中药对大肠埃希菌抗生素耐药性逆转作用(word原稿可复制可编辑)

中药对大肠埃希菌抗生素耐药性逆转作用(word原稿可复制可编辑) 如果您需要更多资料可以到www.docin.com/week114进行免费查阅。 中药对大肠埃希菌抗生素耐药性逆转作用 1 的实验研究 12贾云鹏 ，程宁 1 兰州大学基础医学院，兰州(730000) 2 兰州大学生殖健康与出生缺陷研究中心，兰州(730000) E-mail:chengn@lzu.edu.cn摘 要:目的:探讨三黄汤、黄莲解毒汤和五味消毒饮三种汤剂对 ESBLs 阳性 E.coli 恢复 对抗生素敏感性的可能性及逆转机制。 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 :用纸片扩散法和双纸片协同法筛选产 ESBLs 的 E.coli，用试管二倍稀释法确定三种中药方剂的 MIC，选取低于 MIC 的不同浓度在规定 时间下培养耐药 E.coli，测定各中药不同浓度的逆转效果和最佳逆转浓度。提取 ESBLs 并测 定酶活性和含量。结果:三黄汤在 0.2g/ml24h，黄莲解毒汤在 0.1g/ml24h，五味消毒饮在0.3g/ml24h 的逆转效果最佳，但与克拉维酸(30µg/ml)比较有显著性差异(p<0.05)。 结论:中 药能够通过抑制 ESBLs 的活性和减少产量达到逆转细菌耐药性，其作用与中药浓度有关。 关键词:中药，E.coli，ESBLs，耐药性逆转 中图分类号:R285;R378.2 文献标示码:A 由于抗生素的广泛使用导致细菌产生了广泛而严重的耐药性, 部分或全部恢复其对抗 [1]生素的敏感性成为当今人们关注的焦点和热点，其中探索中草药对耐药性的逆转作用成为 一种新的途径。本文探讨了三黄汤等三种清热解毒方剂对耐药性大肠埃希菌的逆转效果及其 机制，为研究中草药逆转由 ESBLs 导致的耐药性作用提供实验依据。 1(材料与方法 1.1 菌株 实验菌株收集兰州市某省级医院临床标本中的可疑产 ESBLs 大肠埃希菌，根据美国临 室标准化委员会(CLSI)推荐的抗微生物药物敏感性试验操作方法和判断标准，筛 床实验 [2]选出 ESBLs 阳性的大肠埃希菌 70 株作为实验菌株 。 1.2 中药最低抑菌浓度测定 制备三黄汤、黄莲解毒汤及五味消毒饮水煎剂，使三种复方汤剂的终浓度均为 1.0g/ml。 [3]采用试管二倍稀释法，测定三种中药方剂的最低抑菌浓度(MIC)。 1.3 逆转耐药大肠埃希菌的效果测定 分别将三种中药水煎剂配制成低于最低抑菌浓度的药液共五个梯度浓度，挑取耐药性大 肠埃希菌于各药液中，分别培养18--24小时后，再转移至营养琼脂平板内，继续培养18—24 小时后挑取菌落制成菌悬液，用无菌棉签沾取菌悬液涂布于M-H固体平板培养基做药敏实 [4]验，抗生素药片选用头孢噻肟(CTX)和头孢他定(CAZ)。采用改良Kirby-Baller法，按 美国国立临床实验室标准化委员会(CLSI) 2007年版的规定标准判读结果。 1.4 中药逆转耐药菌的最佳培养浓度 选用低于MIC浓度培养细菌,分别以0.1 g/ml，0.2 g/ml，0.3 g/ml，0.4 g/ml，0.5 g/ ml 三 1本课题得到甘肃省自然科学基金(ZS031-A25-060-E)的资助。 如果您需要更多资料可以到www.docin.com/week114进行免费查阅。 如果您需要更多资料可以到www.docin.com/week114进行免费查阅。 黄汤、黄莲解毒汤及五味消毒饮培养实验菌株24小时，做药敏实验并记录各抑菌圈直径，用统计软件SPSS11.5方差分析方法处理数据，筛选出不同中药逆转试验菌ESBLs的最佳浓度。 1.5 超广谱 β-内酰胺酶活性测定 在 37?每孔含有 210µL 反应液的 96 孔板中进行，反应液含有 0.01M PBS 60µL、100µg/ml 的 CAZ 溶液 60µL、ESBLs 提取液 30µL 和 0.3% H2SO460µL。酶活性单位:在37 ?，pH 7.0 时每 ml 酶液内每 mg 活性蛋白质每 min 内水解底物的 mg 数。 酶活(u)=OD,0.03×3。? 1.6 超广谱 β-内酰胺酶含量测定 采用 Bradford 法测定菌体内蛋白质总含量。根据最佳底物与酶蛋白结合率最高的原理， 测定 ESBLs 的含量。操作按 Bradford 蛋白质定量检测试剂盒说明书严格操作。ESBLs 提取 采用超声破碎法结合反复冻融法，ESBLs 粗提液，保存于-20冰箱备用。 ? 1.7 资料处理 应用统计软件SPSS11.5对有关数据进行统计处理，选用方法为方差分析。 2. 结果 2.1 最低抑菌浓度测定结果 测定三种中药方剂对大肠埃希菌 ATCC25922 最低抑菌浓度(MIC)分别为:三黄汤 0.5g/ml，黄连解毒汤 0.6g/ml，五味消毒饮 0.7g/ml。克拉维酸使产 ESBLs 大肠埃希菌恢复 其对抗生素敏感性的最低浓度为 30µg/ml。 2.2 中药逆转耐药菌的最佳培养浓度与效果测定 见表,。 表 1 三种中药方剂逆转耐药性的最佳浓度及逆转率 药液 最佳浓度(g/ml) 逆转前药敏直径(mm) 逆转后药敏直径(mm) 逆转率 三黄汤0.2 16 24.9 55.6% 0.1 16 24.4 52.5% 黄连解毒汤 0.3 16 24.6 53.75% 五味消毒饮 2.3 逆转作用前后药敏直径曲线图，见图 1。 逆转前后药敏直径图 40 301,逆转前药敏直 径 20 2,中药培养后药 10 敏直径 3,克拉维酸培养 0药敏直径(mm)后药敏直径 1 2 3 5 4 培养次数 图 1 逆转前后药敏直径曲线图 如果您需要更多资料可以到www.docin.com/week114进行免费查阅。 如果您需要更多资料可以到www.docin.com/week114进行免费查阅。 曲线 1，2，3 分别为逆转前、中药逆转后及克拉维酸培养后的药敏直径，如图所示，经中药培养后的药敏直径大于逆转前的药敏直径，但是，恢复抗生素敏感性的效应仍不及克拉 维酸。 2.4 逆转作用下酶活性测定及比较 OD-时间变化曲线，以 3 分钟为测定时间，根据酶活性单位公式可计算 根据实验得出? 出所提的酶粗提液的酶活。见表 2，中药方剂能够抑制酶活性从而降低耐药性，与克拉维酸 阳性对照逆转效果的比较未有显著性差异(p>0.05，t=3)，与未经任何实验因素作用的产 ESBLs 大肠埃希菌阴性对照比较有显著性差异(p<0.05，t=11)。中药方剂之间抑制酶活效果 比较未见显著差异(p>0.05,t=0.722)。 Normal P-P Plot of Regression Standardi Dependent Variable: OD 1.00 .75 .50 Prob .25Cum 0.00 Expected 0.00.25.50.751.00 Observed Cum Prob 图 2 蛋白标准曲线 表 2 各方剂最佳浓度逆转作用下酶活性测定及比较 实验因素酶活?OD(A235nm) 0.0345 0.150 三黄汤 0.0255 0.230 黄连解毒汤 0.0145 0.667 五味消毒饮 0.0005 0.003 克拉维酸, 0.0615 0.680 产ESBLs大肠杆菌,, (, p>0.05,t=3;,,p<0.05,t=11) 2.5 逆转作用下酶含量及比较 以蛋白标准品为横坐标，A595nm下OD值为纵坐标得标准曲线(见图2)及回归方程 YOD=1.059+0.463X并计算样品中ESBLs含量。中药方剂能够抑制ESBLs的表达，但不及克 拉维酸的抑制效果(p<0.05 )，见表3。与未经任何实验因素作用的产ESBLs大肠埃希菌阴性 对照比较有显著性差异(p<0.05)。 如果您需要更多资料可以到www.docin.com/week114进行免费查阅。 如果您需要更多资料可以到www.docin.com/week114进行免费查阅。 表 3 各方剂最佳浓度逆转作用下酶含量测定及比较 实验因素 OD(A595nm) 酶含量(µg/µL) 三黄汤 1.526 0.0553 黄连 解毒汤 1.417 0.0630 五味 消毒饮 1.475 0.0594 克拉 维酸, 1.324 0.0487 产 ESBLs大肠杆菌,, 1.614 0.0692 ( ,p<0.05,t=4.721; ,,p<0.05,t=-4) 3. 讨论 降低E.coli耐药性使其部分或全部恢复对抗生素的敏感性，对于临床治疗细菌感染具有 重要意义。E.coli对β-内酰胺类抗生素耐药机理主要是产生ESBLs，使抗生素失活，因此寻找 既安全又有效的ESBLs抑制剂成为降低耐药性的主要措施。我国中草药资源丰富、价格低廉， 并具有抗菌及免疫调节等作用，在治疗细菌感染方面的最大优势是不易产生耐药性且对人体 的毒性很低或无毒。因此开发中草药资源作为细菌耐药性抑制剂具有广阔的应用前景。目前 已明确的ESBLs化学抑制剂主要是克拉维酸、舒巴坦、他唑巴坦。石芽茶，大蒜，大黄，谷 [5]精籽，黄柏，黄芩等也有抑制ESBLs的作用，但研究较少。 本实验选取三种清热解毒方剂三黄汤、黄连解毒汤、五味消毒饮，研究其是否降低耐药 性及可能的逆转机制。结果表明此三种方剂对耐药性E.coli有不同程度的逆转，其效果与药 液浓度有关。为了避免混淆中药液的抑菌作用和杀菌作用，选取低于最低抑菌浓度的药液培 养细菌，以便单纯考察中药对细菌的逆转机制。产ESBLs的E.coli经各方剂培养后，其耐药性有显著降低，但是其降低效果仍不及克拉维酸。说明中药方剂在排除最低抑菌浓度的情况 下，确实有逆转耐药性的作用。 E.coli 对 β-内酰胺类抗生素产生耐药性的主要机理之一是产生 ESBLs，使 β-内酰胺类抗 生素失活。用纸片扩散法及双纸片协同法筛选产 ESBLs 的 E.coli 作为实验菌株，结合超声 波破碎法及反复冻融法提取 ESBLs，同时，CAZ 纸片的三维试验效果优于 CTX，说明 ESBLs 的最佳底物是 CAZ。根据酶活性测定实验，中药方剂能够抑制 ESBLs 的活性，与克拉维酸 比较未有显著性差异(p>0.05)，与未经任何逆转作用的实验菌株比较有显著性差异(p<0.05)， 表明中药方剂在抑制酶活性的效果方面不及克拉维酸，但仍能够作为 ESBLs 良好的抑制剂。 根据酶含量测定实验，中药方剂能够抑制 ESBLs 的表达，但效果却不及克拉维酸(p<0.05)， 而与未经任何实验因素作用的产 ESBLs 的 E.coli 比较却有显著性差异(p<0.05)，说明此三种 中药方剂能够抑制 ESBLs 的表达，虽然效果并不理想，与克拉维酸的抑制作用有显著差异， 不是抑制 ESBLs 的良好抑制剂，但是抑制酶表达仍显著高于阴性对照。说明在抑制 ESBLs 表达方面作用显著。 中药方剂能够逆转细菌耐药性的效果是明确的，但除了抑制 ESBLs 的活性和表达以外， 是否还存在其它逆转机制如消除质粒或增加外膜通透性以及提纯药物从而观察是否增强抑 酶作用等有待于进一步研究。 致谢: 标准菌株 ATCC25922 及 ATCC700603 由甘肃省临床检验中心魏莲花主任惠赠，在此致 谢。 如果您需要更多资料可以到www.docin.com/week114进行免费查阅。 如果您需要更多资料可以到www.docin.com/week114进行免费查阅。 参考文献 [1] Emine Kucukates. Antimicrobial resistance among Gram-negative bacteria isolated from intensive care units in a Cardiology Institute in Istanbul，Turkey. Jpn J Infect Dis. 2005 Aug; 58(4): 228-231. [2] National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing [S]. 11th information supplment. MAand MA. PA: Wayne ,2001 :46. 227 725 rrent inoculation methods in MIC determination(Aquaculture，2001, 196:[3] Panos Christofilogiannis(Cu 297-302 [4] E.B.Chaibi, D.Sirot, G. Paul. et al. Inhibitor-resistant TEM beta-lactamases: phenotypic, genetic and 447-458 biochemical characteristics. J Antimicrob Chemother. 1999, 43(4): [5] 杨建江, 韩文瑜, 杜锐等. 30 种中草药对耐药性猪链球菌的抑菌试验. 中兽医医药杂志. 2004, 2: 14-16 The experiment of Traditional Chinese Medicine on E.coli drug resistance 12Jia Yunpeng, Cheng Ning 1 Preclinical Medical College of Lanzhou University,Gansu Province Key Laboratory of Preclinical, Lanzhou (730000) 2 Study for New Traditional Chinese Medicine, Lanzhou (730000) Abstract Objective:To study the reversal effect of three kinds of Traditional Chinese ,edicine (San Huang Tang，Coptidis Decoction for Detoxification and Wu Wei Xiao Du Yin) to bacterial drug resistance of E.coli which generates extended-spectrum-lactamases (ESBLs)and approach the optimal drug concentration of these Traditional Chinese ,edicine that form the best reversal effect Method:E.coli which generates ESBLs was screened by disk diffusion method and double-disk diffusion test. Minimum Inhibiory Concentration was determined by tube double dilution method. E.coli was cultured in under MIC and the reversal effect was compared in different culture concentration under MIC. Results:The optimal reversal effect was San Huang Tang at 0.2g/ml in 24h, Coptidis Decoction for Detoxification at 0.1g/ml in 24h, Wu Wei Xiao Du Yin at 0.3g/ml in 24h. Conclusion:Traditional Chinese Medicine had the reversal effect to bacterial drug resistance which was relative with the concentration of Traditional Chinese Medicine . Keywords: Traditional Chinese Medicine, E.coli, Extended Spectrum Lactamases (ESBLs), Reversal of Drug Resistance 作者简介: 贾云鹏(1976-)，男，在读硕士，专业:分子病原学。研究方向:细菌耐药性的逆转机制; 程宁(通讯作者)，研究员，兰州大学生殖健康与出生缺陷研究中心，兰州大学甘肃省新药临 床前研究重点实验室。 如果您需要更多资料可以到www.docin.com/week114进行免费查阅。