动物细胞和植物细胞培养反应器

第三章　植物细胞和动物细胞培养反应器动植物细胞培养与微生物细胞培养有很大的不同。动物细胞培养与微生物培养区别：•动物细胞无细胞壁，且大多数哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长；对营养要求严格，除氨基酸、维生素、盐类、葡萄糖或半乳糖外，还需有血清。动物细胞对环境敏感，包括pH、溶氧、温度、剪切应力都比微生物有更严的要求，一般须严格的监测和控制。植物细胞培养与微生物培养区别：•植物细胞对营养要求较动物细胞简单。但由于植物细胞培养一般要求在高密度下才能得到一定浓度的培养产物，以及植物细胞生长较微生物要缓慢，长时间的培养对无菌要求及反应器的 设计 领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计 也提出特殊的要求。动植物、微生物细胞的培养比较微生物动物细胞植物细胞大小(直径,μm)1-1010-10010-100悬浮生长可以多数细胞需附着表面才能生长可以，但易结团，无单个细胞营养要求简单非常复杂较复杂生长速率快，倍增时间0.5-5小时慢，倍增时间15-100小时慢，倍增时间24-74小时代谢调节内部内部、激素内部、激素环境敏感不敏感非常敏感能忍受广泛范围细胞分化无有有剪切应力敏感低非常高高传统变异，筛选技术广泛使用不常使用有时使用细胞或产物浓度较高低低植物细胞培养：是指在离体条件下将愈伤组织或其他易分散的组织置于液体培养基中，将组织振荡分散成游离的悬浮细胞，通过继代培养使细胞增殖来获得大量细胞群体的方法。第一节植物细胞培养反应器生产方式收获时间紫草宁浓度（%干重）完整植物2-3年1-2植物细胞培养21天14表1植物细胞培养和从完整的植物生产紫草宁的比较1．细胞培养液的特性植物细胞比微生物细胞大50－100倍，体积大约要膨大105－106倍，在培养液中所占体积可高达40－50%，而酵母一般只有5%左右，培养过程中培养液的黏度可增大30倍。2．植物细胞培养中的传氧状态所有植物细胞都是好氧性的，但不需太高的传氧速率。植物细胞由于体积较大，比表面积比微生物小得多，耗氧速率一般也比微生物小得多，如烟草细胞培养中最大值为0.6mmol/g.h，而微生物则在1.5－8mmol/g.h。3.培养液中植物细胞的特性植物细胞比微生物细胞大；植物细胞通常以细胞数在2-200之间、直径为2mm左右的非均相集合细胞团方式存在；植物细胞纤维素细胞壁抗剪切能力弱。 一、植物细胞培养的过程特点1、悬浮培养生物反应器机械搅拌式反应器：非机械搅拌式（气体搅拌式）反应器：2、固定化细胞生物反应器填充床反应器：流化床反应器：膜反应器：二、植物细胞培养反应器大规模植物细胞培养反应器1.1机械搅拌式反应器机械搅拌式反应器是最传统的微生物发酵装置，同样也可用于植物细胞悬浮培养。机械搅拌式反应器已成功地用于许多细胞的培养中，能够获得较高的溶氧系数，而且也具有反应器内的温度、pH、溶氧及营养物浓度较其他反应器更易控制等优点；但其缺点在于剪切力大，易对植物细胞造成较大损伤，对次级代谢产物的合成也会产生影响。能耗大。机械搅拌需要相对比较复杂的密封，这些密封使用不当容易产生泄漏造成染菌使细胞培养失败。1、悬浮培养生物反应器反应器结构：与微生物通风搅拌发酵罐相似设计要点：要选用该类反应器，除需要筛选出抗剪切力的细胞系外，对反应器结构进行适当改造，尤其是搅拌浆的结构和类型的改进，使其具有缓和的、但又充分的搅拌效果。六叶罗式搅拌器实物图罗氏搅拌器：在较低的搅拌速度下有较好的混合效果。罗式搅拌器有六叶搅拌器和四叶搅拌器，一般常用六叶搅拌器。搅拌器的个数取决于反应器的高径比，最低端的搅拌器离罐底的距离通常为反应器直径的三分之一，第二个搅拌器与第一个搅拌器的距离约为搅拌器直径的1.2倍，余此类推。后来，有人使用锚式搅拌器和螺旋式搅拌器进行植物细胞的培养，也取得了较好的效果。一般认为螺旋式搅拌器效果最优。锚式搅拌器和螺旋搅拌器植物细胞培养反应器吸筒式搅拌器和帆式搅拌器也常用于植物细胞的悬浮培养中，其结构如下图所示。吸筒式搅拌器的结构原理在本章动物细胞培养反应器中会有详细介绍，帆式搅拌器结构相对简单，由四片较大的搅拌叶组成。这两种搅拌在使用时转速都不高，一般在30～80转/分。吸管式搅拌器和帆式搅拌器带帆形搅拌器的连续灌注系统培养反应器搅拌桨是用尼龙丝编织带制成帆形，搅拌轴用磁力驱动旋转，转速为20~50r/min，氧气通过插入溶液中的硅胶管扩散到培养液内，以维持培养液内一定的溶解氧水平。http://www.bioeng.zjut.edu.cn/sbs.asp?id=1181.2非机械搅拌式反应器优点：由于没有活动的搅拌装置，剪切力小，对细胞损伤小，而且容易实现长期无菌培养。缺点：操作弹性小，低气速时尤其在培养后期植物细胞密度较高时，混合效果较差。如果提高通气量，又会产生大量泡沫，气泡破裂时产生的剪切力会伤害正在生长的细胞，因此只适用于对剪切力不敏感的细胞培养，此时一种较为有效的方法是添加消泡剂。此外，对这类反应器缺乏足够的 经验 班主任工作经验交流宣传工作经验交流材料优秀班主任经验交流小学课改经验典型材料房地产总经理管理经验 ，放大过程也不如机械搅拌式反应器成熟。通入空气作通气和搅拌的生物反应器，主要有鼓泡式反应器和气升式反应器。鼓泡式反应器：细胞及培养液装在反应器中，反应器的高径比通常为4～6。气体通过底部的气体分配器鼓入，分散成气泡沿着液体上升，同时搅动液体以增加传质速率。一般在塔内设有挡板，以减少液体返混。为加强液体循环和传递反应热，可设外循环管和塔外换热器。2、固定化细胞生物反应器固定化细胞培养技术是指通过利用化学或物理的方法，将细胞固定在某一支撑物上，比如固体颗粒或者膜上，然后加以培养。用这种方法进行细胞培养不仅减少了细胞受到剪切力伤害的可能性，而且由于细胞固定在某种支撑物上，可以很容易与培养液分开，既有利于细胞产物的分离，又使细胞能够反复培养利用，降低了生产成本。2.1填充床反应器2.2流化床生物反应器2.3膜生物反应器优点：单位体积固定细胞量大。缺点：混合效率低，使必要的氧传递、pH值、温度的控制和产物的排泄很困难；填充床中颗粒或支持物的破碎会阻塞液体流动；用于固定的胶粒在高压下容易变形，会导致填充床阻塞。2.1填充床反应器填充床生物反应器中，细胞固定于支持物（胶粒、泡沫、金属颗粒或相连的网）表面或内部，细胞固定支持物颗粒堆叠成床，培养基在床层间流动，通过培养液流动实现混合和传质。2.2流化床生物反应器流化床生物反应器中，细胞包裹于胶粒、金属或泡沫颗粒中成为固定化植物细胞，通过培养液自下而上在反应器内的流动使固定化细胞呈流态化悬浮状态，培养液与植物细胞充分接触，混合程度高，传质传热效果好。流化床生物反应器缺点在于：剪切力和颗粒碰撞会破坏固定化细胞；流体动力学复杂使其放大困难。2.3膜生物反应器膜式反应器是近年来生物反应器研究的重要领域，也是近年来广泛使用的一种固定化反应器。膜固定化是采用具有一定孔径和选择透性的膜固定植物细胞。营养物质可以通过膜渗透到细胞中，细胞产生的次级代谢产物通过膜释放到培养液中。膜生物反应器最常用的是中空纤维和螺旋式卷绕反应器。中空纤维反应器：中空纤维是用聚矾或聚丙烯制成。管壁的厚度约50－75um，直径200um，管壁是半透膜，能够透过各种营养物质，但是细胞却不能穿过。一个培养筒内由数千根中空纤维组成，然后封存在特制的圆筒内，这样就形成了2个空间，纤维管内为“内室”，管间隙为“外室”。细胞固定在中空纤维外壁和反应器外壳内壁之间，或者说，细胞填充在反应器内，多束中空纤维从中穿过。营养物质从中空纤维流过，通过中空纤维膜渗透到细胞层中。（细胞保留在管外，基质走管内）螺旋式卷绕反应器：在两层平板膜中间夹着一层细胞，然后将夹着细胞的两层平板膜卷绕成螺旋状。在卷绕过程中，膜与膜之间用支撑物隔开一定的空间，细胞营养液被引入到这个空间里，其中的一部分通过膜进入细胞层，维持细胞生长，细胞的代谢产物也通过膜渗透到营养液中，被下游过程回收。1、贴壁培养：大多数动物细胞在离体培养条件下都需要附着在带有适量正电荷的固体或半固体的表面上才能正常生长，细胞一经贴壁就迅速铺展，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般数天后就铺满培养表面，并形成致密的细胞单层。第二节动物细胞培养反应器一、动物细胞培养方法：贴壁的单核细胞使用过的旧瓶子培养BHK21细胞时细胞更容易发生脱落，而使用新瓶子进行培养时细胞能良好生长。最初采用滚瓶培养。VanWezel在1967年开发了一种微载体系统培养壁依赖性细胞。微载体是直径为60－250um的微珠。细胞贴附于微载体上，悬浮于培养基中，逐渐生长成单层，具有单层培养和悬浮培养的优点。玻璃微珠制备微载体的 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 主要有：–葡聚糖（DEAE-SephadexA50及A25）–塑料–明胶–玻璃–纤维素2、悬浮培养：少数悬浮生长型动物细胞在离体培养时不需要附着物，悬浮于培养液中即可良好生长。适用于一些来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞以及某些转化细胞等非贴壁依赖性细胞。动物细胞的悬浮培养是在微生物发酵的基础上建立起来的，但由于动物细胞没有细胞壁，不能耐受剧烈搅拌和通气时产生的剪切力，因而又与经典的发酵不同。小规模悬浮培养悬浮培养瓶3、固定化培养：是指采用吸附（固体吸附剂）、共价贴附（与固相载体结合）、共价交连（用试剂处理使细胞间形成桥而絮结）、包埋（将细胞包埋在多孔材料内）等方法将细胞固定在支持物上，或将细胞嵌入微囊或高分子聚合物的网络中进行培养。该方法对贴壁依赖性细胞与非贴壁依赖性细胞均适用。二、细胞培养的操作方式1、分批式操作2、流加式操作3、半连续式操作4、连续操作5、灌注培养灌注培养1．通气搅拌式细胞培养反应器通气搅拌式动物细胞培养反应器顾名思义就是既有机械搅拌又有通气装置，是在微生物发酵反应器基础上改进的一类细胞培养反应器，适用于悬浮细胞的培养或者生长在微载球的贴壁细胞培养。机械搅拌和通气形式的不同产生了各种各样的通气搅拌反应器。其中比较典型的是笼式通气搅拌反应器。三、动物细胞大规模培养反应器1.1笼式通气搅拌器气泡用丝网隔开，避免在向培养基通气时损伤细胞。同时在采用微载体系统培养时，微载体不会被由于通气所产生的泡沫滞留在气液界面中。笼式搅拌器剖面图优点：避免向培养基直接通气时气泡损伤细胞，剪切力小。没有移动部件，密封好。缺点：氧传递系数小，不能满足高密度细胞的耗氧要求；气路系统不能就地灭菌。反应器适用范围悬浮培养：非贴壁依赖性细胞和贴壁于微载体的贴壁细胞。2．气升动物细胞培养反应器与微生物发酵及植物细胞培养的反应器结构相同。优点：结构简单，避免使用轴承而造成细胞培养的污染；传质性能好，尤其是氧的传递效率高；产生的湍动温和，剪切力小，循环量大，使细胞营养成分均布于培养基中。气升式反应器结构示意图1—培养液上升区2—培养液下降区3—气液分配板4—液体上升口5—气体导入口6—液体引入口7—气液分离区8—导流筒9—液体导入区http://www.bioeng.zjut.edu.cn/sbs.asp?id=1213．中空纤维细胞培养反应器培养筒纤维管内为“内室”，灌流无血清培养液供细胞生长，管间隙为“外室”，接种细胞就贴附于“外室”的管壁上，并吸取从“内室”渗透来的营养，迅速生长繁殖。由于细胞分泌物的分子量大而无法透过半透膜到“内室”，只能留在“外室”不断被浓缩，当收集产物时，只要把管间“外室”的总出口打开就可获取产物。而代谢物由于分子量小，可以从管壁渗透到“内室”，最后从“内室”总出口排出，不会对“外室”的细胞产生毒害作用。一种中空纤维细胞培养反应器结构示意图1—中空纤维束；2（2‘）—反应器外壳；3（3‘）—中空纤维束固定板；4（4’）—中空纤维内腔进出口；5（5‘）—中空纤维外表面进出口；6（6'）—密封板用途：即可培养悬浮生长细胞，又可培养贴壁依赖性细胞。4．微囊培养系统美国DamonBiotech公司创建。微囊技术：把生物活性物质、完整的活细胞或组织包在薄的半透膜中。微囊的制备：在无菌条件下，将活性细胞或生物活性成分悬浮在1.4%海藻酸钠溶液中；通过特制的成滴器将含有细胞的悬液形成一定大小的小滴，滴入CaCl2中，形成内含活性细胞或生物活性成分的凝胶小珠；再用半透膜材料包被，形成坚韧多孔可通透的外膜;重新液化胶化物使其流出，活性细胞或生物活性成分则留在多孔膜内，放入气升式发酵罐内培养。http://www.bioeng.zjut.edu.cn/sbs.asp?id=1225．大载体系统大载体是由海藻酸钠构成。海藻酸钠含有重复排列的葡糖醛酸和甘露糖醛酸，在钙溶液中形成适宜于附着的网络状凝胶珠。在收集细胞时，可用EDTA和柠檬酸钠使细胞从凝胶中分离出来。大载体制作：配制50mmol/L氯化钙溶液;将活性细胞悬浮于低粘度的海藻酸钠凝胶中混匀;按适宜速度喷珠于氯化钙溶液中;抽出氯化钙溶液，用生理盐水洗2次。6．微载体培养系统定义：用固定小颗粒（微珠）作载体，使单层动物细胞生长于微珠表面，可在培养液中进行悬浮培养。微载体：贴壁培养动物细胞的载体微珠。经过二十几年的发展，该技术已日益完善和成熟，并广泛应用于大规模培养贴壁依赖性细胞。目前生产规模已达几千升甚至上万升，且细胞培养密度也很高。一种微载体的放大照片细胞在微载体上生长情况的显微照片细胞在微载体上生长时趋向扁平，大部分单层生长，部分细胞重叠生长。微载体培养系统通气搅拌式细胞培养反应器都可以用于微载体细胞培养。利用这些反应器进行微载体细胞培养时，首先向反应器中加入培养液，然后向培养液中加入一定量的微载体，再向反应器中接入细胞进行培养。培养完成后，培养液和微载体分离，送入下游处理。用微载体系统大规模培养动物细胞具有显著的优点：①兼有单层培养和悬浮培养的优势，且为均相培养；②细胞所处环境均一，放大容易；③比表面积大，单位体积培养液的细胞产率高；④培养操作可系统化、自动化，减少了污染机会⑤细胞和培养液易于分离。但其缺点是①搅拌浆及微珠间的碰撞易损伤细胞；②接种密度高；③微载体吸附力弱，不适合培养悬浮型细胞。