没药挥发油抑制小鼠离体子宫平滑肌收缩及芳香化酶活性的效应及成分分析

没药挥发油抑制小鼠离体子宫平滑肌收缩及芳香化酶活性的效应及成分 分析 定性数据统计分析pdf销售业绩分析模板建筑结构震害分析销售进度分析表京东商城竞争战略分析 没药挥发油抑制小鼠离体子宫平滑肌收缩 及芳香化酶活性的效应及成分分析 南京中医药大学学报2008年3月第24卷第2期 IOURNALOFNANJINGTCMUNIVERSITYVol24.一109一 没药挥发油抑制小鼠离体子宫平滑肌收缩及芳香化 酶活性的效应及成分分析 宿树兰一,鲍邢杰一,段金廒,华永庆,唐于平,丁安伟 (南京中医药大学江苏省方剂研究重点实验室,江苏南京210046;江苏大学药学院,江苏镇江212013) 摘要:目的首次评价没药挥发油对小鼠离体子宫平滑肌收缩,芳香化酶的生物效应;并分析鉴定没药中的挥发性成分. 方法采用小鼠离体子宫收缩模型,芳香化酶抑制剂体外筛选模型评价没药挥发油的生物效应;采用GC—MS联用技术 对没药挥发性成分进行分离分析,鉴定.结果离体子宫平滑肌收缩试验表明没药挥发油对小鼠离体子宫平滑肌收缩 有显着的抑制作用,E为14.21t~g/mL,95%可信限为11.58t~g/mL,17.50~g/mL;芳香化酶抑制刑体外筛选实验表明没 药挥发油具有显着的抑制芳香化酶活性,I为8.70~g/mL;为探讨生物效应与成分间的关系,采用GC—MS联用技术分析 鉴定了没药挥发油中53个化学成分,占挥发油总量的60.16%,结构类型主要为萜类,倍半萜类等类型化合物.结论 没药挥发油具有显着抑制小鼠离体子宫平滑肌收缩,抑制芳香化酶的活性,效应成分可能与其中的倍半萜类成分密切相 关,其作用机制有待进一步深入研究. 关键词:没药;挥发性成分;GC—MS;子宫平滑肌收缩;芳香化酶抑制剂 中图号:R285.5文献标识码:A文章编号:1000—5005(2008)02—0109—05 没药为橄榄科植物没药树Commiphoramyrrha Eng1.及同属它种植物的树干皮部渗出的油胶树 脂.没药始载于宋《开宝本草》,为常用中药之一. 典j生平,味苦,具有行气活血,消肿止痛的功效. 临床上多用于治疗痈痛,损伤瘀血,经闭癞瘕,胸 腹诸痛等疾病.没药树生长在非洲索马里和埃塞 俄比亚的于旱地区及肯尼亚北部,没药除用作香 料外,也用于化妆品,食品和药品,美国FDA证明 没药用作芳香添加剂食用是安全的I.现代化学 研究表明没药中主要含有树胶(57%,65%),树 脂(25%,35%),挥发油(2.5%,9%),苦味素等 成分E2J.没药在各国民间医药中应用很多,有抗 炎,退热,祛痰,通经,健胃等作用,可作为收敛剂 和兴奋剂;现代药理研究表明没药具有抗菌消炎, 镇痛,抗肿瘤,降血脂,保护黏膜等多种生物活 性[,. 本课题组在研究四物汤及其衍化方治疗妇科 血瘀证不同证型痛经的过程中,发现用于寒凝血 瘀型痛经的代表方少腹逐瘀汤中组方药材之一没 药挥发油部位具有显着的生理活性,为了进一步 阐明其挥发性成分与效应之间的关系以及在方剂 配伍效应中的作用,本文选择与痛经相关的小鼠 离体子宫平滑肌收缩模型,芳香化酶抑制剂体外 筛选模型等效应指标对没药挥发油的生物效应进 行了评价研究,并采用GC.MS联用技术对没药挥 发性成分进行了分析鉴定,探讨其抑制小鼠离体 子宫平滑肌收缩,抑制芳香化酶活性的效应成分, 以期为阐明没药及方剂效应物质提供科学依据. 1实验材料 1.1仪器 Agilent6890N气质联用仪;检测器:5973N;自 动进样器:7683Series;NIST05质谱库(Agilent公 司);PowerLab/8s多道生理 记录 混凝土 养护记录下载土方回填监理旁站记录免费下载集备记录下载集备记录下载集备记录下载 仪,Chart4.2数据 分析软件(澳大利亚ADInstruments公司);挥发油 提取器(购于上海化玻试剂公司);多功能液闪计 数仪(BeckmanCoulterLS6500);超速离心机(美国 贝克曼库尔特有限公司);TGL16MWD高速低温离 心机(湘仪贝克仪器仪表有限公司);一86cC超低 收稿日期:2008—01—03;修稿日期:2008—01—25 基金项目:江苏省高校自然科学重大基础研究项目(06KJA36022),江苏省”青蓝 工程”科技创新团队建设资助项目(2006年度) 作者简介:宿树兰(1974一),女,河北晋州人,南京中医药大学2005级博士研究生.* 通讯作者:025—85811116 一 llO一 温冰箱(美国NBS公司);Triathler放射性同位素 检测仪(深圳市朗诚实业有限公司). 1.2药品与试剂 没药购于南京市药材公司(产地:海南),经南 京中医药大学段金廒教授鉴定为橄榄科植物没药 树CommiphoramyrrhaEng1.及同属它种植物的树 干皮部渗出的油胶树脂,符合《中华人民共和国药 典>>2005版没药项下规定. 乙酸乙酯(中国医药集团上海化学试剂公司, 批号:CY030618);无水硫酸钠(上海久亿化学试剂 有限公司,批号:20060801);苯甲酸雌二醇(上海 第九制药厂,2mg/mL?支,批号:000601);缩宫素 (南京生物化学制药厂,10u/mL?支,批号: 000103);ke’s液(NaCl9.2g,KCl0.42g,EaCh 0.24g,N~C030.15g,Glucose1.0g溶解于1000 mL重蒸水中). 1.3实验动物 实验用昆明种清洁级雌性未孕小鼠,体质量 18,22g,由南京中医药大学实验动物中心(SPF 级)提供(许可证号SCXK(苏)2002.0031). 2实验方法 2.1样品制备 称取没药100g,经粉碎至粒径40目,加l0 倍量蒸馏水浸泡5h,采用水蒸气蒸馏法(《中华人 民共和国药典))20o5版一部附录XD)提取挥发 油,无水硫酸钠干燥,得率为1.14%(v/w),4cI=保 存,备用. 2.2小鼠离体子宫收缩试验_8j 取未孕雌性小鼠,体质量18,22g,实验前3 天给予雌激素增敏.用颈椎脱臼法迅速处死小 鼠,剖腹取出子宫立即置于盛有Locke’s溶液的 玻璃平皿中,轻柔剥离附着于子宫壁上的结缔组 织和脂肪组织,将一侧子宫角的两端分别用线结 扎,一端置于盛有Locke’s溶液的浴槽内,另一端 与肌张力换能器相连.恒温水浴保持浴槽内温度 为(37?0.1)oC,持续供氧,通过调节螺母加1g的 负荷,平衡40min,待子宫收缩稳定,自发节律恢 复后开始进行实验.预先纪录5,10min正常收 缩曲线,而后快速加入缩宫素注射液10mL,总浓 度为5?lL,作用15min后再加入受试药物,观 察药物对缩宫素引起子宫痉挛性收缩的抑制作 用,采用t检验方法统计给药前及给药后子宫收 缩频率及收缩幅度,计算抑制子宫收缩的百分率 塑主医药堂学报2008年3月第2,4卷第2 (%).计算公式: 11t%=×100%. 2.3芳香化酶抑制剂体外筛选实验 2.3.1胎盘微粒体的制备[,0] 操作均在0,4cI=下进行,胎盘得到后立刻放 在冰上,除去绒毛膜和大血管,用0.O1mol/LPBS (内含1%KC1)清洗后剪碎,用0.01mol/LPBS (内含0.24moL/L蔗糖和0.5/xmol/L雄烯二酮) 进行匀浆.离心300r/min,60min.弃沉淀,上清 液离心3500r/min,60min以沉淀线粒体成分. 上清液再离心43000r/min,60min即可得到微粒 体部分.沉淀采用0.01moL/LPBS(内含0.1 mmol/LEDTA,0.5~moL/L雄烯二酮)重悬浮,悬 浮的蛋白以0.O1moL/LPBS为溶剂的0.1%NP- 40溶解至蛋白终浓度为2,3L.蛋白浓度测 定采用Bradford法【113. 2.3.2酶反应体系的建立【,10] 反应底物[口I3H]雄烯二酮预先保存在无水乙 醇中,反应时用0.067moL/LPBS稀释,乙醇的终 浓度小于1%.反应以0.O67mol/LPBS为缓冲液 (20%丙三醇,0.5mmol/Ldo山iothreitol及0.25 mol/L蔗糖),制备0.1g/L的胎盘微粒体制备液. 225ttL的反应体系包括胎盘微粒体制备液2.5 ttg,[口-3H]雄烯二酮(50nmol/L),黄体酮(10tmaol/ L)以及0.1%的牛血清白蛋白磷酸钾溶液(67 mmol/L,pH7.4).反应体系连同样品溶液置于 DMSO或水中,并被导人有96孔板,室温下孵育 10min,然后再向反应体系中加入25ttLNADPH (3mmol/L),于37cI=下孵育15min,然后加入5O 20%的三氯乙酸终止反应.将250ttL溶液转 移到含有charcoa1.dextranpellet的孔,溶液混合均 匀后离心350r/min,5min,弃去未反应的基质,取 含有[.H]H20的上清液测定.H的放射能. 2.4GC.MS分析 色谱条件:石英毛细管柱(DB.1701,0.251TlIn ×30111×0.25);载气:N2(高纯氮,含量? 99.999%);程序升温:初始温度90cI=,保持1min 后,以2cI=/min的速率升温至175oC保持5min, 以1oC/min的速率升至180cI=,保持2min,再以 8~C/min的速率升至210~C,保持10min.分流比 100:1;进样口温度:200~C;检测器温度:250~C. 质谱条件:离子源温度:200oC;电离电压: 宿树兰,等:没药挥发油抑制小鼠离体子宫平滑肌差蚕鳗适丝盛箜 70eV;扫描质量范围:35,400amu;扫描方式:El 源;扫描间隔:0.1S. 3结果 3.1小鼠离体子宫平滑肌收缩试验结果 小鼠离体子宫平滑肌收缩实验表明,没药挥 发油具有显着的抑制子宫收缩活性,并呈现良好 的剂量依赖关系,其ED5o为14.21t~g/nrL,95%可 信限为11.58t~g/mL,17.50t~g/mL.结果见表1. 3.2芳香化酶抑制剂体外筛选实验结果 芳香化酶抑制剂体外筛选实验结果表明,没 药挥发油具有明显的抑制芳香化酶活性,其IC5o 为8.70g/mL,呈现出一定的剂量依赖趋势.结 果见表2. 3.3GC.MS分析结果 按2.4项下GC.MS分析条件对挥发油进行 分析检测,得到总离子流图(见插页?图1),总离 子流图中的各色谱峰经NIST05 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 谱库的检索, 并参照标准图谱鉴定其化学结构,结果鉴定出53 种成分,占挥发油总量的60.16%,结果见表3. 其中相对含量较高的化合物包括长叶烯 (8.77%),吉玛烯D(7.33%),艿一榄香烯 (5.96%),l3一榄香烯(3.41%),咕巴烯(3.26%), 』3一波旁烯(2.89%),石竹烯(2.41%),fj一杜松烯 (2.15%),Phenol,2一(1,2一dimethyl一2-cyclopen— ten.1ym)一,acetate(2.10%),d一古芸烯 (1.93%),7一依兰油烯(1.75%),吉玛烯B (1.51%),一古芸烯(1.34%),榄香醇(1.33%) 等14个主要化合物,占挥发油总量的46.14%. 4讨论 首次评价了没药挥发油抑制催产素诱导的小 鼠离体子宫平滑肌收缩的生物效应,结果表明没 药挥发油具显着的缓解子宫平滑肌收缩的活性; 芳香化酶抑制剂体外筛选实验结果表明没药挥发 油具有显着的抑制芳香化酶活性的作用;现代医 学认为痛经与黄体期雌激素分泌增高而孕激素相 对不足相关.芳香化酶是雌激素合成的限速酶, 该酶活性的高低等因素与痛经的病理生理过程密 切相关,芳香化酶抑制剂能够降低雌激素水平,平 衡调节内分泌激素水平.因此提示没药挥发油可 能通过调节内分泌雌激素水平而实现其生物效 应,其分子机制及作用靶点尚待深入研究. 为探讨生物效应与挥发性成分问的关系,本 文采用GCMS方法进行了成分分析,结果表明: 没药挥发油中主要成分为单萜和倍半萜类化合 物,其中含量较高的主要有fj一榄香烯,咕巴烯,』3 一 波旁烯,l3一榄香烯,石竹烯,长叶烯,石竹烯,7 一 依兰油烯,吉玛烯D,a一古芸烯,7一古芸烯,艿 一 杜松烯,吉玛烯B,榄香醇等,同时本实验还首 次分析检测到茴香脑,旱麦瓶草烯,莎草烯,莪术 烯,瓦伦烯等成分.对相对含量较高的组成分进 行相关活性检索表明l3一榄香烯,石竹烯分别具 表l没药挥发油抑制小鼠离体子宫收缩的实验结果 表2没药挥发油抑制芳香化酶活性实验结果 南京中医药大学学报2O08丝鲞筮 表3没药挥发性成分GC.MS分析结果 :没药挥发油抑制/J鼠蜜堡王宣垩堡羞垂酸适壁堑箜至 兰,等 有抑制血栓形成和抗炎的相关活性l11,12].该研 究为阐明没药用于治疗痛经及腹部诸痛的生物效 应与挥发性成分间的关系提供了依据. (致谢:本文中芳香化酶抑制剂筛选试验得到 了上海医药工业研究院中药室李永辉博士的大力 支持和帮助.) 参考文献: [1]MassoudA.Preliminarystud),oftherapeuticefficacyofanew fasciolicidaldrugderivedfromCommiphoramolmol(myrrh)[J]. AmJTmpMedHyp,2001,65(2):96. [2]南京中医药大学.中药大辞典[M].上海:上海科技 出版社,2006.1635. [3]万文珠,娄红祥.没药的化学成分和药理作用[J].国 外医药一植物药分册,2005,20(6):236. [4]宋凡波,朱元元,张京玲,等.没药的研究进展[J].中 草药,2006,37(11):附1. [5]TiptonDA,LyleB,BabichH,eta1.In~trocytotoxicand anti—inflammatoryeffectsofmyrrhoilonhumangingivalfibrob— lastsandepithelialcells[J].ToxicologyinVitro.2003,(17): 301 『6]AsifSaeedM,SabirAW.Irritantpotentialofsomecon— stituentsfromoleogum-resinofCommiphoramyrrhalJJ.Fitoter— apia,2004,75:81. 『7TiptonDA,HammanNR,DabbousMK.Effectofmyrrhoil onIL-1stimulationofNFBactivationandPGE2productionin humanginglvalWbmblastsandepithelialcellslJj.Toxicologyin Vitro,2006,20:248—255. [8]徐叔云.药理实验方法学[M].北京:人民卫生出版 社,1991.1467. 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I12lElizabethS,GiselleF,RodrigoM,eta1.Anti.inflamsrmto. ryeffectsofcompoundsalpha—humuleneand(a)一trarts- caryophylleneisolatedfromtheessentialoilofCordiaverbenaeea [J].EuropeanJomlaalofPharmacology,2007,569(3):228. :李伟东) (编辑 EvaluationonEffe~ofVolatileOilofMyrrhainInhibitingMiceInVitroContractionofUterineSmoothMuscleandAromatiz- ingEnzymeActivityandAnalysisonComposition SUShu-lan.一,BAOXing-jie. 一,DUANJin-ao,HUAYong-qing,TANGru-~ing,DINGAn-wei (KeyLaboratoryforPrescriptionResearchofJiangsu,NanjingUniversityofChineseMedicine,Nanjing,fiangsu,210046,Chi— l’ba;PhamuwologyofJiangsuUniversity,ahenfiang,Jiangsu,212013,China) ABSTRACT:OBJECTIVETocarryoutaninitialevaluationontheeffectofvolatileoilofmyrrhaininhibitingmiceinvitrocontrac. tionofuterinesmoothmuscleandaromatizingenzymeactivityandonthecontentofvolatileoilinmyrrha.?啊【ODMiceinvitrou. terinecontractionmodelsandmodelsmadewitharomatizingenzymeinhibitorwereusedtoevaluatethebiologicaleffectof山evolatileoil ofmyrrha:GC.MStechniquewasusedtocarryoutanalysisandidentificationon山 evolatilecomponentsofmyrrha.RESULrrItwas foundthatthevolatileoilofmyrrhahadmarkedinhibitingeffectontheuterinesmoothmuscle,withED5oat14.21tc,/mLand95% confidenceintervalatl1.58, 17.50t’g/mL;thevolatileoilofmyrrhahadmarkedinhibitingeffectonaromatizingenzymeactivity.with msoat8.70tc,/mL.Fifty—threechemicalcomponentsofthevolatileoilofmyrrhawereidentified.accountingf0r60.16%ofthetotal volatileoil.whichshowedthatthemaincontentsincludedterpenoids.sesquiterpenoidsandsimilarcompounds.C0NCLUSIONThe volatileoilofmyrrhahasmarkedeffectininhibitingthecontractionofmiceinvitrouterineSITIoo山muscleandtheactivityofaromatizing enz-flne.themechanismofwhichisprobablycloselyrelatedtotheterpenoidsandsesquiterpenoidsitcontains.andfurtherstudiesfor山e mechanismisnecessary. KEYW0RDS:myrrha;volatilecomponents;GC—MS;uterinesmoothmusclecontractio n;aromatizingenzymeinhibitor ? 征订? 《南京中医药大学学报》南京中医药大学主办,全闰有重要影响的中医药学术刊 物,本刊为中国科技 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 统计源期 刊,中国科技核心期刊,中国高校优秀科技期刊,江苏省优秀期刊,华东地区优秀 期刊.设有学术探讨,临床研究,经验交 流,方药研究,针灸推拿,医史文献等专栏,刊登中医,中药,针灸,中西医结合等方面 的学术论文及有关情报资料.读者 对象为临床各科中医师,中医药高等院校,科研单位的教学与科研人员.每期68页,定价5.00元,全年定价30.(x】元,逢 单月10日出版.国际标准刊号ISSN1000—5005,国内统一刊号CN32—1247/R.南京市邮局发行,邮发代号28—232,也可 向编辑部直接购买.地址:南京仙林大学城仙林大道138号南京中医药大学42号信箱;邮编:210046;电话:(025) 85811934:E—mail:xb@njutcm.edu.cn.