光合细菌分离鉴定及其快速培养的研究

光合细菌分离鉴定及其快速培养的研究 摘要:对能净化养殖水的光合细菌进行了研究,分离得到菌株B3,鉴定该菌为沼泽红假单胞菌 (Rhodorse“domon。p以。tris)〕通过一系列的试验确定了菌株B3的最佳培养条件,实现菌 株B3的快速培养,为菌株B3进一步的应用提供了理论上的依据。 关键词:光合细菌;水产养殖;快速培养;研究 1引言 近年来我国水产养殖业的发展蒸蒸日上,但从 长远来看将会面临由人为和自然造成的池塘老化, 水质恶化,有机污染严重,致病微生物大量滋生,以 致形成大量病害的危险。这些病害会造成巨大的经 济损失L’一2〕,故改善水产养殖水域的水质状况已成为 养殖业生产发展的关键技术和研究热点。 光合细菌是一类能进行光合作用的有益细菌, 广泛分布于水田、坑塘、湖沼、江河、海洋、活性污泥 和土壤中[’l。光合细菌具有改善水质的能力,而且有 较高蛋白含量,并能促进水产品的生长繁殖,故在水 产养殖中具有广泛的应用前景。因此分离得到高效 净化水产养殖水质的光合细菌,对我国的水产养殖 有着重要的意义〔4了。 2材料和方法 2 , 1材料 2 . 1.1菌种来源 购得具有高效净化水产养殖的光合细菌菌液 (深红色菌液)。 2.1.2培养基 分离培养基:乙酸钠3.09,丙酸钠0.39,NaCI 0.59,NH;CI19,MgSO4?7HZO0.29,KZHPO4o?39, KH尹0;0.59,CaCI:0.059,MnCI:?4HZO0.0039, reso4?7HZo0.0059,酵母膏0.19,蛋白脉0.019, 谷氨酸0.2x10一,g,HZO1000mL,琼脂209,pH 7 . 2一7.4,121?温度下高压灭菌30min。 液体培养基:Mgso4?7HZo0.29,NH不119, NaZCO359,KZHpo40.59,NaCI0.59,蛋白陈1.59, H必1000mL,pH7.2,121?温度下高压灭菌30min。 碳源和电子供体:苯甲酸、柠檬酸钠、乳酸钠、乙 酸钠、丙酸钠、甘油、丙酮酸、苹果酸、甲醇、甘露醇、 硫代硫酸钠。 2.2实验方法 2.2.1缺氧条件的建立 在分离纯化细菌过程中,采用双层培养基法;在 将光合细菌转接到液体培养基过程中,则采用液体 培养基注人厌氧管且仅留15一3mL的空间的方法。 2 . 2 . 2光合细菌的分离纯化 取上述深红色菌液,采用双层培养基平板法进 行分离。通过观察,挑取红色单菌落,重复进行平板 划线分离,得菌株B3。 2.2.3菌落及菌体形态的观察 观察双层培养基中菌落形态;用荧光显微镜观 察(型号为OLYMPUSBX一50)菌体形态。 2.2.4革兰氏染色试验 试验方法详见《污染控制微生物学实验》图。 2.2.5B3菌体DNA的提取及其G十Cmol%的测定 B3菌体DNA的提取采用林万明的方法,G十C mol%的测定采用热变性温度法囚。 2.2.6碳源和电子供体利用试验 在每支厌氧管中分别加人各种碳源和电子供 体,然后接种B3进行光照培养,几天后观察其结果。 2.2.7细菌鉴定 参照上述试验结果,根据《伯杰细菌鉴定手册》籍缪儡毓黔进 (8版)[v]和《常见细菌系统鉴定手册》川进行鉴定表1菌株B3对碳源和电子供体的利用情 况 2 . 2.8菌株B3快速培养条件的确定 在不同的培养条件下,pH值、光照类型、光照时 间、NaCI浓度、酵母膏浓度,确定光合细菌最佳生长 条件。采用722型光栅分光光度计测定光合细菌的 OD值。 最大吸收波长的确定。以未接菌的液体培养基 为空白对照,选择不同的波长(660,666,670,674, 676,675,650,690nm)测定菌液的OD值。oD最大 值所对应的波长为该菌的最大吸收波长图。 光照类型对菌株B3生长情况的影响。采用白炽 灯、日光灯、自然光3种光照类型对菌株B3进行光 照培养,培养温度控制在(30士2)?(以下的试验均 控制在这个温度),pH值调节为7.2,然后测定菌株 B3在48,%,144h的OD值,观察其生长情况。 pH值对菌株B3生长情况的影响。调节液体培 养基的pH值,分别为6.9,7.2,7.5,7.8,8.1,在白炽 灯下光照,测定菌株B3的OD值,观察其生长情况。 光照时间对菌株B3生长情况的影响。接种菌体 后,分别在48,96,144,192,240h测定菌株B3的 OD值,观察其生长情况。 NaCI浓度对菌株B3生长情况的影响。配置分 别含0.1%,0.5%,1.0%,2.0%,3.0%,4.0%NaCI浓 度的液体培养基,对光合细菌进行适应盐浓度能力 试验,经光照培养4d后,测定OD值,观察菌体生 长‘清况[101。 酵母膏浓度对菌株生长情况的影响。在液体培 养基中加人酵母膏,使其质量分数分别为0.01%, 0 . 03%,0.05%,0.08%,0.10%,0.15%,0.20%, 0 . 25%,0.30%,0.35%。光照培养4d,测定On值, 观察菌体生长情况[l]。 3结果与讨论 3 , 1细菌鉴定 菌落:在分离培养基中菌株B3的菌落形态呈圆 形,红色,表面光滑、湿润且凸起状;在液体培养基中 菌株B3显深红色。菌体形态及染色:菌株B3菌体 细胞呈杆状,稍有弯曲,卵圆形,大小为0.7一0.9林m x1.3一2.4协m,且为革兰氏阴性菌。菌体中G十c 摩尔分数为65.6%。根据试验结果,查《伯杰细菌鉴 定手册》(8版)和《常见细菌系统鉴定手册》,菌株 B3鉴定为沼泽红假单胞菌扭人。己叩seu汉onzonas p‘ustris)。碳源和电子供体利用试验结果见表1。 3.2菌株B3快速培养条件的确定 3.2.1最大吸收波长的确定 试验结果表明,菌株B3在678nm处具有最大 碳源和电子供体 柠檬酸钠 乳酸钠 乙酸钠 丙酸钠 甘油 苯甲酸 丙酮酸 苹果酸 甲醇 甘露醇 硫代硫酸钠 菌株B3 . 2.2不同光照类型对菌株B3生长情况的影响 将菌株B3分别置于白炽灯、日光灯、自然光下 培养,菌株B3在3种光源下的生长情况,见图2。 结果表明,在白炽灯下培养的效果优于日光灯, 而在日光灯下培养的效果又优于自然光。 3.2.3pH值对菌株B3生长情况的影响 pH值对菌株B3的生长影响,见图3。 试验结果表明,菌株B3适合于在微碱性环境中 生长,且pH为7.2时生长最快。 3.2.4光照时间对菌株B3生长情况的影响 不同光照时间段的菌体B3的生长情况,见图4。回一一一一一一一一一一一一一一 试验结果表明,当pH值为7.2时,菌株B3经过 此后即使继续培养,其生长 96h培养后的菌量较大, 量无显著变化。 定菌株B3为沼泽红假单胞菌(Rhodop、。ndomonas palotri、)。 (2)白炽灯、日光灯和自然光3种光照类型均能 使菌株B3生长。利用白炽灯光照培养,经%h,菌株 B3的OD值为0.485;利用日光灯光照培养,经1科h, 菌株B3的OD值为0.262;利用自然光光照培养,经 144h,菌株B3的OD值为0.215。因此,在实验室中 培养菌株B3应采用白炽灯;在实际批量培养中采用 自然光进行光照较经济。 (3)结果表明,利用白炽灯进行光照,温度为 30?士2,pH值为7.2,培养时l司为96h,Naez浓度 为0.5%一2.0%,酵母膏浓度为0.2%时,可视为菌 株B3快速培养的最佳条件。 3.2.5NaCI浓度对菌株B3生长情况的影响 NaCI浓度对菌株B3生长的影响见表2。 表2NaCI浓度对菌株B3生长的影响 菌株代号n, U。l NaCI浓度/(%) 102.03.04.0 B3++++++++++++++ 注:“十十十”表示生长良好;‘十十”表示生长较好;“+”表示生长。 由表2可以看出,NaCI浓度为0.5%一2.0% 时,菌株B3生长良好,表明菌株B3具有一定的适 盐性。 3.2.6酵母膏浓度对菌株生长的影响 酵母膏浓底对菌株生长的影响见图5。 由图5可知酵母膏浓度为0.2%时,菌株B3繁 殖速度最快。适合于实验室中菌种的快速培养。 4结论 (l)从购得的光合细菌中分离得到菌株B3,根 据菌落及菌体形态特征、革兰氏染色、碳源和电子供 体利用情况和G+Cmol%为65.6%等试验结果,鉴 参考文献 仁1」张玲华,邝哲师,陈薇,等.高活性光合细菌沼泽红假单胞 菌培养特性初探「J」.华南师范大学学报(自然科学版). 20()l(4):37一39. 「2〕郭庆文,吉海平.紫色非硫光合细菌的研究「J].饲料工业, 1994,15(3):36一39. 「3〕刘如林.光合细菌及其应用「M〕.北京:中国农业科技出版 社,1991. 〔4」SawadaH.Photos邓。hetiebaet币ajnw,tetrealm即,厂J〕. 一316. FermentTeehnol,1997(55):311〔5」马放,任南琪,杨基先.污染控制微生物学实验仁M」.哈尔 滨:哈尔滨工业大学出版社,2002. 「61程光胜,朱厚础,周方.分析微生物专辑「M」.北京:科学出 版社,1988. 「7」R.E.布坎南,N.E.吉本斯.伯杰细菌鉴定手册「M]3版/l 中国科学院微生物研究所《伯杰细菌鉴定手册》编译组译. 北京:科学出版社,1984. 〔s]东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册LM].北京:科学 出版社,2001. 〔9」沈萍.微生物学实验汇M」.北京:高等教育出版社,2001. 〔10」徐姗楠,邱宏端,林娟,等.紫色非硫光合细菌的分离鉴 定及其功能研究「J」.福州大学学报:自然科学版,20以, 32(2):246一251.