活性氧
检测
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试剂盒
使用说明书
活性氧检测试剂盒操作步骤:
一、试剂准备:
1. dcfh-da可稀释于培养基或缓冲液中。血清或培养基颜色并不影响dcfh-da及细胞内荧光产生,但
可能会影响荧光显微镜观察,干扰荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪荧光测定。可将dcfh-da稀
释于无酚红培养基或适宜的缓冲液如pbs中。这依赖于使用何种荧光设备进行测定。
2. 加入dcfh-da的时机或孵育时间,以最终能顺利检测细胞内活性氧为目的。药物处理时间较短(<2
小时)或预计ros效应较弱,可先加或同时加入dcfh-da。反之,treat 刺激时间较长(>6 小时)或预计产生
ros效应较强,可后加dcfh-da。
3. 活性氧供体含高纯度12 mm h2o2。加入细胞后其本身即是一种活性氧,而且在代谢过程中可产生其
它类型的活性氧,均可使dcfh-da氧化为dcf呈现强绿色荧光。因而,用户可使用该试剂作为测试实验系
统或仪器的阳性试剂,以初步观察细胞活性氧所产生的荧光的一般特征,并且也可以将该实际作为实验的一
个阳性对照。推荐该试剂的细胞工作浓度为20~100 μm或更低浓度,但超过200μm将产生细胞毒。如果用
户熟悉ros荧光或实验没有必要采用阳性对照,可以不加该试剂。
二、加入荧光探针:
1. 加入dcfh-da于培养基,推荐初始工作浓度为10 μm。对不同的细胞和处理,dcfh-da工作浓度
可为100 nm~20 μm,需进行预实验确定合适的浓度。总体稀释倍数应在1:500~1000以上以避免dmso对细
胞的影响。以dmso作为溶剂对照。
2. 37 oc孵育细胞30min~至几个小时,通常30-60min 即可。孵育时间长短与细胞类型、刺激条件、
dcfh-da浓度有关。
3. pbs洗涤细胞2次。
三、活性氧检测试剂盒荧光检测
采用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜图像检测照相,绿色荧光强度代表活性氧水平。也可进行微板荧光
分析仪(multiwell fluorescence plate reader)实时或每10分钟分时逐点检测荧光强弱。对于流式细胞仪可将细胞
用胰酶消化pbs洗涤后重悬检测。
浙公网安备 33021202002483