蛋白免疫印迹（Western Blot）

蛋白免疫印迹（Western Blot）蛋白免疫印迹（Western Blot） Western Blot Stacking Gel: Stock: 5 ml 10 ml 30 ml 100 ml 30% Acrylamide 0.5 ml 1.0 ml 3.0 ml 10.0 ml water 18.9 ml 63.0 ml 0.5M Tris, pH 6.8 7.5 ml 25.0ml 10% SDS 0.3 ml 1.0 ml 10% Ammo Pers 0.3 ml 1.0 ml Temed 0.03 ml 0.1 ml Resolvin...

蛋白免疫印迹（Western Blot） Western Blot Stacking Gel: Stock: 5 ml 10 ml 30 ml 100 ml 30% Acrylamide 0.5 ml 1.0 ml 3.0 ml 10.0 ml water 18.9 ml 63.0 ml 0.5M Tris, pH 6.8 7.5 ml 25.0ml 10% SDS 0.3 ml 1.0 ml 10% Ammo Pers 0.3 ml 1.0 ml Temed 0.03 ml 0.1 ml Resolving Gel: 12% Gel Stock: 5 ml 10 ml 30 % Acrylamide 2.0 ml 4.0 ml water 1.6 ml 3.3 ml 1.5M Tris, pH 8.8 1.3 ml 2.5 ml 10% SDS 0.05 ml 0.1 ml 10% AP 0.05 ml 0.1 ml Temed 0.005 ml 0.01 ml 10% Gel 5 ml 10 ml 30 % Acrylamide 1.7 ml 3.3 ml water 1.3 ml 4.0 ml 1.5M Tris, pH 8.8 1.9 ml 2.5 ml 10% SDS 0.05 ml 0.1 ml 10% AP 0.05 ml 0.1 ml Temed 0.005 ml 0.01 ml 样品溶液(SDS sample buffer) , 0.63 ml 1MTris-HCL, pH6.8 , 1.0ml glycerol , 0.5 ml Beta-mercaptoethanol , 1.75 ml 20% SDS , 6.12 ml H20 , (10 ml total) , add 0..25% bromophenol blue -store at -20 in aliquots 10x电泳液(Running Buffer) , 30 g Tris , 144 g glycine , 10 g SDS , Do not need to pH, should be about 8 , Up to 1 liter 1x转膜电泳液(Transfer Buffer) , 12g Tris , 57.6g glycine , 800ml MeOH , H20 up to 4 liters 膜洗涤液 , PBS含0.05%Tween-80 膜封闭液 , 膜洗涤液含3%BSA 考马斯染液(Coomassie Blue Stain Buffer) , 200ml acetic acid , 1800 ml H2O , 0.5g Coomassie blue G-250 , Mix 1 hr and fliter (No. 1 Whatman paper) (final = 0.025% Coomassie blue with 10% acetic acid) Store at room temp 程序 1. 制胶:按要求制备10%的SDS-PAGE胶分离胶制胶液加TEMD后尽快(1-2分钟内)将制胶液加入胶槽内，分离胶高约为3/4 胶高，胶面上加水封胶，以使分离胶，浓缩胶界面平整。分离胶凝固后去除水封，加入浓缩胶，放入胶孔梳。凝固后备用。 2. 样品准备:根据胶孔容量准备样品样品的蛋白含量及宽泛，小胶，可在1-20ug间变动，根据我们的目的，可以胶孔最大容积为限准备样品(疫苗);以3ug/孔，准备沙鼠肾蛋白抗原。样品中加入样品处理液的比例以1:1 为宜。100?，加热 3-5分钟。冰上冷却，离心。 3. 上样制备好的胶放入电泳槽中，二极加入电泳液，稳定电流，以20mA/小胶、30mA/大胶调整电流。注意:电泳的方向是正极的方向。 4. 转膜取出电泳完毕的胶，制备转膜夹:转膜夹正极、粗纤维层、厚滤纸、胶、硝酸纤维膜、厚滤纸、粗纤维层、转膜夹负极。稳定电压，100mV 1小时。 5. 包被膜，取出膜立即浸入含3% BSA，0.1% Tween 80的PBS(包被液)中，室温，摇晃孵化2小时。或4?，摇晃孵化过夜。 st Ab(05兔Ab)被1:1000稀释在包被液中，以10-20ml为宜，室温，摇晃孵化26. 1 小时。或4?，摇晃孵化过夜。 7. 用含0.1%Tween 80的PBS洗膜3次，10分钟/次。 8. 酶标2nd Ab按使用说明稀释在包被液中，放入洗好的膜，室温，摇晃孵化2小时。 9. 按7方式洗膜。 10. 显色:HRP底物按使用说明配制，浸入洗涤好的膜，室温孵化至显色，取出膜纸巾沾干膜上液体，塑料膜封存，照相存留。

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