实验十二高效液相色谱柱效能的测定
实验十二 高效液相色谱柱效能的测定
高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)是以液体作为流动相的一种色谱分析法，它的基本概念及理论基础，如保留值、塔板理论、速率理论、容量因子、分离度等，与气相色谱是一致的。但又有不同之处。高效液相色谱与气相色谱的主要区别可归结于以下几点。
(1)流动相的不同，在被测组分与流动相之间、流动相与固定相之间都存在着一定的相互作用力;
(2)由于液体的粘度较气体大两个数量级，使被测组分在液体流动相中的扩散系数比在气体流动相中约小4,5个数量级;
(3)由于流动相的化学成分可进行广泛选择，并可配制成二元或多元体系，满足梯度洗提的需要，因而提高了高效液相色谱的分辨率 (柱效能);
(4)高效液相色谱采用5,10μm细颗粒固定相，使流动相在色谱柱上渗透性大大减小，流动阻力增大，必须借助高压泵输送流动相;
(5)高效液相色谱是在液相中进行，对被测组分的检测，通常采用灵敏的湿法光度检测器，例如，紫外光度检测器、示差折光检测器、萤光光度检测器等。
与气相色谱相比较，高效液相色谱同样具有高灵敏、高效能和高速度的特点，但它的应用范围更加广泛。据估计在自然界数百万种有机化合物中，仅有20%可以不经过化学预处理，直接采用气相色谱分析。而对于总数的75%,80%,则可采用高效液相色谱进行分离分析，特别是许多高沸点、难挥发、热稳定性差的物质,如生物化学制剂、金属有机络合物等物质的分离分析，尤需借助于高效液相色谱方法。目前高效液相色谱已得到愈来愈广泛的应用。
根据固定相的类型和分离
机制
综治信访维稳工作机制反恐怖工作机制企业员工晋升机制公司员工晋升机制员工晋升机制图
，高效液相色谱可分为:液-固吸附色谱、液-液分配色谱、离子交换色谱和凝胶渗透色谱等几大类。
高效液相色谱的定性和定量分析，与气相色谱分析相似，在定性分析中采用保留值定性，或与其他定性能为强的仪器分析法联用，如与质谱法、红外吸收光谱法等联用。在定量分析中，采用测量峰面积的归一化法、内标法或外标法等，但高效液相色谱在分离复杂组分试样时，有些组分常不能出峰。因此归一化法定量受到限制，而内标法定量则被广泛使用。
一、实验目的
1.学习高效液相色谱柱效能的测定方法;
2.了解高效液相色谱仪基本结构和工作原理，以及初步掌握其操作技能。
二、基本原理
气相色谱中评价色谱柱柱效的方法及计算理论塔板数的公式，同祥适用于高效液相色谱:
tt22RRn,5.54(),16() YY1/2
速率理论及范弟姆特方程式对于研究影响高效液相色谱柱效的各种因素，同样具有指导意义:
H=A+B/u+Cu
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然而由于组分在液体中的扩散系数很小，纵向扩散项 (B/u)对色谱峰扩展的影响实际上可以忽略，而传质阻力项 (Cu)则成为影响柱效的主要因素，可见要提高液相色谱的柱效能，提高柱内填料装填的均匀性和减小粒度，以加快传质速率是非常重要的。目前所使用的固定相，通常为5,10μm的微粒,而装填技术的优劣亦将直接影响色谱柱的分离效能。
除上述影响柱效的一些因素外，对于液相色谱还应考虑到一些柱外展宽的因素，其中包括进样器的死体积和进样技术等所引致的柱前展宽，以及由柱后联接管、检测器流通池体积所引致的柱后展宽。
三、仪器
1.恒流泵或恒压泵 任一型号
2.紫外光度检测器或示差折光检测器 任一型号
3.高压六通进样阀
4.记录仪
5.微量进样器 25 μL
6.超声波发生器
四、试剂
1.苯、萘、联苯、甲醇、正己烷等均为分析纯
2.纯水 去离子水，再经一次蒸馏
3.标准溶液配制
-1(1)标准贮备液 配制含苯、萘、联苯各1000μg?mL的正己烷溶液,混匀备用。
-1(2)标准使用液 用上述贮备液配制含苯、萘、联苯各10μg?mL的正己烷溶液，混匀备用。
五、实验条件
1.色谱柱 长150mm，内径3mm,装填C-18烷基键合相，颗粒度10μm的固定相
-1-12.流动相 甲醇:水(83:17);流量0.5mL?min和1mL?min
3.紫外光度检测器 测试波长254nm, 灵敏度0.08
-14.记录仪 量程5mV，走纸速度480 mm?h
5.进样量 3μL
六、实验步骤
1.将配制好的流动相于超声波发生器上，脱气15min。
-12.根据实验条件 (流动相流量取0.5mL?min)，将仪器按照仪器的操作步骤调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡，记录仪基线平直时,即可进样。
3.吸取3μL标准使用液进样记录色谱图，重复进样两次。
-14.把流动相流量改为1mL?min,稳定后，吸取3μL标准使用液进样，记录色谱图,并重复进样两次。
七、数据及处理
.记录实验条件1
(1)色谱柱与固定相
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(2)流动相及其流量
(3)检测器及其灵敏度
(4)记录仪量程与纸速
(5)进样量
2.测量各色谱图中苯、萘、联苯等的保留时间及相应色谱峰的半峰宽，计算各Yt1/2R
对应理论塔板数n。已知组分的出峰顺序为苯、萘、联苯。
八、思考题
1.由本实验计算所得的各组分理论塔板数说明什么?
2.高效液相色谱采用5,10μm粒度的固定相有何优点，同时它又给实验带来什么问题，
如何克服?
3.紫外光度检测器是否适用于检测所有的有机化合物，为什么?
4.若实验获得的色谱峰太小，你应如何改善实验条件?
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