丙酮沉淀                               3、SOD同工酶鉴定。 （1）样品制备 去一定量酶液，按酶液：40%蔗糖=1:1（V：V）的比例配成样品液，备用。 （2）上样电泳 a、安装制胶模具：省略 注意事项：在整个过程中要轻拿轻放，以免将玻璃板弄碎。 b、制作分离胶和浓缩胶 分离胶配方:    Tris-HCl溶液（pH8.9） 3mL                   浓缩胶：蒸馏水:3.0mL  30%Acr-Bis 4mL    30%Acr-Bis  0.8mL 蒸馏水:9mL                              Tris-HCl溶液（pH6.7） 1.0mL  10%AP: 0.3mL                                    10%AP: 0.15mL 将分离胶溶液充分混匀,立即全部倒入安装好的制胶玻板中,为使分离胶界面平整,可在倒入分离胶后约5min后在其表面沿高板缓慢均匀加入适量蒸馏水并将电泳槽轻轻敲击桌面。再静置15min左右,让分离胶凝聚完全。 将浓缩胶溶液充分混匀,在聚合完全的分离胶上,倒入浓缩胶,（注意在倒入浓缩胶前要去掉分离胶表层的水）同时插入梳子,直到溶液装满和梳子插平为止。再静置20min左右,浓缩胶聚合完全后为乳白色。 d、点样 在浓缩胶聚合完毕后,小心取出梳子,然后向电泳槽中倒入预冷的电极缓冲液,缓冲液要没过低板。点样前,要对样品进行预处理,即把粗酶提取液与染色指示剂以混合,用50μl的微量点样器吸取样品20μl,将点样器的针头小心插入到点样孔底部,慢慢注入样品,要注意防止漂样。 e、电泳 点样完毕后,连接好导线(正负电极不要接反,红色为正极,黑色为负极),将电压调至200 V,当溴酚蓝标志线移至浓缩胶与分离胶分界处,将电压调至250V,电泳2-3小时,当示踪标志线刚好距胶底1cm处时,结束电泳。 f、取胶显带 切断电源,取出凝胶板,用解剖刀扁平部分插入玻板的一角(是分离胶的一角),轻轻撬去一块玻板,用刀切掉分离胶右下角以示点样顺序,轻轻撬起分离胶,使之滚入染色培养皿中。 将电泳后的凝胶在严格避光的NBT溶液内浸泡20min，再放在2.8mmol/L的EDTA-Na2溶液中40W日光灯直射，至蓝色背景下出现多条透明酶带为止，拍照。 四、实验结果 1、蛋白质标准曲线 蛋白质含量（ug) 0 20 40 60 80 100 OD值 0 0.048 0.012 0.178 0.236 0.370               2、蛋白质含量   稀释后OD值 稀释后蛋白含量（ug/ml） 蛋白含量(mg/ml) 除血蛋白上清稀释10倍 0.137 44.31 0.4431 热变性后上清稀释8倍 0.143 46.10 0.3688 丙酮沉淀后的稀释5倍 0.140 45.19 0.2260           3、蛋白质活力 3.1邻苯三酚自氧化率 测定序号N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A325值 0.077 0.111 0.146 0.181 0.215 0.247 0.280 0.311 0.343 AN(x+2)-ANx     0.069 0.070 0.069 0.066 0.065 0.064 0.063 A0 0.06657                                     3.2除血蛋白上清液 测定序号N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A325值 0.444 0.448 0.455 0.459 0.464 0.469 0.475 0.481 0.487 AN(x+2)-ANx     0.011 0.011 0.009 0.01 0.011 0.012 0.012 Am 0.010857                                     单位活性（U/ml）=16738.2 3.2热变性后上清液 测定序号N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A325值 0.135 0.146 0.155 0.165 0.175 0.185 0.196 0.207 0.217 AN(x+2)-ANx     0.02 0.019 0.02 0.02 0.021 0.022 0.021 Am 0.020429                                     单位活性（U/ml）=13862.66 3.3丙酮沉淀后的2ml蛋白溶液 测定序号N 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A325值 0.088 0.095 0.101 0.106 0.111 0.117 0.123 0.127 0.132 AN(x+2)-ANx     0.013 0.011 0.01 0.011 0.012 0.01 0.009 Am 0.010857                                     单位活性（U/ml）=16738.2 4、小结： 提纯步骤 酶液总体积（mL） 蛋白质（mg/mL） 酶活性 U/mL 总活性 U 比活性 U/mg 回收率 % 纯化倍数 除血蛋白上清 15.2 0.4431 16738.2 7416.696 37775.22     热变性后上清 11.9 0.3688 13862.6 5112.527 37588.39 68.93 0 丙酮沉淀 2 0.2260 16738.2 3781.996 74079.22 73.97 1.97                 5、同工酶鉴定 Page图：可见清晰的两条带。 五、结果讨论分析： 1、本实验小组在溶血过程中，由于搅拌机在操作过程中出现不稳定、不均匀的摇曳，导致离心管中的血液出现了大量的气泡，这与理论操作是不向符合的，结果导致后面的实验出现很严重的偏差，如在后面的操作（65-75度处理以及4000r/min离心5min），结果并没有得到理想的浅黄色酶液，而是呈现了深色絮状沉淀。另外组装电泳槽的过程也出现了误差，在注入分离胶后、出现遗漏情况。所以我们在添加浓缩胶的时候加的比较多，结果浓缩胶和分离胶的比例出现误差，使得电泳过程相当于其他小组、时间花的特别的久。但是电泳的结果很不理想。在蓝色背景下，虽然依旧出现了多条透明的酶带，但是预期结果依旧不理想。所以在准备实验报告的时候，我们借鉴了班上实验结果比较理想的数据作为参考。 2、实验过程标准曲线是比较理想的R2=0.970，同时根据比活性以及总活性、回收率的结果比较都是比较合理的。所以SOD的分离纯化以及活力测定的结果都是比较理想的。3、在实验过程中之所以使用Tris-HCl而不用磷酸是因为反应物邻苯三酚在酸性条件下稳定，在碱性条件下能自氧化。而SOD活力的测定主要是依靠SOD抑制邻苯三酚的自氧化实现的。磷酸缓冲液的PH大约为7，无法提供邻苯三酚需要的碱性环境。4、邻苯三酚的浓度是决定其自氧化的速率高低的主要因素，浓度越高，自氧化速度就越快，相同单位的SOD对邻苯三酚自氧化的抑制程度就越小，从而使得测量的结果就越小。所以为使结果具有可重复性，必须严格控制测定液中邻苯三酚的终浓度保持相同。