【doc】噬菌蛭弧菌预防对虾弧菌感染的应用研究

【doc】噬菌蛭弧菌预防对虾弧菌感染的应用研究 噬菌蛭弧菌预防对虾弧菌感染的应用研究 第3O卷 20O9 第1期 年2月 渔业科学进展 PROGRESSINFISHERYSCIENCES Vol_30,No.1 Feb.,2009 噬茵蛭弧菌预防对虾弧菌感染的应用研究 张吕平胡超群罗 (中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室中 鹏沈琪 国科学院南海海洋研究所,广州5103O1) 摘要采用16SrDNA特异引物对63F和842R对蛭弧菌 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 菌株BZ6r扬frD,^ 109一J和实验菌株Bd一9913进行了PCR鉴定,使用Bd一9913菌株分别对3株虾类病原菌溶藻弧茵 6onzg0Zs,c"sLSO1,HFO9,副溶血弧菌,/r.口rn?Pm0Zfc"sV28以及1株大肠埃希氏茵 EfPf^f0zCH一42进行裂解.结果表明,10PFU/ml的B4—9913对于10.CFU/ml的宿主菌具 有较好的裂解效果.采用3.O×10PFu/mlBd1O9一J和Bd一9913分别与饲料混合(/叫)后投喂3.0g 左右的凡纳滨对虾幼虾,14d内未发现对虾异常,且在对虾肠道内检测不到Bd1O9一J及Bd-9913,证 明二者对于凡纳滨对虾幼虾是安全的.对正常养殖了50d的室外集约化虾池水体分别泼洒终浓度 o.3mg/L的二氯异氰脲酸,0.3mg/L季胺盐络合碘和3.o×10PFu/m1蛭弧菌,后者对 于抑制水体 弧茵活菌浓度的效果明显优于化学消毒剂.当每隔20d左右分别进行一次上述水 体处理,通过比较 体内弧菌感染的对虾个体数,发现从肝胰腺分离到弧菌的对虾数量二者无显着差 异,但从血淋巴分离 到弧菌的对虾数量,蛭弧菌处理组显着少于化学消毒剂处理组,显示了蛭弧茵在预 防对虾弧菌感染方 面的优越性. 关键词噬菌蛭弧菌对虾弧菌病生物防治. 中图分类号S945.1;S476.1文献识别码A文章编号1OO()一7075(2O09)O1一O026 —08 PreVenti0n0f,IfDinfectiOnbyappIicati0nOf BZZDZrfOc,.fDO,.inintensiVelyculturedshrimp ZHANGLV—pingHUChao—qunLUOPengSHENQi (KeyLab0ratoryofMarineBio— resourcesSustainabIeUtilization,ChineseAcademyofSciences, SouthChinaSea1nstituteof0ceanology,Guangzhou51O3O1) ABSTRACTBeZo6r06口c,er00rsstrainBd一9913wasidentifiedusing16SrDNAuni— Versalprimers63Fand842R.Thelyticabi1ityofBd一9913onshrimppathogenicbacteriala— gents,?6r0以Zg720Zcand.口r口^以e70Zc"5,andastandardstrainofEcerc^口c0一 wasinvestigatedrespective1y.ThesafetyofBd1O9_JandBd一 9913topostlarvaeofwhiteleg shrimpLDpP,z以P"sn以7e,wasdemonstratedintwoweeksafteroraladministrationof3.O l0.PFU/mlBPZZ06r0smixed1:1(/)withcommercialfeed.DisinfectioneffectofVibri— oesinshrimpwaterwascomparedbetweenchemicaldisinfectanttreatment(0.3mg/Lchlorid e 中国科学院知识创新工程重要方向项目(Kscx2一YwN,47一O1)和农业部渔业 生态环境重点实验室开放课题(2O03O4)共同资助 *通讯作者.E,mail:cqhu@scsio.ac.cn,Tel:(O2O)89O232l8 收稿日期:2DO7一?一Ol;接受日期:20O7一l2O8 作者简介:张吕平(1973一),男,博士,助研,主要从事海水养殖及病害防治研究.E— mail:lpzhang@scsio.ac.cn,Tel:(O2O)89O23216 第1期张昌平等:噬菌蛭弧菌预防对虾弧菌感染的应用研究27 and/oriodide)andBPZZo6rosaddition(3.0×10PFU/m1).Resultsindicatedthatthelater showedgreatadvantagetotheformerinkeepingtheconcentrationofliVe6r0atasafe1eVe1 twiceaslong(2Odays).Furthermore,advantagewasalsoshownwhenBeZZ06r0srather thanchemicaltreatmentwasusedtocontrolshrimp6r0infectionintheoutdoorintensive shrimpponds. KEYWoRDSBeZZD606以f00rsShrimpVibriosisBiocontrol 弧菌病Vibriosis是养殖对虾最主要的细菌性疾病,其给养殖对虾造成的损失仅次 于病毒病(杨少丽等. 1995;Lightner1993).自从1970年Vanderzant等首次从患病对虾体内分离到副溶血 弧菌?60加rn口P— m02fc"s以来,陆续分离鉴定的对虾病原弧菌包括溶藻弧菌V.口zgi0zc"5,创伤弧菌 V."zf"s,杀虾 弧菌.Pn口,哈氏弧菌V.口rP,非01霍乱弧菌.oz8rne0一01,鳗弧菌.彻g"nr"m和产 气 弧菌.g以0gPe等等(Iightner1988;Songfnz.1990;IshimaruPf以z.1995;Lavilla— PitogoP,口z. 1998;郑国兴等1986,199O;战文斌等1997).. 对虾弧菌病的治疗,目前主要依赖各种抗生素药物.然而,随着各种抗生素药物的 频繁使用,各种病原菌 对于药物耐受性越来越强(盖春蕾等2OO8).耐药菌株引起水产动物发病往往更为 严重,Karunasagar等早 在1994年就报道过哈氏弧菌耐药株引起斑节对虾虾苗大量死亡的现象,后来亦有 类似报道(RipabelliPnz. 1999).而且,许多虾类病原弧菌为人畜共患病原(如副溶血弧菌和创伤弧菌等),大量耐药菌株的产生对于人 类健康也造成直接的威胁.因此,研究细菌性疾病的替代疗法或生物防治法近年来受到越来越多的重视.在 养殖对虾弧菌病的控制方面,虽然不少学者较早就开展了免疫预防研究(ItamiP,nz.1989;Sung口z. 1996;陶宝华等1999),但是由于虾类自身先天性免疫特性的不足,此类研究仍处于实验阶段,离应用还有相 当的距离.所以,寻找对于虾类弧菌病安全有效,环境友好的生物防治方法受到越来越多的重视. 蛭弧菌BPzz0口6riosp.是一类广泛存在于自然环境中,甚至存在于动物及人的肠道内的小型菌.到目前 为止已发现了4种,分别为噬菌蛭弧菌Bzz00cfr00r"s,噬小球藻蛭弧菌B.c^z0rz0rs,斯塔氏 蛭弧菌(B.sf&r,.)和斯托氏蛭弧菌(B.sf0Z)(KleinnZ.1967;Taylor ,nZ.1974;WilliamsnZ. 1984).由于其具有特异性裂解细菌的特殊生长习性,被认为是自然环境中各种病原菌的天然净化因子,具有 较好的生物防治应用前景,近年来受到了广泛关注.许多学者开展了它们对各种细菌裂解的实验研究,期望用 来净化环境和水体(司稚东等1982;SchoeffieldP,nZ.1990;Edouard?z.2OOO). 在水产领域,杨淑专等(1997)用从海水分离到的蛭弧菌裂解1O种对虾病原细菌,发现几乎所有供试菌株 都不同程度被寄生;杨莉等(2OO0)通过水族箱实验指出,水体蛭弧菌浓度达到10PFU/ml以上,对10. cFU/ml嗜水气单胞菌浸泡感染鲤鱼有一定的防治效果.本文报道使用蛭弧菌标准菌株Bezzo6roc一 ro0r"s1O9一J(Bd1O9一J)和实验菌株(Bd一9913)对虾类病原菌溶藻弧菌(? 60&ZgoZ,f"s),副溶血弧菌 (?6,-i0户口阳矗nP研.f"s)和大肠埃希氏菌Esferc^口?z分别进行的裂解效应实验,Bd1O9一J和Bd一9913 对于凡纳滨对虾幼虾的安全性,集约化虾池分别使用蛭弧菌和化学消毒剂对水体弧菌数量消长的比较,以及 BPzz0ro6口ffPror"预防对虾弧菌感染的效果. l 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法 1.1菌种与培养基 蛭弧菌标准菌株109一J(Bd1O9一J),购自美国模式培养物保藏所(AmericanTypeCu1tureCol1ection, ATCC),编号为ATCC43826;蛭弧菌实验茵(Bd一9913)由广东省疾控中心微生物检验所惠赠;供试宿主菌溶 藻弧菌LSO1株,HFO9株,副溶血弧菌V28株为本实验室分离保存,大肠埃希氏菌Esc矗Pr站矗口?zCH一42株 购自广东微生物研究所. 28渔业科学进展第3O卷 牛肉膏蛋白胨液体培养基:胰蛋白胨5g,牛肉膏3g,酵母汁1g,NaCl5g,H01OOOml,pH7.2,121?灭 菌15min.固体培养基加1.59/6的琼脂粉,半固体培养基加0.6的琼脂粉. 1.2蛭弧菌计数.种子液制作与PCR鉴定 双层琼脂平板制作:将宿主菌接种于5m1液体培养基,2O0r/min摇床培养,经30?培养16h,取1ml混合 倾注固体平板,3O?培养16h形成菌苔,再在菌苔上倾注混合了1O0l供试蛭弧菌种子液的半固体培养基, 30?培养72h以上,计算噬菌斑形成数(Plaqueformingunits,PFU),同时挑取噬菌斑相差显微镜镜检. 将已形成噬菌斑的双层平板,每个用5ml灭菌生理盐水(O.9NaC1)浸润,30min后吸出,用O.45m的 针孔滤器过滤,4?,10OO0g×15min离心,上清为蛭弧菌浸出液,4?可以保存15d, 剩余部分用冻存管分装,添 加25(/)的甘油,一8O?冻存. 将Bd1O9一J和Bd一9913经双层平板形成的噬菌斑分别挑取20个,参照水体细菌DNA提取方法(Luo nz.2OO7)并适当修改提取总细菌DNA. 采用蛭弧菌特异性引物对63F(5CAGGCCTAACACATGCAAGTC一3)和842R(5'一CGwCACT— GAAGGGGTCAA一3')(EdouardandBarak,2()()Ob)扩增特异性片断,PCR反应体系包含1.0unit的丁nq DNA聚合酶(TAKARA,大连),1×的反应缓冲液(10Ommol/L的Tris—HCl,pH9.O,Trit0nX一10O1,500 mmol/L的KC1),3.Ommol/L的MgCl,各2Omo1/L的dNTP,各1.Omol/L的上下游引物,各1.Ol的模 板DNA.反应程序为:94?,4min变性;94.C,1min,5O?,1min,72?,1min扩增,34个循环;72?,5min延 长.反应结束后,将反应产物与2l6倍溴酚蓝上样缓冲液混合,1.0琼脂糖电泳(120V,20min),EB染色后 紫外成像. 1.3蛭弧菌对宿主的裂解实验 按照Edouard等(2.OO)的方法适当修改.宿主菌?6r0?zg0zfsLSO1株,HF09株,V.n矗nP— m0z,c"sv28株及Escc0ziCH一42)分别接种于5ml液体培养基,2oOr/min摇床培养,30?培养16h 后(570nm光密度约O.6,含有约1,5×10.CFU/m1),取2oOl转接于20ml液体培养基,2OOr/min,30?培养 24h后(浓度约为1,5×10.CFU/m1),添加MgCl?6H20和MgCl2?2Hzo(pH7.2)至浓度分别为3.0 mmol/L和2.Ommol/L,接种5ml蛭弧菌供试菌Bd一9913浸出液(浓度约为2,3×1OPFU/m1).每隔24h 分别取1O0l按1.2的方法制双层培养平板,计算噬菌斑形成数,同时分别取1OOl用灭菌生理盐水梯度稀释 法倾注平板24h培养,计算宿主菌的活菌浓度(Cloneformingunit,cfu),连续取样7d. 1.4蛭弧菌对凡纳滨对虾的安全性实验 3个1OOL的塑料桶,分别加砂滤海水5OL,盐度30,温度28,30?,pH8.2,连续充气,每桶放凡纳滨对虾 稚虾15尾(平均体重3.Og),分成A,B,c三组,A,B为实验组,C为对照组,开始实验前先暂养3d.将4?保存 的Bd109一J和Bd一9913噬菌斑浸出液(浓度约为3.0×10PFU/m1)用灭菌生理盐水稀释1O倍,临喂前30min 按1:1(/训)与1*颗粒饲料混匀,分别投喂A组和B组,连喂3d,以后喂正常颗粒饲料;C组投喂正常颗粒饲 料,每天早,晚喂1次(按体重的10)并吸污,每天换水5O.14d内统计各组死亡数.于实验第4天用吸管 吸取各组对虾新鲜粪便,按上述1.2的PcR方法检测蛭弧菌的有无;最后于实验结束第14天时各组分别取两 尾肠道饱满的对虾,分别按如下方法获取肠道内容物并提取DNA,检测蛭弧菌: (1)用7O9/6的酒精擦拭对虾体表,剪开背部,取出中肠;(2)用镊子轻轻压出肠道内容物,置于1.5ml离心 管,同一组的两个样混合;(3)各加入O.5mlO.1的Tween一8O(PBS配制,pH7.4),吹打洗脱3min;(4)500 g离心5min,取上清,12oOOg离心1Omin,弃上清;(5)加入2OO肛l裂解液,按上述1.2的方法提取DNA. 1.5蛭弧茵与化学消毒剂对于虾池水体弧菌数量消长的比较 实验地点为海南省陵水县海富公司黎安虾场.选取4个相邻的圆角方形虾池,分别编号为1,2,3和4号 第1期张吕平等:噬菌蛭弧菌预防对虾弧菌感染的应用研究 池,每个池面积667m.,均为水泥护坡,防渗膜铺底的提水式高位池.投放同一批经检测不带WSSV,TSV和 IHHNv的凡纳滨对虾虾苗,密度均为1O0尾/m..养至第5O天时,取水测定水体弧菌的活菌总浓度(每次每 池取两个中下层水样,取平均值,下同),然后进行如下实验: 1号池全池泼洒二氯异氰尿酸钠(含有效氯47),开动增养机混匀,使终浓度约为0.3mg/L;2号池全池 泼洒季胺盐络合碘(含有效碘35),使终浓度约为0.3mg/I;3号池全池泼洒蛭弧菌浓缩增菌液(江苏南京威 特生物公司提供,蛭弧菌浓度约10"PFU/m1)使池水中蛭弧菌的浓度达到约 1OPFU/ml;4号池为对照池.次 日开始取水样检测水体弧菌的活菌总浓度,每隔3d测1次,共测7次. 1.6蛭弧菌预防对虾弧菌感染的应用效果 实验地点及池塘同上,每14d按上述方法分别处理1次.7d后起,每7d分别从各池随机取虾1O尾,连 续56d,分别用TCBS平板从肝胰腺及淋巴液划线接种,检测对虾体内弧菌的有无,最后比较各池间差异的显 着性. M1234 2结果 2.1蛭弧菌的PCR检测 图1是标准蛭弧菌(Bd—l09一J),供试菌株(Bd一9913)及浓缩增菌液 目的PCR检测结果.所有菌株能产生显着的83Obp特异条带,所扩增的 片段为蛭弧菌16srRNA基因特殊片段,证实供试菌与标准菌株同属M'分子? 一 种菌.空白样无此片断扩增.M:ol…l.k;1:Bd1o9一J; 2.2蛭弧茵对宿主的裂解.B91:.:?ed 图2是蛭弧菌供试菌株Bd一9913对4种宿主菌的裂解效果.从结图1蛭弧菌的PcR检测 果可以看出,裂解效果最好的是E.?ZCH一42(d),7d宿主菌浓度下Fjg?PcRd.i..fBd幻. 降了6个数量级;溶藻弧菌Is01也能较好被裂解,第2天开始宿主菌 浓度开始下降,至第7d下降了4个数量级(a);HF09株次之,7d下降了3个数量级(b);副溶血弧菌V28被裂 解效果最差,实验期间仅降低了两个数量级(c).蛭弧菌的增菌效果与裂解效果一致. 2.3蛭弧茵对凡纳滨对虾的安全性 经14d的观察,在饲料中添加蛭弧菌噬菌斑浸出液,对于凡纳滨对虾没有造成表征异常,实验组与对照组 死亡数没有差异(表1),每组死亡的1,2尾对虾均为吸污操作时失误造成.第4天和第l4天对粪样的PCR 检测结果(图3)表明,第4天实验组粪样中可检测到蛭弧菌存在(对照组无),第14天各组肠道粪样中均检测 不到蛭弧菌. 2.4蛭弧菌与化学消毒剂对于虾池水体弧菌数量消长的比较 从图4各池水体弧菌活菌总浓度(ConcentrationofLiveVibrioes,CLV)的变化可以看出,处理之前,各池 弧菌数相当,约为10数量级,经化学消毒剂处理,第2天水体弧菌急剧降低,分别达到10左右的低水平,然而 接下来的14d水体弧菌数直线上升,第1O天已经恢复到处理前的水平,14d以后已经超过处理前的浓度,并 且,使用二氯异氰脲酸和使用季胺盐络合碘处理后的变化十分相似. 使用10.PFU/ml蛭弧菌,亦可以明显降低水体弧菌含量,弧菌浓度下降的速率较之化学消毒剂缓慢,7d 左右达到最低,浓度对数值约为2.8,接下来的14d逐渐增加,到实验结束(处理后第2O天)时,水体弧菌浓度 仍然保持在1O.数量级,比处理前浓度降低1个数量级. 30渔业科学进展第3O卷 表l凡纳滨对虾口服蛭弧菌后14d死亡情况 Table1MortalityofwhitelegshrimpL,o删口eH5啪口mPin14daysbytheBdell0vibri0s0raladministrati0n g 三 按g c昌 姐三 (c) 天数Days (d) 天数Davs (a)溶藻弧菌Ls01;(b)溶藻弧菌HFO9;(c)副溶血弧菌V28;(d)大肠埃希氏菌cH一42 一 ×一对照宿主,一口,裂解宿主,一?Bd一9913 (a)w6r0?Zg.ytfsLSO1(b).nZgn0,3,,f"sLSO1(c)y.nZg抽0Z,f"5HFO9(d)E.foZCH一42 一 ×一h0stc0ntr0l,一口一hostlysis,一?一Bd一9913 图2蛭弧菌供试菌株Bd一9913对4种宿主菌的裂解效果 Fig.2TheIvticabiIityofBD9913tosomehosts 对照组第7天弧菌数量上升,第14天下降,第21天又上升,但浓度变化的幅度不大,均保持在10数量级 左右的较高水平. 2.5蛭弧茵预防对虾弧茵感染的效果 在56d时间内连续跟踪调查了实验虾池对虾体内弧菌感染情况,结果如表2.从表2中数据可以看出,3 个处理池(A,B,C)分离到弧菌的对虾数明显低于没有处理的对照池(D),但各处理组从肝胰腺分离到弧菌的 数量差异不显着,从血淋巴分离到弧菌的对虾数,则是蛭弧菌处理池数量最少,显着低于其他池.且各池从淋 巴液分离到弧菌的对虾数量均低于从肝胰腺分离到弧菌的对虾数. 3讨论 以前关于蛭弧菌的鉴定,主要是依靠显微镜或电镜下的形态观察,并结合其DNA的Gc摩尔百分比作为 分类依据,如按照GC含量5O.4和43的不同分为两类.200O年,Edouard等(2006)在对蛭弧菌16srRNA 序列测定及比较后,设计了多组针对蛭弧菌16SrDNA特有基因序列的引物对,可以将现有的几种蛭弧菌方 第1期张吕平等:噬菌蛭弧菌预防对虾弧菌感染的应用研究 便地加以区分鉴别.本研究采用的引物对63F和842R 为蛭弧菌PCR鉴定的通用引物对,扩增的83Obp特异条 带清晰,ATCC标准菌株,国内购买实验菌株及蛭弧菌 浓缩液检测结果一致,证明了本实验使用蛭弧菌菌株的 可靠性. 菌株BI)I9913对大肠埃希氏菌CH一42株的裂解效 率最高,而对其他3株菌的裂解效果较差,可能主要与 BI)_9913来自陆生环境,而3株对虾病原菌均分离自海 水环境有关.相反,Taylor等(1974)从海水分离的蛭弧 菌菌株,对于大多数海洋细菌以及陆生细菌都能裂解,但 是对少数陆生菌株裂解效率也较弱.Takubo等(1989) 认为,这可能主要与宿主表面结构及蛭弧菌的识别系统 Ml09JABC1O9JABC ??【....................__JI..........................__J 第4天第l4天 M:分子量标准;A:Bdl0g—J;B:Bd9913;C:Contr01 M:molecularmarker;A:Bd1O9J;B:Bd9913;C:Control 图3蛭弧菌饲喂凡纳滨对虾后第4,14天粪样检测结果 Fig.3ResuItsofBc,PZ.6r0detectedfr0mfeces 0fwh|te1egshrimp,L,0户PnPHs硼口mPatday4and 14after0raladministration 存在差异有关.所以,针对不同的使用对象,应该选择特异性较强的蛭弧菌菌株,才有可能达到控制潜在病原 菌的目的. 表2凡纳滨对虾经不同水体处理后感染弧菌情况比较 Table2Comparisonof?6r0isolatedfromwhitelegshrimpL,0户PnP"s硼n加研PafterdIfferentwaysofwaterdisinfection a.b示不同差异显着性类别,a为差异不显着(P>O.1)'b为差异显着(P>O.O5),c 为差异极显着(P<O.O1) 蛭弧菌对于食源性动物的安全性是普遍重视的 问题.以前有文献报道,从蛙的肠道,马的粪便以及 正常人的肠道中均分离到蛭弧菌(WestergaardPf 日z.1977).本实验通过Bd一109J和Bd一9913对凡 纳滨对虾的饲喂实验,第4天(即实验组连喂3d后 次日)从实验组对虾的粪样中可检测到蛭弧菌的存 在,但第14天实验结束时则检测不到,且l4d内实 验组对虾没有出现外观症状及显着死亡,说明 1O.PFU/ml浓度的蛭弧菌Bd一109J和Bd一9913菌 株,对于体重3,5g的凡纳滨对虾是安全的.至于 不同菌株,不同浓度对不同种类和大小对虾的生物 安全性如何有待深入研究. 三 驾u 耋喜 爱 图4蛭弧菌与化学消毒剂对水体弧菌的控制效果比较 Fig.4CLVchangein2Odaysafterdifferentdisinfectanttreatment 含氯化合物和含碘化合物是水产养殖中经常使用的化学消毒剂,低浓度水体消毒多用于降低水体细菌的 浓度,预防细菌性疾病的发生(Boyd1996).对于虾类养殖,则主要是预防弧菌病的发 生.但是,由于此类化 学消毒剂毒性强烈,使用时不仅杀死有害细菌,同时杀死各种藻类以及浮游动,植物,严重破坏水体生态平衡 (HuangPfnz.1997;刘萍等1997).如果使用不当,甚至直接造成对虾的伤害,影响虾类生长(Boyd. 1996).另外,可能是由于经常使用此类化学消毒剂的缘故,Mir等(1997)发现有些病原菌对于氯已经产生了 32渔业科学进展第3O卷 较强的抵抗力. 蛭弧菌对于宿主的裂解实验结果与杨淑专等(1997)和杨莉等(20OO)的结果近似,对于主要虾类病原菌 都有很强的裂解效应,显示了很好的应用前景,如果使用蛭弧菌选择性地杀灭水体病原菌,则不会造成水体生 态平衡的严重破坏.尽管蛭弧菌在自然环境中的分布极为广泛,但wi11iams等(1994)的研究结果表明,蛭弧 菌要在水体中起到杀灭病原菌的效果,宿主菌的浓度要达到1OPFU/ml以上的数量级,除了污水中病原菌有 可能达到这一浓度外,一般的自然水体环境几乎不可能达到.本研究结果表明,1OPFU/ml的试验菌株浓度, 可以显着降低虾池水体弧菌活菌浓度,较之化学消毒剂作用温和,且维持的时间长两倍以上,可能是在虾类养 殖中期细菌浓度较高的特殊水体环境才有的效果. 当以1O0尾/m的密度放养凡纳滨对虾,50d时水体弧菌浓度已经达到或超过1OCFU/m1,使用二氯异氰 尿酸钠和季胺盐络合碘进行水体消毒,弧菌浓度于第2天即降至1OCFU/ml以下.可能由于此类化合物较易 挥发,加上杀死了大量浮游动,植物,使水体中可以被细菌利用的有机物的含量增加,所以7d以后水体弧菌浓 度直线上升,14d以后,甚至超过消毒前的浓度.相比之下,蛭弧菌抑制水体弧菌浓 度显示了更好的稳定性,实 验期间,均维持在1O.CFU/m1左右水平.如果进一步筛选适合特定养殖环境的菌株,添加更高的浓度,有可 能达到更佳的抑菌效果. 有研究表明,对虾体内分离到弧菌与否,是对虾感染弧菌的直接证据,也是弧菌病发生的前兆(Sungfnz. 1999).本实验结果显示,经蛭弧菌与化学消毒剂处理水体后,从肝胰腺分离到弧菌的对虾数差异不显着,即 两种处理的效果相当;但是,从血淋巴分离到弧菌的对虾数蛭弧菌组明显少于化学消毒剂组,这一结果说明蛭 弧菌处理水体较之化学消毒剂具有更好的预防弧菌感染的效果.尽管导致这种差异的原因有待进一步研究, 但是我们相信,如果筛选特异性更强的裂解对虾病原弧菌的蛭弧菌菌株,可能对于虾类弧菌感染会有更好的控 制效果. 参考文献 司稚东,秦生巨,秋频,张贤良,郭和厚.1982.细菌的寄生菌——噬菌蛭弧菌的研究.中华微生物学和免疫学杂志,z(1):12,15 刘萍,李健,孙修涛,刘得月.1997.对虾病害防治药物对浮游植物的影响研究.海洋水产研究,18(1):34,41 杨莉,马志宏,黄文,王秀茹,高傲.2OOO.蛭弧菌对鲤感染嗜水气单胞菌预防效果的观察.大连水产学院,15(4):288,292 杨淑专,黄庆辉.1997.海洋噬菌蛭弧菌对对虾病原菌及其他细菌的寄生作用.厦门大学,36(3):449,453 杨少丽,王印庾,董树刚.2005.海水养殖鱼类弧菌病的研究进展.海洋水产研究,26(6):75,83 郑国兴.1986.养殖对虾弧菌病致病菌——非O1群霍乱弧菌的生物学性状与致病 ,1O(2):195,2O3 性.水产 郑国兴,沈亚林,李何.199O.中国对虾病原菌(鳗弧菌)的研究.水产,14(1):1,6 战文斌,周丽,俞开康,陈章群,孟庆显.1997.一种新的中国对虾弧菌病病原——产气 弧菌.海洋与湖沼,28(1):21,26 徐琴,李健,刘淇,王群.2007.嗜菌蛭弧菌和粘红酵母对中国对虾生长及非特异免疫 因子的影响.海洋水产研究,28(5):42,47 陶宝华,胡超群.200O.弧菌疫苗对斑节对虾和日本对虾免疫预防的作用.水 产,24(6):564,569 盖春蕾,李健,刘淇.2?8.二氟沙星对3种海洋弧菌的抗菌后效应研究.海洋水产研 究,29(2):97,1O1 Boyd,C.E.1996.Chl0rilationandwaterqualityinaquacultureponds.WorldAquacu1ture,2 7:41,45 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