脱氧核糖核酸序列分析在金银花品种鉴定中应用

脱氧核糖核酸序列分析在金银花品种鉴定中应用 脱氧核糖核酸序列分析在金银花品种鉴定 中应用 时珍国医国药鲫O1年第i2卷第2期LISHIZHENMEDIC】NEANDMATERIAMEDICARESE^RcH2001VOLl2NO2 脱氧核糖核酸序列分析在金银花品种鉴定中应用 于燕莉,石傻英 (山东中医药大学中药学院,山东济南250014) 摘要;目的:从分子水平上为金银花两品乐曲鉴别提供依据.方法:本文采用RAPD标记方法对备银花两品系的DNA指纹图 谱进行分折结果:脱氧核糖核酸序列分折可有效地用于金银花品种的分类与鉴剐. 关键词:RAPD;金银花}品种茔定 中图分类号:R282.5文献标识码:A文章编号.1008—0805(2001)02—0136—01 ApplicationofRAPDonVarietyIdentificationofLonicerajaponica YUYah一1I_SHIJun—ylng (ShandongUmizersityofTrad~iona[ChLneseMedt~the.lm2500I4.Chtna) Abstract:Objective:Toofferabasisofidentifyingthet%vovarietiesofLonicerajaponicaont heLevelofDNAmolecular.Methods: AnalysetheDNAfingerprintsoftwovaretiesofLonicera】aponicabyRAPD.Result~RAPDiseffectiveinclassifyinganddistin— guishingtheverieti~sofLonicerajaponica. KeywordsRAPD~Lonicerajaponica;Varietyidentification 金银花(忍冬)Lonicera】aponicaThunb.是山东的道地药 材].叉名"东银花"济银花,产量大,质量好,是国内药材市场上 的主流商品金银花具有清热解毒,凉散风热之功.常用于治疗痈 肿疔疮,喉痹,丹毒,热血毒痢,风热感冒,瘟病发热.山东金银花主 产于临沂地区平邑县,有大毛花与鸡爪花两种栽培品系,两者的药 材品质存在一定差异,但其药村性状,原植物形态十分近似,极难 鉴别.现代分子生物学研究发现.中药材的生物贷源一"物种"的多 样性是由于其基因组成多态性的结果,而基因多态性可在分子水 平上进行检测,他比在生物形态,组织和化学水平上检测更能代表 其变异类型的遗传标记,随机扩增的脱氧棱糖棱酸(DNA)多态性 (RAPD)技术,具有不需特异探针及已知目的基因序列,所需 DNA量少,简便有效等特点]本文采用RAPD标记方法对金银 花两品系的DNA指纹图谱进行分析,试图从DNA分子水平上为 两品系的中药材鉴别提供依据 1材料与方{去 1.1实验材料本实验选用山东蛄沂地区平邑县栽培金银花 Lonicera】aponJcaThunb.品系,从多年生群体中各随机选取l0株 大毛花金银花,鸡爪花金银花品系为试材原植物标车存山东中医 药大学中药学院标本园. 1.2仪器与试卉lPCR仪,PTC150型(购白美国);紫外透射 做,wD一}403型(北京六一仪器厂);引物,lO—rner(购自澳大利 亚);Taq酶,购白美国PE公司 L2祥品DNA的提取取各样品嫩叶50mg,置研钵中,加液氮 少许研磨成匀浆状,移人eppendorf管中,再加入100mL预热至 60?的cTAB提取缓冲液(2CTAB,1,4tool/LNaCl,0.2巯 基乙醇,2Ommo]./LEDTA,i00mmot/LTris,pH80)t于6O?保 温30rain.用等体积的氯仿/异戊醇(29:1)提取2次,9000r/rain 离心10rain,将水相移人新离心管中,加入213体积的冷异丙醇混 收稿日期:2000—09一Oll修订日期2000-122 作者筒介;于燕莉(1961一),士(扭袭),山东文登人,现任中国人民解被军湃 南军区忘医院主管药师.硕士学位.主要,】L事中药质量控制研克. 136 匀.于4000r/min离心6rain,弃击上清夜,用0.6mL洗缓冲液 (70乙醇.10mmol/L醋酸钠)悬浮,9000r/rain离心10rain,弃 击上清夜,沉淀置冰箱中玲冻干燥后,用50ITE液悬浮.加1/10 体积的醋酸钠溶液(pH5.2),95%乙醇沉淀DNA,1400r/rain离 心5rain.弃去上清夜,用70乙醇洗沉淀,净化台中自然干燥,用 超纯水溶解后,置一2O'(2冰箱中保存备用 1.3PCR反应条件与电泳分折扩增反应液总体积l5,其中吉 buffer(缓冲液)1.5uj,3mmol/LMgCIl5I,4种核苷酸 (dATP,dGTP,dTTP)各250/L随机引物l5ng,样品DNA50 mg,TapDNA聚合酶(PromegaInc.)lumlt.反应程序如下:第1 个循环在95C变性5rain,35?退火2rain,72_c延伸3rain;后44 个循环于94C10s,38C10s,12C50s,最后于72?保温5rain, 25_c退火5s.取扩增产物7,12在l×TBE缓冲液1琼脂糖 凝胶中上样,电泳3,4h,演化乙锭染色,紫外灯下观察和照像 1,3,5:太花盘银花{2,4.6_,j,花金银弛 引物1,2为OPj14}3t4为0PJ16I5.6为oPJ2O 圈i盘银花三十引物的扩增图谱 2结果与讨论 随机选了l~-merOpcronPrimer35个,对2个金银花品种的 DNA进行PCR扩增后,产生RAPD标记的随机引物及序列为: 0PJ14一CACCCGGATG;OPJ16一CTGCTTAGGG;OPJ20一 AAGCGGcCTC 使用35个随机引物进行扩增实验,结果有3个引物扩增出谱 几_』H目_删._二?_几_二日[I????几=二目目目U _l_l_l目目产?.. ,U [二二二】宜昌曰??二二]. LISHIZHRNMEDIC1NEANDMATERIAMEDICARESEARCH20c1VOL.12NO2时 珍国医国药2001年第坨卷第2期 带.参见引物扩增图.太花盘银花共扩增DNA谱带24条: OPJ140条,0PJ16--9条,OPJ2O6条i小花金银花共扩增 DNA谱带26条:0PJ14—8条.0PJ16--12条,OPJ20--6条.研究 结果表明.RAPD技术可有效地用于中药材的分类与鉴别. 在本实验中发现.RAPD分析中还存在着受样品DNA提取 方法,Mg浓度及反应液中其他组成的影响,还需进一步作详细 的影响因子分析实验,使其在中药品种鉴定中的应用更加广泛. DNA分子由G,A,C.T4种碱基构成,生物体特定的遗传信 息便包含在特定的碱基排列顺序中,不同的物种其遗传性不同,便 表现在4种碱基排列顺序的变化之中,这就是生物的遗传多样性 (geneticdty).由于DNA分子作为遗传信息的直接载体,不 受外界因索和生物体发育阶段及器官差异的影响,每一个体的任 一 细胞均含有相同的遗传信息因此.DNA分子遗传标记(DNA moleculargeneticmarker)进行物种鉴别更为准确可靠.本文采用 RAPD技术对金银花两个品系从分子水平上进行了遗传标记研 究.为金银花的种质资源描述,评价及鉴定提供了依据. 致谢:本研究得到山东大学夏光教教授,向凰宁副教授的指导 与帮助 参考文献 [1]李家实,贾敏如.万德光,等.中药鉴定学EM3.上海:上海科技出版 社.1998:355. E25WitliamsJGK,eta1.NuclAcidsRes1990.18:36531. C33周爱芬,棘春晖.向凤宁,等应用9StDNA间隔序列分析鉴定件细 胞杂种[J]生物工程.1999.15(4);520. 牛膝及其伪品比较鉴别 朱美莲,王患萍,桑雅清 (浙江省丽水市中心医院323000) 中药牛朦为苋科植物牛膝AchyranthesbidentataBI的干燥 根,具有补肝肾,强筋骨,逐癀通经,引血下行的功效用于治疗腰 朦酸痛,筋骨无力.经闭症瘕,肝龋眩晕等,为临床上的常用药.本 品始载于《神农本草经》,刊为上品.陶弘景谓:"今出近遭蔡州者, 最长大柔润其茎有节似牛晾,故以为名也.近年来.笔者在工作 中,常碰到同属植物的红牛膝,土牛膝,同科的麻牛膝,石竹科自牛 晾以及爵床科植物末膝马蓝的根作为牛膝用.觋将牛晾及出现较 多的伪品.从药材的性状.显微特征及理化性质方面进行比较鉴 别,供参考. 1性状鉴别 见表1. 2显微鉴别 各品种粉末中薄细胞中所含的草酸钙结晶形状的不同,可作 为鉴别的方法之一.见表2. 3理化鉴另叮 苋科植物含有皂甙及甾酮类化合物,可利用牛晾及伪品成分 中分子结构不同,对荧光反应.显色反应产生的颜色变化不同,而 帮助我们鉴别之鉴别方法1.取鉴别品的断面置紫外灯(365rim) 下观察,而后再加1氢氧化钠(牛膝)或加1的氢氧化铵(伪品) 鉴别方法2,取鉴别品粉末置自瓷板上.滴 后观察其色泽的变化. 加2滴冰醋酸及1,2滴浓硫酸,观察颜色反应.结果见表3. 寰1牛膝豆其伪品的性状整掰 收稿日期:2000—0807i修订日期:2000—10—08 续寰1 品名草酸钙砂晶草酸钙棱晶草酸钙方品 牛膝黄白色!鱼坚菠黄,绿色紫红色 红牛膝红棕色1~NH,OH探棕色棕褐色至裸棕色 麻膝案嚣曩蔷璺INNH,OH{;l自i 4讨论 牛膝虽然不是价格昂贵的中药品种,但不法分子为谋取个人 和益还是时有掺假,只要我们掌握正品的鉴别要点,综音各种鉴别 方法,就能杜绝假药,而保证临床用药安全有效. 137