《新药药效学研究思路与方法》

《新药药效学研究思路与方法》 讲 义 (供本科生、研究生使用) 主编:沈志强 陈 鹏 编委:何 波 昆明医学院 药学院 2009年12月 序 言 药理学研究的目的是通过实验研究来认识药物作用的特点和规律，为开发和评价药物提供科学依据。药效学研究是新药研制与开发的重要内容，研究开发尚未用于临床的新药，必须进行药效学试验。药效学研究及临床研究，是对新药进行有效性评价的两个重要组成部分，前者是基础，后者是前者的继续和最后判定，综合判断，才能对新药的有效性作出科学、准确、全面地评价。因此，为我校本科生开设《新药药效学研究思路与方法》选修课程尤为必要。 开设本选修课，探索并建立以药理学实验设计和药物临床前研究的共性方法与思路为核心的教学模式，通过学习，使学生较扎实地掌握药理学实验设计的要素及原则、新药药效学临床前研究的共性方法与思路，为我院在药理学、毒理学及生理与病理生理学等专业进一步开设综合设计性、探索研究性的实验教学课程、顺利开展我校大学生创新性实验 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 、切实培养学生创新意识、提升创新能力等诸方面提供方法学与研究思路的理论支撑。 本讲义在参考《The Pharmacological Basis of Therapeutics》、《药理实验方法学》、《中药药理研究方法学》、《实验药理学》等专著的基础上，结合我校注重培养学生创新意识、提升创新能力的精神要求来编写，作为昆明医学院本科生、硕士、博士研究生授课的依据。 编者 2009年12月 1 第一章 总论 ,, 药理学实验设计及新药药效学研究思路与方法 沈志强 教授 第一节 药理学实验设计 药理学研究的目的是通过实验研究来认识药物作用的特点和规律，为开发和评价药物提供科学依据。在进行药理学科学研究之前，需要制定完善的研究设计 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ，那么什么样的设计方案才称得上是比较完善的呢,一般来说，完善的设计方案需具备以下几个条件:实验所需的人力、物力和时间资源，实验设计的“三要素”和“六原则”均符合专业和统计学要求，对实验数据的收集、整理、分析等有一套规范的规定和正确的方法。而准确把握研究设计的“三要素和六原则”，是药理学实验设计的核心。 一、 实验设计的“三要素” 1.实验对象:实验研究的客体即为实验对象或称为受试对象。如用小鼠做实验，小鼠就是本次实验的实验对象。药理学实验主要实验对象包括整体动物(正常动物、麻醉动物和病理模型动物)、离体器官、组织、细胞和分子靶标等。实验对象选择的合适与否直接关系到实验实施的难度，以及同行对实验研究的科学性、可行性和创新性的评价。 一个完整的实验设计中所需受试对象的总数称为样本含量。最好根据特定的设计类型估计出较合适的样本量大小。样本过大或过小都有弊端。 实验动物的基本例数(样本量) (1)小动物(小鼠、大鼠、豚鼠、蛙):每组至少10例。 (2)中动物(兔):每组至少8例。 (3)大动物(猫、犬、猴、羊、猪):每组至少8例。 2. 实验因素:所有影响实验结果的条件都称为实验影响因素。实验研究的目的不同，对实验因素的要求也不同。研究者希望通过严密的设计有计划地进行药理学研究，从而能够科学地考察药物作用大小的因素称为药理学实验因素(如药物的种类、剂量、浓度、作用时间、病理模型的复制等);对评价实验因素作用大 2 小有一定干扰性且研究者并不想考察的因素称为重要的非实验因素(如动物的窝别、体重等);其他未加控制的许多因素的综合作用统称为实验误差。最好通过一些预实验，初步筛选实验因素并确定取哪些水平较合适，以免实验设计过于复杂，难以完成实验。 (1)处理因素:实验中根据研究目的确定的由实验者人为施加给受试对象的实验因素称为处理因素，如药物、某种手术、病理模型等。 一次实验涉及的因素不宜过多，否则会使分组增多，受试对象的例数增多，在实际工作中难以控制。但处理因素过少(如药效学研究中的量效关系和时效关系探讨)，又难以提高实验的广度和深度。 (2) 处理因素的 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 化:处理因素在整个实验过程中应做到标准化，即保持不变，否则会影响实验结果的评价。如实验设计中处理因素是药物时，则药物的剂型、给药途径、质量(成分、出厂批号等)、剂量必须保持不变;病理模型的复制，标准应统一规范。 (3) 非处理因素:非处理因素虽然不是我们的研究因素，但其中有些因素可能会影响实验结果，产生混杂效应，所以这些非处理因素又称混杂因素，如动物的饲养环境、饮食情况、实验仪器的精密度、实验者操作的熟练、规范程度等。设计时明确了这些非处理因素，才能设法消除它们的干扰作用。 3. 实验效应:实验效应是药物(处理因素)作用于受试对象的反应和结果，它通过相应的观测指标(统计学常将指标称为变量)来体现。如果指标选择不当，不能准确反映药物的作用，获得的研究结果就缺乏科学性，因此，选择好观测指标是关系整个研究成败的重要环节。选择观察指标应具有客观性、精确性、特异性和灵敏性。此外，指标的观测应避免带有偏性或偏倚。对一些半客观(比如读pH试纸上的数值)或主观指标(对一些定性指标的判断上)，一定要事先规定读取数值的严格标准，只有这样才能准确地分析自己的实验结果，从而也大大提高了自己实验结果的可信度。 二、实验设计的“六原则” (一)随机原则:随机不是随意和随便～“随机”指在接受处理(分组、用药、 3 化验、抽样等等)时，每个实验对象都有相等的机会，随机遇而定。随机可减轻主观因素的干扰，减少或避免偏性误差，是实验设计中的重要原则之一。随机原则应用最普遍的是动物分组，采用抓取动物的方法对同一批动物进行分组，可能产生的结果是多样的。按先后分组，如果随意抓取，则首先抓到的可能是体弱和运动不良的动物，而最后抓到的则是体格健壮的动物，结果是必然产生显著的组间差异。因此，只有采取随机的方法，才能将这种体质差异以及动物个体之间其他方面的差异按照随机的原则相对均衡地分配到各组中。最常用的是“随机数字表”来实现随机化。 (二)对照原则:“对照”是比较的基础，没有对照就没有比较，没有鉴别。对照应符合“齐同可比”的原则，除了要研究的因素(如用药)外，对照组的其他一切条件应与给药组完全相同，才具有可比性。 1(分组的类型 (1)阴性对照组 即不含研究中处理因素(用药)的对照，应产生阴性结果。 ?空白对照 不给任何处理的对照，多用于给药前后对比，两组对比时较为少用。 ?假处理对照 经过除用药外的其它一切相同处理(麻醉、注射、手术等)，所用注射液体在pH、渗透压、溶媒等均与用药组相同，可比性好，两组对比时常用。 ?安慰剂对照 用于临床研究，采用外形、气味相同，但不含主药(改用乳糖或淀粉)的制剂作对照组药物，以排除病人的心理因素的影响。 (2)模型对照 复制与人类疾病相似的动物模型，或离体组织器官、细胞接受相关的刺激或损伤。以判断药物对该模型动物、组织器官或细胞的影响。 (3)阳性对照组 采用已肯定疗效的药物作为对照，应产生阳性结果。如果没有阳性结果出现，说明实验方法有待改进。 ?标准品对照 采用标准药物或典型药物作为对照，以提供对比标准，便于评定药物效价。 ?弱阳性对照 采用疗效不够理想的传统疗法或老药作为对照，可代替安慰剂使用。 (4)实验用药组(药物处理组) 4 ?不同剂量 可阐明量,效关系，证明疗效确由药物引起;还可避免因剂量选择不当而错误淘汰有价值的新药。一般采用3,5个剂量组。 ?不同制剂 以不同制剂的药物，同时进行药效对比，以了解哪种最为有效。 ?不同组合 用于分析药物间的相互作用(配伍配比)，多采用正交设计法安排组合方式。 2 对比的性质 (1)自身对比 又称同体对比、前后对比，为同一个体用药前后、或身体左右侧用药的对比。可大幅度较少个体差异，但要注意前后两次机体状况是否有自然变异。 (2)组间对比 药理实验中应用最广的对比。注意非用药因素要尽可能一致，以减少误差。 (3)配对对比 采用同种、同窝、同性别、同体重的动物，一一配对。可减实验误差，提高实验效率，但要注意不可滥用。 下面几种对比是对比的特殊情况。 (4)交叉对比 同一个体前后两次分别接受甲乙两药治疗。一组动物先用甲药，后用乙药，另一组动物先用乙药，后用甲药。两次用药期间可根据实验性质休息一定时间，以避免前药对后药的影响。动物实验或临床研究中均可应用，主要适用于病程较长的疾病或病理模型。 (5)历史对比 利用个人既往 经验 班主任工作经验交流宣传工作经验交流材料优秀班主任经验交流小学课改经验典型材料房地产总经理管理经验 、过去的病历记录或历史数据、文献资料作为对比。可比性差，除癌症、狂犬病等难治疾病外，最好不用。 (6)双盲对比 主要用于临床研究，可减少医师和病人两方面的心理因素影响。实验中病人和观察病情的医师都不知道谁是用药组，谁是对照组。只有主持研究者保留名单，以决定具体治疗措施和分析实验结果。为新药临床研究中必不可少的方法之一。 (三)重复原则:所谓重复原则，就是在相同实验条件下必须做多次独立重复实验。 “重复”包括两方面的内容，即良好的重复稳定性(或称重现性)和足够的重复数，两者含意不同又紧密联系。有了足够的重复数才会取得较高的重现性，为了得到统计学所要求的重现性，必须选择相应的适当的重复数。 5 统计学中的显著性检验规定的P < 0.05及P < 0.01反映了重现性的高低;“P”表示不能重现的概率。在已达到良好的重现性的条件下，如果P值相同，重复数越多的实验，其价值越小。它说明实验误差波动太大，或是两药的均数相差太小。前者提示实验方法应予改进，后者提示两药药效的差别没有临床意义。可见，靠增加实验例数来提高重现性是有一定限度的。 1.实验重复数的质量 除了重复数的数量问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 外,还应重视重复数的质量问题。要尽量采用精密、准确的实验方法，以减少实验误差。同时应保证每次重复都是在同等情况下进行。即实验时间、地点、条件，动物品系、批次，药品厂商、批号，临床病情的构成比或动物病理模型的轻重分布应当相同。质量不高的重复，不仅浪费人力和物力，有时还会导致错误的结论。 2. 药理实验设计中的例数问题 实验结论的重现性与可靠性同实验例数有关，实验质量越高、误差越小，所需例数越少，但最少也不能少于“基本例数”。 实验动物的基本例数 )小动物(小鼠、大鼠、豚鼠、鱼、蛙):每组至少10例。 (1 (2)中动物(兔):每组至少8例。 (3)大动物(猫、犬、猴、羊、猪):每组至少8例。 (四)平衡原则:一个实验设计方案的均衡性好坏，关系到实验研究的成败。应充分发挥具有各种知识结构和背景的人的作用，群策群力，方可有效地提高实验设计方案的均衡性。在实验设计的过程中要注意时间上的分配，只有在时间上分配好了，才不会出现一段时间特别忙而一段时间特别闲的情况。 (五)弹性原则:所谓空格，指的是在时间分配图上留有空缺。适当的空缺是非常必要的，只有这样才能富有弹性的实施实验计划，并不断地调整好自己的实验进度。 (六)最经济原则:不论什么实验，都有它的最优选择方案，这包括在资金的使用上，也包括人力时间的损耗上，必要时可以预测一下自己实验的产出和投入的比值，这个比值越大越好，当然是以你所拥有的实验条件作基础的。 6 第二节 新药药效学研究的思路与共性方法 药效学 (Pharmacodynamics) :在机体 (主要是动物) 器官、组织、细胞、亚细胞、分子、基因水平等模型上，采用整体和离体的方法，进行综合和分析的实验研究，以阐明药物防治疾病的作用及其作用机制。 通过药效学研究，可以明确新药是否有效(有效性、优效性)，药理作用的强弱和范围(量-效关系、时-效关系、构-效关系) 。 药效学研究的目的意义 通过动物实验在认识药物作用的特点和规律，为研制新药和评价药物可能产生的临床应用提供科学依据。 药效学研究是新药研制与开发的重要内容。研究开发尚未用于临床的新药，必须进行药效学试验。 1. 药效学试验研究，可严格控制试验条件，排除各种干扰因素，进行单因素分 析，获得详细准确的结果，发现某些内在的规律。 2. 动物试验可获得大量在人体无法获得的信息:获得各种器官组织标本，进行 多指标的动态观测，深入了解新药的各种作用，获得大量在人体无法获得的 信息。使用各种致病因素作用于动物，造成动物组织、器官或全身性一定的 损害，出现类似于人类疾病所引起的功能、代谢或形态结构的病变，即用人 工的方法诱发特定的疾病，以供研究使用。 3. 为新药的临床研究奠定基础:在不了解新药的安全性、有效性的情况下，进 行人体试用、临床研究，有可能对受试者造成危害，甚至发生意外。 药效学研究及临床研究，是对新药进行有效性、安全性评价的两个重要组成部分，前者是基础，后者是前者的继续和最后判定，综合判断，才能对新药的有效性作出科学、准确、全面的评价。 药效学研究的方法 一、实验设计应该符合国家新药研究申报的有关规定;遵守“随机、对照、重复”的原则。 二、动物试验与动物选择 7 l. 任何新药的研制在临床前最终都要得到整体动物模型的验证。 2. 选择敏感动物，对药物的反应与人体近似，以解剖、生理、习性及反应性与人相近的动物为佳。灵长类动物(猴、猩猩)最近，价格昂贵、难得到。大鼠和小鼠最常用。豚鼠对组胺敏感，易于致敏，是过敏性休克和变态反应研究的首选动物;豚鼠对结核杆菌高度敏感，感染后的病变酷似人类的病变，是结核杆菌分离、鉴别、诊断以及病理研究的首选动物。猫、大鼠、犬血压稳定，常作为血压实验动物。大鼠和犬常用于毒理学研究。猪由于解剖和生理上与人相近，应用日渐增多。兔对细菌内毒素、化学药品、异种蛋白会产生热源反应，体温反应灵敏而恒定。用于各类制剂的热源检测及发热、解热实验研究。家兔眼球大，几乎成圆形，便于进行手术操作和观察，也常用于眼科药物筛选和疗效研究。不宜采用兔制作动物模型的研究:观察呕吐试验:兔对呕吐反应不敏感。放射病试验:兔对射线非常敏感，照射后常发生休克或死亡。咳嗽试验:兔缺乏咳嗽反射。狗、猫的呕吐反应敏感，常用来评价引起催吐和镇吐的药物的作用。 3. 年龄、性别的选择:选用性成熟年龄的动物。小鼠:6,8周，大鼠:8,9周、家兔:4,5月、犬:6,8月。一般雌雄各半。但特别的是，热板法镇痛试验选用雌性小鼠，去卵巢大鼠骨质疏松症试验选用雌性大鼠。 药理学研究中动物的选择 研究项目 选用动物 药物代谢动力学 大鼠、小鼠、家兔、犬 镇痛药物 小鼠、大鼠、家兔 解热药物 家兔 降压药物 大鼠、猫、犬 调节血脂药物 大鼠、家兔 镇咳平喘药 豚鼠 利尿或抗利尿药 大鼠、猫 心血管系统疾病研究中动物的选择 研究项目 选用动物 8 动脉粥样硬化症 大鼠、犬、猪、鸽子 高血压 大鼠、犬 心肌缺血 犬、猪、家兔、大鼠 心率失常 大鼠、豚鼠、家兔、犬 泌尿和生殖系统疾病研究中动物的选择 研究项目 选用动物 糖尿病 大鼠、家兔、犬、地鼠 肾病 A系老年小鼠 生殖系统疾病 大鼠、小鼠、家兔、猫 消化和呼吸系统疾病研究中动物的选择 研究项目 选用动物 胰腺炎 幼年雌性小鼠、犬 消化病理生理研究 犬 十二指肠溃疡 NIH小鼠(老年) 胃肠炎 猪 肝功能、肝外科 大鼠、犬 甲状(旁)腺功能 家兔、犬 乙型肝炎 豚鼠 呕吐试验 猫、犬 肺纤维化肺水肿 大鼠 抗炎与免疫试验研究中动物的选择 9 研究项目 选用动物 免疫学基础研究 裸鼠、SCID小鼠、中国地鼠 关节炎、淋巴腺炎 大鼠 过敏性实验研究 豚鼠 免疫血清 家兔 三、整体与离体试验方法选择 整体试验(体内，in vivo): 正常动物，病理模型 (遗传性动物模型、实验性动物模型、转基因模型)。 离体试验(体外，in vitro): 器官、组织、细胞、亚细胞组分、分子靶标(受体、酶、离子通道、基因等)。 四、根据功能主治或主要药理作用，选择具体的试验方法，目的明确、针对性强，避免选作大量无关或关系不大的试验，而非以多取胜。 五、以主要药效试验为主，配合辅助试验:以直接证实主要药效的核心试验(主要试验)为必作项目，可选用不同模型、方法、动物的试验2,3项。以间接证实主要药效或次要治疗作用的外围试验(辅助试验)为选作项目。核心试验是评价新药有效性的主要依据，适当配合辅助试验，有助于全面准确地评价其有效性，但不可用外围试验取代核心试验。 六、指标的选择 选择符合要求的观测指标，才能反映药物对机体的影响(实验效应)，进行新药有效性的评价。符合以下要求: 1. 特异性强:专属性好，能反映变化本质及主要药效的指标。免疫组化、原位杂交、RT-PCR检测药物对某一蛋白及其mRNA表达的影响。又如研究某药治疗缺铁性贫血的效果，既可选用临床症状、体征，也可选用血红蛋白含量等作为观察指标，但这些指标均不够特异灵敏，只有在缺铁比较明显的情况下才有较大变动。若选用血清铁蛋白作为观察指标，则可特异敏锐地反映出药物(处理因素)的效应。 2. 敏感性高:指标要敏感，对于病情及症候的任何变化，对于药物的防治作用，能够敏感、准确的反映出来。灵敏度高的指标能将处理因素的效应更好地显示出 10 来，而敏感性差的指标，往往会遗漏某些阳性变化，而造成假阴性结果。 3. 重现性好:指标要稳定，重现性好，结果才可靠。重现性差的试验结果不可靠，不能作为新药有效性评价的依据。 4. 客观性:观察指标有主观指标和客观指标之分，主观指标是受试对象的主观感觉、记忆、陈述或实验者的主观判断结果;而客观指标则是借助测量仪器和检验等手段来反映观察结果。在临床试验中，主观指标易受研究者和受试对象心理因素的影响，具有随意性和偶然性;而客观指标具有较好的真实性和可靠性。若实验效应的观察带有偏性，则会影响结果的比较和分析。如研究者的心理常偏向于阳性结果;医生常偏于新疗法组，而病人则对新疗法持怀疑态度等。药理学研究应尽量选用客观、定量的指标。主观检测的指标，误差较大，不够准确，侧如肉眼观测血压计汞柱的变化，误差大，而用描记直接记录血压曲线，客观、动态记录血压变化，则更为精确。镇痛实验的小鼠扭体法，以实验者观察记录扭体次数，主观性较大。有人对胸部X线片读片结果进行调查，一次是两名医生分别读同一批片子，另一次是同一医生在不同时间内重读一批片子，结果也会出现偏差。 5. 定量指标:为了准确判断药物的作用，必须有量的概念、量的比较，必须选用可测量的定量指标 (即计量指标)。形态学指标(组织学、病理学指标)，其特点是能准确地定性、定位，但难于定量。采用分级组织学方法，使之定量或半定量，更准确的判断药物的作用。 但有些质反应指标只能反映是与否、死与不死、阴性与阳性，只能用计数指标。也有的指标目前尚无计量方法，可采用分级计分的方式来量化，如神经功能评分、皮肤刺激性程度评分等。 6. 多指标综合运用:各种指标均有其优点(也常有其局限性，或不足之处，一项观测指标很难满足上述多方面的要求。为了准确、全面地判断新药的有效性，常需多指标综合运用，例如生理指标可定性定量，进行连续动态观察，但有时定位欠准，可受多种因素干扰，稳定性较差。而形态学指标，则可定性定位，但难于定量，也难于进行连续的动态观测。各类指标合理搭配，综合运用，则试验结果更为全面、准确、可靠。不是越多越好，而是越能说明问题越好。 如判断某药的止血作用，只靠血小板的黏附聚集功能增强就认为有止血作用 11 是不科学的，应增加血管收缩作用、对凝血系统的影响和对内脏(肝脏出血、胃粘膜出血、子宫出血的影响等等) 如血脂作为研究某药物预防冠心病效应的指标是合理的、有用的，因为已证明高胆固醇血症的人，其冠心病发病较早较多，降低血脂可以降低该病的发病率。然而，当冠心病已发生，再以血脂作为指标相对意义就小了，因为已证明，降低血脂并不能降低冠心病的发病率，在此情况下，有意义的指标应是骤发性心动过速、血栓形成的倾向性、心肌的收缩性等。指标的合理性有时不能由单一指标来满足，可采取多个指标或成组指标。如冠心病的诊断或临床疗效，不能单独由心绞痛的有无或心电图的有无改变来判断，因为有的冠心病病人并无心绞痛或心电图的变化。因此，只有采取多个症状体征及实验室检查等成组指标的判定才合理。 七、药物的要求 供试药物是药效学研究的对象，是新药有效性评价的物质基础。因此，供试药物应处方固定，各味药材经过品种鉴定，生产工艺基本定型，质量标准及稳定性试验基本符合要求，与临床用药基本相同的剂型。凡是药材未经鉴定，处方、生产工艺、剂型尚未确定，或有变动者，不宜用作药效学试验。 1. 消化道给药 包括灌胃、胃管、十二指肠给药等，可用制剂或提取物进行药效学试验。前者与临床用药更为相似，更合理，但因制剂含有大量糊精、蔗糖等赋形剂，水溶后呈黏稠状，灌胃不便，且体积大，含药量低，无法浓缩提高含药量，因而难于提高动物用量。所以在较多情况下，常用中药提取物进行试验。两者各有利弊，可依具体情况而定。 2. 注射给药及试管内给药 对供试药物要求较高，应是化学纯品或精制的中药制剂。尽量除去杂质、不溶成分及无关成分，其溶解性、粒度、渗透压、酸碱度、无机离子(钠、钾、钙、镁等)含量以及可能干扰试验结果的各种因素，均应控制在生理范围内或符合注射剂基本要求。否则，注射给药将引起机体非特异性反应，产生一系列假象，误认为药理作用;试管内给药也会出现假阳性结果，造成错误判断，其结果须认真分析，慎重判断，且仅供参考，不能作为新药有效性评价的主要根据。 12 3. 外用药 包括擦剂、洗剂、贴剂、膏药等。一类是用于治疗体表或局部疾患，如皮肤病、疖肿、跌打损伤。 八、给药途径 与临床相同。口服制剂，动物可灌胃、十二指肠给药。静脉注射剂，动物可腹腔注射、皮下注射。某些剂型改造的药物，应保证剂型的完整性来给动物服用，如口崩片、肠溶片等。 九、给药剂量的确定 药物至少设置3个剂量，尽量能反映量效或时效关系。剂量偏低难于显示药效，过高，甚至超过毒理试验剂量，其试验结果没有意义，甚至误把中毒效应当作治疗作用。高剂量一般应低于长毒试验的低剂量。 1. 据LD计算:可用其LD的1/10、1/20、1/30、1/40相近剂量，作为药效学5050 试验的系列剂量。 据临床用量推算 2. 3. 据文献估计剂量:文献中相似药物的用量，若处方相似，提取工艺相似，可 作为参考，估计出供试药的合理剂量范围。 4. 根据体表面积计算剂量 不论以何种方法选用的给药剂量(都应该通过预试，摸索到出现药理效应的适当剂量(最小或明显有效剂量)。 预试验的意义 1. 修正实验样本的种类和例数。 2. 检查观察指标是否客观、灵敏和可靠。 3. 改进实验方法和熟悉实验技术。 4. 探索药物剂量大小和量效关系，确定最小或明显有效剂量。 5. 发现值得进一步研究的线索。 13 6. 完善实验方案。 十、对照药的选择 1. 阳性对照药 即已知有效药，其目的有二:检查试验体系是否可靠，可用西药作阳性对照药;对比两药之优劣与特点。阳性对照药的选择应注意: (1)可比性:其药理作用、功能主治、剂型、给药途径与新药相似，两者才有可比性，便于比较新药的优劣与特点。 (2)合法性:阳性药应是《中国药典》或部颁标准、或新批准生产的合法药物，否则不可作为阳性对照药。 (3)择优选用:有多种同类药可供选用时，应择优选用当前学术界或社会公认有效的、有代表性的“好”药，作为阳性对照药;而勿选用疗效差，不良反应严重，甚至即将淘汰的药物。 2. 原剂型对照 改剂型新药的阳性对照药应以该药的原剂型为对照药，进行药效试验，以了解新药(新剂型)在那些方面优于原剂型。 3. 溶媒、基质或赋形剂对照 14 第二章 抗高血压药物的药效学研究思路与方法 陈 鹏 副教授 第一节 概述 进入21世纪，心血管疾病已超过恶性肿瘤成为威胁人类生命的头号杀手。心血管药物对增进健康，改善生活质量和延长寿命有着重要的意义。自20世纪八十年代中期，心血管药物就步入其研制开发的黄金阶段。进入本世纪，其主导地位更是不可替代。心血管药物是世界范围内用量最多，销售额最大的一类治疗药物，一直稳居各类药物之首。心血管药物也是新药研究中最为活跃的一个领域。据统计，平均每年进入临床研究的此类新药约有20余种，使心血管疾病的药物治疗达到了较高的水平。 第二节 抗高血压药物的药效学模型及评价方法 高血压的致病因子及其发病机制尚未十分清楚，但已知体内许多系统与血压的调节有密切关系，包括中枢神经系统，肾上腺素能神经，肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS) ，血管舒张肽-激肽-前列腺素系统，血管内皮松弛因子-收缩因子系统等。高血压还会起心、脑等重要器官损伤症，因此抗高血压药物研究时降低血压作用仅为指标之一，而减少器官损伤，特别是减少或逆转左心室肥厚也是研究的重要指标。 1.1肾血管性高血压大鼠模型的复制(也可直接购买自发性高血压大鼠) 健康大鼠，腹腔注射麻醉，仰卧固定，腹部剪毛消毒处理，腹正中线切口，钝性分离左肾动脉，取直径约0.3 mm的钢丝平行放置肾动脉处，用细线结扎后，抽出钢丝，左肾动脉造成部分狭窄，右肾动脉保持不动，缝合肌肉与皮肤，消毒处理，术后常规注射青霉素3天，自由进食饮水，5周后大鼠血压>20kPa(150 mmHg)者为造模成功。 1.2药物的降压作用探讨 选高血压大鼠，实验前1周每天定时测量血压1次，其均值作为药前值。于给药后0.5，1，1.5，2，3，4，6，8，12 h及1，3，6，10，14 d及停药后 15 3，7d在动物处于清醒状态下，通过小动物血压测量器测量鼠尾动脉血压，评价药物的降压效果。 1.3药物防治左室肥厚的作用及各项指标测定 大鼠断头处死，取心脏去除血液，滤纸吸干，称全心重;分离左心室，保留室间隔，称左心室重，计算心肌重量指数:全心重/体重、左室重/体重。 心室肌SOD含量测定:取左心室肌，冷生理盐水冲洗，置于生理盐水中制成10%的组织匀浆，4? 26000 rpm离心30 min，取上清液，试剂盒测定SOD。 心室肌MDA含量测定:取左心室肌，置于冷生理盐水中制成10%组织匀浆，试剂盒测定MDA。 心肌NO含量测定:取左心室肌，置于冷生理盐水中制成10%组织匀浆，1000rpm离心5 min，取上清液，试剂盒测定NO。 2+左心室肌Ca含量测定:取左心室肌300mg，加入硝酸和高氯酸混合液(4:1)3mL，与通风橱内加热湿消化、蒸干、冷却后加入3mL无离子水定容，取 2+定容液加释放剂锶(始浓度为2 mg/mL)， 原子吸收分光光度计测定Ca含量。 心肌纤维直径测定:取左心室肌，中性福尔马林固定，常规石蜡包埋，制成10 nm厚切片，HE染色，显微镜下放大400倍，每个标本计数20根肌纤维，取平均直径。 1.4中枢性与外周性降压机制的分析 猫腹腔注射麻醉后，仰卧固定于手术台上，颈部除毛，颈下部切口找出右颈总动脉，向下追踪到锁骨下动脉，结扎其上覆盖的颈外静脉切断，在其向内转弯处向下分离，可见发自锁骨下动脉的右椎动脉，结扎锁骨下动脉分支及远心端，分离左颈动脉插管，连接电生理系统记录给药前后血压值。 1.5神经节阻断试验 猫腹腔注射 麻醉，仰卧固定于手术台上。颈部正中切开皮肤，分离并插入气管插管，依次分离出右侧颈总动脉、外颈动脉、舌动脉。舌动脉插管，以备给药。外颈动脉夹动脉夹，将猫头固定，丝线一端穿过瞬膜边缘结扎系住，另一端连接在张力换能器上，由电生理仪引出刺激电极，与交感神经节前纤维和节后纤维分别连接，调节刺激参数为:连续A、波宽0.7 ms，频率I0HZ，电压4V，同时观察瞬膜变化(刺激节前纤维，观察瞬膜收缩反应;刺激节后纤 16 维，观察瞬膜收缩反应)。 1.6 α受体拮抗试验 兔颈动脉插管，电生理系统记录血压，股静脉注射肾上腺素0.1 mL，血压上升达稳定后记录血压升高幅度。血压恢复正常后给予药物，再次注射肾上腺素0.1mL，血压稳定后记录血压升高幅度。 1.7 β受体拮抗试验 兔颈动脉插管，电生理系统记录血压，股静脉注射异丙肾上腺素0.1 mL，血压上升达稳定后记录血压升高幅度。血压恢复正常后给予药物，再次注射异丙肾上腺素0.1mL，血压稳定后记录血压升高幅度。 1.8 利尿试验 雄性大鼠，预先置于代谢笼中1 d适应环境，观察自由饮水条件尿量是否稳定。试验前18 h禁食不禁水，应用Aston利尿筛选法，用药前按体重灌注去离子水2.2 mL/100g，使实验动物体内水平衡。收集2 h尿液，凡尿量超过40%水负荷者，可继续进行试验，对照组大鼠灌以1%生理盐水，试验组大鼠灌注含有药物的等量溶液，每小时收集尿液一次，连续观察6 h。 1.9 对RAAS的影响 去甲肾上腺素(NE)测定采用酶联免疫吸附法(ELISA);Ang?和ALD测定采用放射免疫法(RIA);心肌组织NE测定采用ELISA;心肌组织蛋白定量采用改良Lowry’s法。 17 第三章 抗缺血性心脏病药物的药效学研究思路与方法 沈志强 教授 第一节 概 述 缺血性心脏病(Ischemic Heart Disease，IHD)是由于心脏冠脉循环改变，引起冠脉血流和心肌需求之间不平衡而导致的心肌损害，包括冠状动脉功能性改变或器质性病变等引起的急性一过性或慢性冠状动脉供血不足等心肌缺血(myocardial ischemia)现象。属于中医学的胸痹范畴。主要表现发作性、持续短暂的心前区压迫性疼痛，可放射至左肩和上臂等部位。广义的缺血性心脏病包括因冠状动脉炎症(如风湿性、梅毒性)、栓塞、先天性畸形或功能性痉挛等引起的心肌缺血现象。 缺血性心脏病无论在发达国家，或在发展中国家均是重要的致残性和致死性疾病，它严重威胁着人类的健康。流行病学研究显示，多数西方发达国家(日本和法国除外)，在20世纪40,60年代期间IHD均呈显著增高趋势，进入20世纪70年代后，东欧和南欧的部分国家IHD发病率和病死率呈显著上升趋势。尽管与发达国家相比，我国的IHD发病率与病死率相对较低，但近年来在全国各地所进行的调查显示我国的IHD发病率与病死率均呈明显上升趋势，这已经引起了医学界的高度重视。 近年来的研究显示，本病最常见的病因是冠状动脉粥样硬化引起的冠状动脉狭窄和闭塞，血脂代谢异常、高血压病、糖尿病、肥胖或超重等是缺血性心脏病的危险因素。此外还与年龄、性别、不良饮食习惯、吸烟、遗传因素、精神因素及缺乏体力劳动有关。 随着科学技术的发展和各种诊断手段的进步，各种治疗措施已使缺血性心脏病的预后大为提高，急性心肌梗死的病死率有了大幅度下降，心绞痛患者的生活质量得到明显的提高。总的看来，药物治疗始终是缺血性心脏病防治过程中最为关键的问题之一，因为该病病因复杂，目前该病的药物治疗，仍然提倡联合用药。中医药治疗缺血性心脏病有着悠久的历史，但对中医药治疗缺血性心脏病的基础 研究仍有待加强和规范。 18 第二节 现代医药学研究 一、病因、病机 关于缺血性心脏病的发病机制，目前尚无定论。现有资料表明，缺血性心脏病主要与以下危险因素有关: (一) 血脂异常 脂质产生过多和(或)清除障碍均可导致血清脂质代谢异常，研究表明血脂异常与IHD的发生发展具有密切的关系。如长期的高胆固醇血症患者易患IHD，另外，血浆胆固醇升高常伴有低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)的增加，后者亦具有促进动脉粥样硬化的发生和发展作用。高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL) 则具有抗动脉粥样硬化的作用，IHD患者往往表现为HDL水平降低。动脉粥样硬化性损伤的特征性改变是脂肪纤维斑块，尽管纤维组织是脂肪纤维斑块的主要成分，但斑块中的脂质成分亦不少，后者主要是LDL-胆固醇和脂蛋白A(lipoprotein A)。 (二)高血压病 高血压病是IHD的又一重要危险因素，特别是舒张压升高更具有临床意义。正常动脉可随血压和(或)血流增加而扩张，而长期的高血压则可使血管硬化、顺应性降低。早期高血压病患者的血管病变经有效的抗高血压治疗，其损伤可以逆转，但随着病程的延长(特别是未经有效的降压治疗)，患者的血管壁可出现某些退行性改变，如血管硬度增加、扩张和扭曲;血管壁的弹性纤维层状结构亦可遭到破坏，并伴有纤维磨损和断裂等。上述结果往往不可逆转，血管壁代之以大量的胶原形成，后者可沉积于细胞内和基质层之间。因此，长期高血压引起的血管壁应力增加可导致血管壁退行性变，其结果是血管顺应性降低。另一方面，高血压病患者可因左心室后负荷的显著增加，引起左室心肌肥厚、舒张功能受害、代谢需要增加和心肌供血相对不足等，最终可导致左心功能衰竭。 (三)吸烟 吸烟是IHD最常见和最重要的危险因素。在男性吸烟人群中，中风、心肌梗死和间歇性跛行非常常见，每天吸烟20支以上的男性吸烟者发生IHD的危险性较非吸烟者高3,5倍。吸烟可以通过以下几个方面影响IHD的发生和(或)发展:导致动脉硬化、促进血栓形成、诱发血管痉挛、引起心律失常、破坏供氧平 19 衡等。 总体说来，缺血性心脏病除与以上因素有关外，还与糖尿病、年龄、性别、超重或肥胖及遗传因素、精神因素，饮食习惯等有密切关系。但最主要的原因是冠状动脉粥样硬化、冠状动脉血栓及冠状动脉痉挛，其共同特点是由于心肌供血不足所致氧的供需矛盾而发生的一系列病理生理改变。 二、药物治疗 目前，药物治疗的主要目的是改善心脏血管功能，增加心肌的供血供氧，降低氧的消耗，改善心肌代谢，缓解心绞痛，减小心肌梗死面积。常用药物主要有硝酸酯类(如硝酸甘油)、钙拮抗剂(如维拉帕米、硝苯地平)、β受体阻滞剂(如普 ++萘洛尔)等。另外，一些新型的抗心肌缺血药如Na/H交换抑制剂、血管紧张索转化酶抑制剂、特异性心率减慢药等正为临床所重视，且应用前景广阔。 第三节 研究思路 缺血性心脏病的主要原因为冠状动脉粥样硬化引起的冠状动脉狭窄和闭塞、冠状动脉血栓及冠状动脉痉挛，导致心肌供血不足而引发氧的供需矛盾，继而产生的相应的病理生理状态和临床表现。缺血性心脏发病机制复杂，防治的途径、方法及药物类型亦较复杂，因而需要进行的药效学实验较多。一般应以整体动物实验为基础，根据药物作用特点及实验要求，选择恰当的器官、组织、细胞和分子水平的实验及适宜的药效学实验方法和必要的观测指标，多层次实验相结合，以利于重复验证和阐明作用机理，从而获得科学的结论。 一、改善心肌代谢，减少心肌耗氧 缺血性心脏病的许多症状，如心悸、心慌、胸痛、憋气等均与心肌供血、供氧不足，心肌供氧与需氧平衡失调，心肌代谢紊乱等有关。因此，增加心肌血流量、降低心肌耗氧量、改善心肌代谢是治疗缺血性心脏病的有效途径。中药能有效的改善心肌代谢，减少心肌耗氧量，改善缺血性心脏病的症状。益心康胶囊可明显降低犬急性心肌缺血6 h和10 h的乳酸水平，可使缺血后冠状窦氧分压无明显降低，心肌氧摄取率也无明显增加，说明益心康胶囊可改善犬心肌缺血后心肌代谢，降低心肌耗氧量。精制血府胶囊可保护犬急性心肌缺血心脏的泵血功能， 20 降低心肌耗氧量、增加心肌供血。用结扎犬冠状动脉的方法制成急性心肌缺血模型，模型犬心脏收缩舒张功能减退、冠状动脉血流量及心输出量降低;十二指肠给药精制血府胶囊，上述各项指标均有一定改善，大剂量组更为显著，并可降低心肌耗氧量。地奥心血康能增加冠脉血流量(药后5 min较药前增加3l.4%)和心肌营养血流量、改善末梢循环(本品解除血管括约肌痉挛，使微循环畅通。其作用可能类似于莨菪阻断α、M受体的作用)从而增加心肌血氧供应;又能降低血压和总外周阻力(本品扩张外周血管及冠脉血管)、减少心脏负荷(药后5,l0 min较药前减少28.1%)，减缓心律，从而降低心肌耗氧量(药后10,30 min较给药前减少35.8,)的作用，改善心肌缺血。 二、扩张冠状动脉，改善心肌缺血 活血化瘀中药具有扩张冠状动脉，改善心肌缺血的作用。通窍活血汤可增加冠脉血流量，扩张冠脉血管，增加动脉血压、左室内压、dp,dt、心输出量及max左室作功，提高心肌收缩力，改善心肌缺血。复方丹参滴丸具有较好的抗心肌缺血作用，目前已通过美国FDA临床用药申请(IND)，临床用药实验证明，其主要成分丹参能够扩张冠状动脉，增加冠脉流量和改善心肌供血，抑制血小板聚集，从而有效治疗冠心病。 三、改善血流动力学 缺血性心脏病常见血流动力学各项指标的改变。血流动力学是研究心血管药物药理的基本手段，常以心脏泵功能、冠脉血流量以及心肌耗氧量等指标评价药物的药理作用。心血通颗粒(丹参、红花、延胡索、川芎等)具有活血化瘀，理气止痛的功效，实验研究表明其可显著降低犬动脉血压、减慢心率、降低犬左心室内压和最大上升速率、减少心肌耗氧量。还可显著增强心肌收缩力，延长心脏射血时问，改善心脏收缩功能。通心络胶囊有明显的抗心肌缺血作用，主要表现为增加冠脉血流量，降低冠脉阻力，增加心输出量，但对左室内压、左室内压最大上升速率(dp/dt)两指标均无明显影响。地奥心血康能调节心脏功能、改善心脏max 血流动力学指标;可使心率明显减慢，血压、心输出量、左室内压、左室作功、心肌耗氧量、冠状动脉阻力和总外周阻力下降，冠状动脉血流量增加，从而明显减少心肌缺血范围，减轻缺血损伤程度。用微米狭窄器造成犬冠状动脉前降支临界狭窄，可以发现左心室舒张压(LVDP)明显升高(P<0.05)，左心室收缩压(LVSP)、 21 室内压最大升降速率(?dp/dt)及心排出量(CO)等血流动力学指标明显降低max (P<0.05)，给血府逐瘀汤后，上述指标明显好转，表明心肌缺血造成的心脏功能损害减轻。 四、改善血液流变学 血液高黏滞状态是缺血性心脏病病理过程的中间环节。活血化瘀中药可明显改善血液的黏滞状态。结扎犬冠状动脉造成犬急性心肌缺血模型，一次性灌胃给药复方中药制剂降黏抗栓片I号(JNKST-1)。结果JNKST-1能降低全血高切、低切黏度和血浆黏度，加快红细胞电泳。注射给予山海丹可降低急性心肌缺血模型犬的缺血区局部静脉血的血液黏度、红细胞比容以及血浆纤维蛋白原的功能，改善局部缺血区的血液循环，减轻缺血程度，从而实现预防和治疗急性心肌缺血的作用。 五、调节离子通道 钙离子及其钙通道在缺血性心脏病的病理过程中具有重要作用，在缺血性心脏病临床上，钙通道阻滞剂的应用极为普遍。近年来国内外在中药对钙通道的影响方面进行了积极的探索。临床研究表明，冠心?号及丹参治疗心绞痛及急性心 a磺酸盐的钙内流阻肌梗死均有较好疗效。英国学者Patmare等研究，丹参酮? 2+滞作用，以离体豚鼠乳头肌观察其负性肌力作用，对细胞外Ca浓度与产生张力关系的作用及从除极的心肌细胞观察慢动作电位。实验观察到离体乳头肌产生的 2+拉伸张力与钙离子浓度显著相关，当Ca浓度在2,20 mmol/L的范围内时，均 -6-5 可呈现此关系;而1×10与1×10mol/L的丹参酮可剂量依赖性的抑制此关系。 2+增加Ca浓度可逆转丹参酮的负性肌力作用。国内对冠心?号方的另一组成药物川芎进行了比较深的研究，发现川芎嗪对离体乳头肌具有负性变力作用，阈值浓 -4 度为(2,4)×10g/mL，希氏束示有明显的负性变时作用，A-H间期平均延长29 ms，同样剂量也引起慢动作电位平台期及4期去极化进行性抑制，对平滑肌及主动脉和其它较大动脉条的收缩有松弛效应。以上反应可被细胞外钙离子浓度的增加所逆转。 第五节 研究方法 一、实验动物选择 22 目前，用于缺血性心脏病研究的动物以大鼠、家兔、家猫、犬、猪等最为常用。在研究缺血再灌注性心律失常时还经常用小鼠、豚鼠等，偶有用进化比较高级的狒狒、猩猩、猴进行实验研究;而在进行高脂血症和动脉粥样硬化研究时，以家兔、鹌鹑、大鼠较为常用。 二、动物模型 (一) 冠状动脉阻断或缩窄形成心肌缺血和心肌梗死模型 1. 原理:通过阻断或缩窄冠状动脉方法，如结扎、电刺激、气囊法、血管内异物法及注入凝血酶或ADP法等，减少或停止供应区的血流，形成心肌缺血，心肌因缺血、缺氧而发生代谢紊乱，以至发生心肌坏死，建立动物模型。 2. 方法:犬或小型猪心肌缺血及心肌梗死模型。健康成年犬或小型猪，雌雄均用，体重l0,15 kg，经戊巴比妥钠(30 mg/kg)静脉麻醉，手术台固定，分离气管并插管，连接呼吸机，调节潮气量300,600 mL，动脉氧分压维持在90,100 mmHg，血pH在正常范围;左侧第四肋间开胸，暴露心脏，剪开心包，做心包床;分离冠状动脉左前降支中段(一般相当于第三分支根部)，可用以下几种方法阻断冠状动脉，形成心肌缺血。 4 cm丝线以备结扎，或用动脉 (1)冠状动脉结扎法:在冠脉分离处穿一3, 夹临时夹闭阻断，一般多用于急性心肌缺血实验。 (2)冠状动脉血栓形成法:将弧型针状电极(刺激电极)置于分离的冠状动脉下，另一电极(参考电极)距刺激电极0.6 mm处置于心外膜下，两电极分别连接电刺激仪的隔离器正负极，以2 5 V、1 mA直流电刺激冠状动脉30 min左右，冠状动脉内血栓形成，阻断冠状动脉血流，诱发心肌缺血。 (3)冠状动脉气囊压迫法:压迫环由有机玻璃外套和可膨胀的乳胶小囊构成，外套长5 mm，侧面有1 mm的缝隙，血管由此进入腔内，小囊长3,4 mm，一端密闭，一端与直径1 mm、长40 cm的塑料管相连，并充满蒸馏水，经塑料管注水30,40 ,L使小囊膨胀以压迫套内的血管，当压力击除时，小囊恢复原状，冠状动脉重新通畅，适用于急性和慢性心肌缺血或再灌实验。 (4)Ameroid缩窄环法:为了形成慢性冠状动脉闭塞、心肌缺血或观察冠状动脉侧支循环的变化，可将一具有吸水性的塑料环(Ameroid环)套在冠状动脉左旋支根部，关闭胸腔后，由于塑料环吸收组织膨胀，环外壳系硬质材料做成，限制 23 环的外展，结果压迫冠状动脉，形成心肌缺血，环植入4,6周，血管内径可缩小80%,90%。 (5)清醒动物心肌缺血试验:可将气囊压迫环固定在冠状动脉适当部位，然后缝合心包，放置心包膜电极，气囊的导管和电极的导线分别穿过胸壁引出皮外，逐层缝合关闭胸腔。实验时可注人蒸馏水，使气囊膨胀，压迫冠状动脉造成心肌缺血，同时测量心外膜电图合其他观测指标，本法可反复阻断冠状动脉，进行多次清醒动物的心肌缺血实验及再灌注损伤实验。 (6)缺血再灌注损伤:在心肌缺血一定时间造成心肌损伤后，再供血一定时间，可加重心肌损伤而形成再灌注损伤，用此法可观察药物对心肌再灌注损伤的保护作用。 3. 注意犬和小型猪是建立心肌缺血模型最常用的动物，其体积大小适中、性情温顺、易于训练，其心脏解剖及生理特点与人相似。其影响因素有:动物冠状动脉分支及侧支循环有个体差异，对分支及侧支变异大的、不合标准的应剔除不用。各组动物模型心肌缺血程度和范围应接近;正式实验之前应熟练掌握动物开胸手术和冠状动脉分离手术，尽量减少出血;做心包床时，心脏不应移位而影响心脏的正常舒缩功能;实验时应严格控制心外膜电极的位置、压力，心脏表面的温度、湿度及位置;心外膜电极放置的位置，或反复测定的位置应准确固定，不应移位;电极对心脏表面不可压力过大，心脏表面的温度及湿度应稳定，其变化不应超过0.5?，不可干燥，否则将影响实验的准确性;实验可注射给药，但口服中药应消化道给药，消化道给药又可灌胃给药或十二指肠给药，灌胃给药时，注意动物提前8,12 h禁食;在进行本项实验时一定要严格控制实验条件，排除干扰因素，确保实验结果的可靠性，必要时应同步监测血氧、pH值等。 (二)药物诱发心肌缺血模型 1. 原理:近年研究认为，冠状动脉痉挛是导致心肌急性缺血的主要原因之一，可致心绞痛、心肌梗死和猝死。通过药物诱发冠脉痉挛法，如垂体后叶素、异丙肾上腺素、麦角新碱在整体动物(犬、小型猪、兔、豚鼠、大鼠)心脏上造成冠脉痉挛，急性心肌供血不足，及外周阻力增加，导致心脏负荷加重，形成心肌缺血，建立动物模型，评价抗心肌缺血药物的疗效。 2. 方法 24 (1) 脑垂体后叶素诱发心肌缺血模型:取体重200 g左右健康大鼠，腹腔注射乌拉坦麻醉，仰卧固定，将针状电极插入四肢及胸前心尖搏动处皮下，调节心电图灵敏度至l mV=l5 mm，纸速为50 mm/秒，可同时连接心电示波器连续观察心电图变化，记录胸前导联或?导联心电图。实验前如有心电图或心律失常等异常变化，则弃去不用。根据所试药物特点选择适当给药途径和间隔时间，静脉给药后1-5 min，腹腔注射后15~30 min，灌胃后1,2 h，经舌下静脉或尾静脉注射脑垂体后叶素0.5(或0.7) U/kg，注射5 (或10) s。注射后即刻、5、10、15及30 s、1 min、2 min及5 min，重复记录心电图(记录时间可据示波器所示异常情况决定)。正常大鼠注射脑垂体后叶素后心电图变化可分两期:注射后即刻至30 s，T波升高，ST段抬高(超过0.1 mV)，尤以10 s左右变化最为明显。注射后30 s至数分钟，T渡低平，双相、倒置，心率变慢，P-R及Q-T间期延长。判定标准:以出现第一期或第二期缺血性变化为阳性，否则为阴性，比较各组的差异，并做统计学处理。 (2) 异丙肾上腺素诱发心肌缺血模型:健康大鼠、小鼠、豚鼠、家兔、猫或犬均可。经心电图检查，弃去心电图有异常改变或心律失常者。大鼠、豚鼠和犬每天皮下注射异丙肾上腺素8 mg/kg，家兔10-16 mg/kg连续两天，第一次和第二次给异丙肾上腺素后30 min内，每隔5 min记录心电图1次，第二次给药后24 h记录心电图后杀死动物，取心脏做病理切片检查。异丙肾上腺素可引起T波倒置或双相，伴有ST段抬高，窦性心动过速(心率明显加快)，早搏或伴有其它心律失常。心肌病理观察可见:白细胞和巨噬细胞浸润，心肌纤维肿胀、断裂、横纹消失、甚至溶解、发生玻璃样变和脂肪变性等。比较各组心电图和病理变化，以判断药救。 (3) 麦角新碱诱发心肌缺血模型;健康犬，体重10~20 kg，戊巴比妥钠30 mg/kg注射麻醉，自右侧股动脉插人导管至左侧脉主干开口内，以麦角新碱 0.22 mg/kg(溶于生理盐水10 mL中)，1 min内注入，可形成冠脉痉挛及心肌缺血。 3. 注意:脑垂体后叶素能收缩全身(特别是内脏)小血管，其作用是非特异性的;异丙肾上腺素为β受体兴奋剂，其诱发心肌缺血模型适用于调节心肌代谢、氧供需平衡及作用于受体药物的研究;麦角新碱可诱发明显的冠状动脉痉挛和血流动力学改变，其造成的心肌缺血模型可用于评价通过缓解冠状动脉痉挛、改善血液 25 流变性等多种途径防治心肌缺血的药物。 (三)心肌缺血再灌注损伤模型 1. 原理:心肌经一定时间缺血(缺氧)后，突然恢复血(氧)供，会造成更严重损伤，即“心肌缺血再灌注损伤”。其形成原因可能与钙离子超载、自由基损伤、中性粒细胞黏附浸润等有关，心肌缺血再灌注损伤模型既可用于整体动物，又能用于离体灌流心脏和体外培养心肌细胞。 2. 方法:在体心脏心肌缺血再灌注损伤模型。实验可用多种动物，如犬、小型猪、猫和大鼠等。大鼠经戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉，呈背位固定，气管插管后连接人工呼吸机，胸部去毛、消毒后，沿左锁骨巾线纵行切开皮肤，在第4或第5肋间钝性分离肌层，打开胸腔，剪开心包，轻压右侧胸廓，挤出心脏。在左心耳和动脉圆锥之间表浅冠状静脉的下方结扎左冠状动脉前降支，结扎冠状 动脉40 min后打开结扎，施行再灌注，造成急性实验性心肌缺血再灌注损伤模型。 3.注意:整体动物实验应注意心肌缺血范围要适中，范围过大，再灌时易发生室颤而死亡。离体心脏实验时要严格控制灌流液温度及心脏环境变化在?0.2?，所试药物pH值及各种无机离子浓度要在正常范围内。中药粗制剂不宜作离体试验和试管内给药。 (四) 离体心脏心肌缺血模型 1. 原理:通过结扎离体心脏冠状动脉、离体心脏低氧或无氧灌流法形成心肌缺血，建立心肌缺血模型。 2.方法:大鼠离体心脏Langendorff灌流实验。实验一般用成年Wistar种雄性大鼠，腹腔戊巴比妥钠45 mg/kg麻醉，仰位固定，分离一侧股静脉，注入肝素125 U/mL/只，剪开胸壁，暴露心脏，在主动脉第一支头臂动脉发出处近端横断，速将心脏投入4?改良灌流液Krebs-Hank液中，冲洗冠状动脉中的残留血液，将心脏移到灌流装置下端，开始灌流。Langendorff灌流装置一侧为K-H液进行正常生理灌流;另一侧为含诱发心肌缺血的垂体后叶素(40 U/L)及一定浓度药物的K-H液，同时进行造模及给药灌流。通过旋转三通变换灌流液。待心脏跳动规则后，在肺动脉起始处剪一小口，以利冠状血管回流液排出;将一蛙心夹夹在心尖部，连一机械电换能器，接载波放大器，连接记录仪。将心脏固定在灌 26 流装置，正常生理灌流3 min后进行同步心率刺激(实验中持续进行)，将心率调整为300次/min，10 min后，调整记录仪，使心脏收缩幅度为20 mm，进行给药灌流30min，记录给药前、给药后5、10、15、20、30 min心率及心脏收缩幅度并测定冠流量。 3.注意:操作必须迅速准确，如摘除心脏、动脉插管等操作，要求从处死动物至开始灌流要在2 min 内完成，防止缺血缺氧时间过长导致心肌损伤;灌流液必须新鲜配制;要严格控制灌流液温度及心脏环境温度变化在?0.2?，灌流液的氧分压必须控制在允许的范围内，所试药物pH值及各种无机离子浓度要在正常范围内。中药粗制剂不宜作离体试验和试管内给药。 (五)体外培养心肌细胞缺血样损伤模型 1. 原理:利用体外培养的大鼠乳鼠心肌细胞，通过暂时停止供应心肌细胞赖以生存的氧和葡萄糖，以及在一定时间后再恢复供糖和供氧，即可造成心肌缺血缺氧和,或再灌注损伤模型。该模型可用于观察不同药物和处理方式对细胞生理功能、生化代谢、能量代谢、形态结构等变化的影响，从细胞水平评价药物的保护作用。 2. 方法:心肌细胞缺血样损伤模型。取新生1,4天的Wistar种大鼠乳鼠，雌雄不限，无菌条件下开胸取心脏，剪去心房取心室肌，用Hank’s液洗净组织 3上残留积血，将其剪成1 mm大小的碎块，用胰蛋白酶或胶原酶消化分离心肌细胞，以含20,小牛血清的DMEM培养基混匀，制成细胞悬液，根据实验要求调 66整细胞浓度为5×10,l0/mL，接种于培养瓶或培养板中，置CO培养箱中培养。 2每2,3天更换细胞培养基，取培养3,8天的单层细胞进行实验。培养好的细胞用缺氧的Tyrode’s液洗3遍，加入缺氧的Tyrode’s液，移人缺氧室(CO:N=5:2295，体积比)，持续一定时间即可造成心肌细胞缺血样损伤。或缺氧培养一定时间后，换用混合空气饱和的DMEM培养基正常培养一定时间，即可造成再给氧损伤。 3.注意:细胞培养期间需要密切注意pH值变化;培养瓶或培养板放入培养箱的前12 h尽量避免移动，否则会影响心肌细胞贴壁生长。 (六)对心脏血流动力学及心肌耗氧量影响的研究 1. 原理:心肌缺血往往伴随心脏血流动力学改变，大部分治疗缺血性心脏病 27 有救的药物，均可明显改善血流动力学而发挥作用。因此，心脏血流动力学指标应作为主要药效学研究内容。实验动物可用犬、小型猪、猫或大鼠，但后两种动物心脏较小，某些指标不宜直接观测，而犬和小型猪应作为首选动物。 2. 方法:健康犬或小型猪，雌雄兼用，体重1 2,15 kg。实验动物用戊巴比妥钠(30 mg/kg)静脉麻醉，手术台固定，分离气管并插管，连接电动呼吸机，调节潮气量300,600 ml，动脉氧分压维持在90,100 mmHg，血pH在正常范围;左侧第四肋间开胸，暴露心脏，剪开心包，做心包床;分离冠状动脉左旋支及主动脉根部。放置相应直径电磁流量计探头，分别测量冠脉血流量及心输出量。左心室尖部插管，连接压力换能器，测定左室内压，再经微分器测定左室内压上升最大速率。颈外静脉插管至冠状静脉窦，颈动脉插管，以血氧测定仪或血气分析仪分别测定冠状静脉窦血氧含量及动脉血氧含量，计算心肌耗氧量。股动脉插管测定动脉血压，以肢体导联观测标准?导心电围并计算心率。公式计算其它血流动力学指标:心搏出量、耗氧指数、心脏指数、冠脉阻力、总外周阻力及氧利用率等。 3.注意:本实验难度较大，要具备成套精密仪器设备。实验人员要经过严格训练，手术期间尽量减少对心脏功能的影响。分离主动脉根部及冠状动脉、放置相应电磁换能器、冠状静脉窦插管、心尖部插管等是手术成功的关键。 三、客观指标 药效学实验观测指标是检验药物作用于实验对象发生药理反应的特定标准，其可以是生理机能及形态的变化，也可以是代谢的改变。缺血性心脏病的研究可供选择的观测指标很多，范围很广，选择合理的符合要求的观测指标，才能准确无误的反映药物对实验对象的影响。 (一)心肌缺血与梗死范围的测量方法 1. 形态学方法:测定心肌缺血与梗死范围常用的形态学方法主要有两种:一是大体标本染色法，N-BT染色、TTC染色或双重染色，用病理图像分析软件加以分析，可以定量心肌缺血与梗死范围，目前该方法是国际上常用的、公认的测量方法。二是组织切片法，该方法相对费时费力，但能弥补大体染色法精确度不高的特点，光镜下可观测心肌病变程度和范围，电子显微镜可观察包括细胞膜、线粒体、内质网、细胞核及染色质等心肌细胞超微结构的改变。 28 2. 心外膜电图标测法:阻断或缩窄冠状动脉形成心肌缺血及心肌梗死，以多点心外膜电图标测心肌缺血程度和范围的变化。 3. 酶学方法:测定血中磷酸肌酸激酶(CPK)、乳酸脱氢酶(LDH)等与心肌损伤相关的酶类变化，动态观察心肌损伤情况，定量分析心肌损伤程度。 4. 核示踪法:将对心肌坏死有亲和力的物质进行核素标记来观察心肌缺血和梗死情况。 5. 荧光照相法:用表面荧光照相来分析缺血区情况。 6. 其它分析方法和指标:心肌代谢指标，如心肌氧代谢、其它物质及能量代谢(如FFA、ATP、PGI、TXA、cAMP/cGMP、NO、ET、SOD、MDA、乳酸、22 钠、钾、钙、镁离子、血凝状态及血液流变性)等。 (二) 心脏功能及血流动力学 心功能及血流动力学试验观察指标应包括:心电图、心率、动脉血压、冠脉流量、冠脉阻力、心输出量、心肌收缩力、左室做功、左室内压、左室内压最大上升速率、中心静脉压、左室射血的张力指数、左室作功指数、心搏出量、心脏指数、心搏指数、总外周阻力等，并可同时测定心肌耗氧量、氧利用率、耗氧指数等。无创性心功能检查:如超声心动图、阻抗图、γ照相等。 (三) 心肌细胞缺血样损伤 1. 形态学在光学显微镜下可观测如伪足变化、胞浆空泡形成、胞浆颗粒增加、异形(长形、纺锤形)心肌细胞的出现率等。在扫描或透射电镜下观察超微结构的变化。 2. 心肌细胞搏动的变化包括搏动的频率、节律及强度等。 3. 胞浆酶的变化如LDH、CPK、,-羟丁酸脱氢酶、转氨酶等的变化。 (四) 冠脉循环实验 冠脉循环实验主要考察指标为:冠脉血流量、返流量、返流压、冠状静脉窦血流量、心肌营养血流量、心肌区域血流量、冠脉侧支循环情况等。 (五)心肌氧代谢情况 主要考察心肌耗氧量、心肌氧张力、张力时间指数(TTI，PTI)、心肌耗氧指数、正性肌力作用等。 (六) 与缺血性心脏病相关的分子生物学研究 29 随着现代生命科学的迅猛发展，缺血性心脏病的研究越来越深入，药物对目前发现的与缺血性心脏病相关基因表达影响的研究正逐渐增多，但这些方面的研究应该慎重，最好能结合整体动物实验来说明问题。 (七) 其它指标 由于中药常具有多方面作用，或通过多种途径达到治疗目的，因此可结合实验选择以下指标:(1) 血小板聚集性;(2) 血栓形成及溶栓情况;(3) 血液流变学指标:血液黏度、血浆纤维蛋白原含量、红细胞压积、红细胞沉降率等血液流变学指标等。 30 第四章 防治中风药物药效学研究思路与方法 沈志强 教授 第一节 概 述 中风(Apoplexy)又称脑卒中(Stroke)、脑血管意外(Cerebrovascular Accident)，是各种血管性病因所引起的脑部局灶性损害的综合征，可分为出血性和缺血性两大类，包括脑梗死、脑出血和蛛网膜下腔出血等。属于中医学“中风病”范畴，主要临床表现为突然昏仆、半身不遂、口舌歪斜、言语不清或不语、偏身麻木等症状。 中风是老年人的常见病、多发病，具有发病急、发展快、变化多、发病率高、致残率高、复发率高和病死率高等特点。中风的发病率在世界范围内存在明显的地域差异，世界卫生组织流行病学调查显示，中风的发病率男性为101,10万,285,10万，女性47,10万,198,10万。中国的发病率较高，男性为242,10万，女性为173,10万。中风发病率随年龄的增大而显著升高，发达国家65岁以上的老年人口的比例逐年增加，而发展中国家在今后20年内60岁以上的老年人口的比例将增加1倍，这种状况加剧了中风发病率的增长。中风的病死率在近几年内虽略有下降，但仍然居高不下，在世界范围内中风为第二死因，28天内病死率男性为15,,49,，女性为18,,57,，也存在明显的地域差异，在中国为男性28,，女性37%。而在中风的存活者当中，只有10,的病人可完全恢复正常功能，48%的病人有偏瘫，22,的病人无法行走，24,,53,的病人完全或部分生活不能自理，给患者家庭和社会带来沉重负担。近年来，随着人口老龄化程度的加剧，中风已成为备受关注的社会问题。 总的来讲，要强调预防重于治疗的理念。一旦发病，特别要重视24 h内的重点监护与全身性支持疗法，防治发热、呼吸道感染、消化道出血、高血压和高血糖等常见并发症，配合一些针对缺血或出血的特殊治疗，然后是康复治疗与预防复发的防治措施。出血性中风因其出血可直接破坏脑组织，同时血肿挤压周围结构，引起脑组织水肿、颅内压增高，甚至继发脑组织缺血、坏死而导致死亡。急性期应控制脑水肿，脱水降低颅内压，控制并发症。恢复期应控制血压，预防 31 复发。缺血性中风占中风患者的80,，是各种原因导致脑动脉血流中断，局部脑组织缺氧、缺血性坏死的产生与发展而出现相应的神经功能缺损。在急性期，主要通过溶栓治疗，尽早再灌注，阻止缺血损伤。但随之发生的缺血再灌注损伤却无法避免，因而如何干预脑缺血再灌注所触发的一系列导致神经元损害的病理性生化级联反应，进行有效的神经保护治疗一直是研究的重要课题。由于缺血性脑损伤机制的多重性和瀑布效应，单独使用一种神经保护剂是不够的，但采用多种神经保护剂阻断多条损伤途径，则可能因副怍用叠加而使其有利作用抵消。因此寻找副作用小且具有多种脑保护效应的药物是今后研究的重点。多年来，中医界对中风病做了大量研究工作，中药新药开发研究取得了一定进展，但高教、速效、低毒的中药新药仍很少，尚需继续努力。 第二节 现代医药学研究 一、病因、病机 病因: 缺血性中风脑栓塞最为常见。动脉粥样硬化是引起脑血栓形成最常见的原因，以至于最新的脑血管疾病分类将脑血栓形成更名为“动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞”。 动脉硬化的发生与血管内皮细胞损伤、血脂过高、高血压以及血流动力学异常有关。发生动脉粥样硬化的病因被认为与血脂过高，特别是一种叫做低密度脂蛋白—胆固醇(LDL-C)的物质含量过高有关。也与生活方式、营养和遗传因素有关，如吃进的食物中含脂肪(肥肉、油脂)、碳水化合物(糖、淀粉等)过多;体力活动过少;肥胖、有高血压、糖尿病及其家族史(父母或/及兄弟姐妹有同样疾病)等。最新的研究发现，动脉粥样硬化与载脂蛋白等基因突变有关，后者是一种与脂肪代谢有关的蛋白质。 动脉粥样硬化是一种全身性的血管疾病，发生在不同的器官便产生相应的疾病.如供应心脏的冠状动脉发生动脉粥样硬化就会得冠状动脉硬化性心脏病(冠心病)。脑动脉发生动脉粥样硬化主要在供应脑部的大、中动脉，最容易发生狭窄的部位在颈部颈总动脉分叉处、椎动脉进入颅腔处、以及基底动脉起始和分叉处。由于血管内膜的破溃、脂质沉积形成斑块，血液中的血小板、纤维蛋白沉积 32 在斑块上面并发生机化，造成血管壁增厚、血管腔变窄，导致脑供血不足。如果病变进一步发展，血管腔严重狭窄甚至完全闭塞，或在狭窄的基础上由于血液粘稠度高(俗称血稠)，在斑块上形成血栓堵塞血管，便可发生这根血管供血区的脑细胞缺血坏死。 较少见的引起脑血栓形成的病因 各种动脉炎症，如感染性动脉炎(结核性、寄生虫性、脓毒性等)、胶原病性动脉炎(如一种叫做系统性红斑狼疮的疾病)、血管闭塞性脉管炎等。各种疾病引起的高凝状态，如慢性肺部疾病患者由于长期缺氧所造成红细胞异常升高、怀孕早期的妇女由于呕吐脱水加之雌、孕激素的升高造成高凝状态都可能诱发脑血栓形成。此外，有一种少见的以红细胞增多为特点的疾病叫“真性红细胞增多症”，得这种病的患者也容易患脑血栓形成。 人们对脑缺血的发病机制认识经历了慢长的过程。最初，对脑缺血损伤的认识主要集中在缺血后脑血流减少、缺血缺氧、能量代谢障碍等方面;至20世纪80年代后期，兴奋性毒性作用的研究，使缺血性脑损伤的机制研究又有了进一步的深入。另外，自由基大量产生、细胞内钙超载等也相继被发现与缺血后继发性损伤具有密切的关系。近年随着对凋亡分子机制研究的深入，人们发现神经细胞凋亡在脑缺血损伤机制中也占有非常重要的地位。 可见，脑缺血损伤是一种复杂的病理过程，其发病机制涉及脑组织能量代谢紊乱、兴奋性氨基酸毒性、自由基损伤、钙超载、神经细胞凋亡等多个环节。 病机: (一) 兴奋性氨基酸 兴奋性氨基酸(EAAs)是中枢神经系统主要的兴奋介质，主要兴奋N-甲基D-天门冬氨酸(NMDA)受体、氨基-3-羟基-5-甲基-4异噁唑丙酸(AMPA)受体、海仁藻酸(KA)受体。 谷氨酸(G1u)是脑内主要兴奋性递质，能激活EAAs受体的各种亚型。在Glu持久释放，突触后兴奋作用持久加强的作用下，可能通过以下两种机制导致神经元损伤:?渗透性损伤，这是早期的快速兴奋毒性反应。脑缺血后神经细胞膜持 +续去极化，Na通过K,Q受体偶合通道(即AMPA和KA受体门控的离子通道) 33 - 大量内流，Cl在静电电势驱动下进人细胞，于是水大量内流造成神经元急性肿 2+2+胀;?Ca相关损伤，这是与Ca内流有关的延迟性损伤，可触发胞质生化级联反应，诱发凋亡的产生。 (二) 自由基损伤 氧自由基(Oxygen free radical，OFR)可以与生物大分子尤其是生物膜上不饱和脂肪酸反应，形成脂质过氧化物，破坏膜结构。脑组织脂质含量较高，因此对OFR的损伤尤为敏感。 脑缺血时由于氧自由基的生成和清除系统的平衡被打破，产生大量自由基。?自由基攻击细胞膜，改变细胞膜的通透性，激活膜蛋白酶和磷脂酶，产生游离脂肪酸，溶解磷脂，并导致花生四烯酸的释放，破坏细胞膜。?自由基打开电压 2+依赖性钙通道，使细胞内Ca超载。?自由基引发的脂质过氧化还造成细胞成分间的交联:脂质-脂质交联，蛋白-蛋白交联，脂质-蛋白交联，蛋白-胶原交联，使整个神经元丧失了功能。 2+(三) Ca超载 2+ Ca是神经细胞信息传递的重要第二信使，对维持神经细胞正常代谢与功能起着重要的调控作用。近年来的研究表明，钙离子与神经细胞的死亡过程有着密切关系。钙离子如果在细胞内堆积，即钙超载，是神经元继发性损伤的主要原因 2+之一。大量Ca进入细胞引起神经递质释放，神经细胞过度兴奋，加剧能量消耗。 +钙超载可增加膜对K的通透性，进一步引起细胞去极化，导致神经元长时程的 2+过度兴奋性。另外，过量Ca破坏线粒体的电子传递链，终止ATP产生，使乳 2+酸大量堆积，加重脑组织酸中毒。Ca超载还干扰神经细胞蛋白质代谢、脂质代谢，使蛋白质代谢异常，脂质分解增加，脂质膜变薄，流动性降低，通透性增高， 2+细胞发生肿胀。此外，Ca可直接影响脑微血管舒缩功能，损害血脑屏障，产生血管源性肺水肿。 (四) 炎症 脑缺血时，由于缺血组织产生大量可扩散兴奋介质，激活外周血白细胞诱导中性粒细胞(PMN)上的CDl8增加PMN和内皮细胞上的黏附分子表达而促进PMN的黏附和聚集，并激活局部血管内皮细胞(VEC)激活的PMN、VEC黏附性明显增加，加之缺血区的灌注压力明显下降，导致白细胞牢固黏附于血管内皮细 34 胞表面。PMN的黏附、集聚所产生的血液流变学效应可影响半暗带的供血，从而加重组织损伤。同时，PMN活化浸润过程中发生呼吸暴发，氧耗量增加2,20倍，超过90%的氧被消耗，生成大量氧自由基，释放出毒性产物和破坏性的蛋白酶，损害局部血管导致血管通透性增强，造成组织水肿。PMN在活化后还产生、释放血小板活化因子(PAF)，亦可增加血管通透性。再灌注时，进入组织的白细胞可进一步释放上述毒性物质，激活脑内巨噬细胞——小胶质细胞，而激活的小胶质细胞通过释放神经毒性物质又吸引更多的白细胞进入组织。 (五) 血小板激活 脑缺血后血小板澈活已经被许多资料所证实。脑组织缺血后，血小板激活，黏附于血管内层弹力板，加重血管痉挛，造成局部脑血流供应更加不足，脑缺血加重。而由缺血引起的血液流态改变，血液黏度的增加，可形成微小血栓，激活的血小板与红细胞、白细胞等极易沉积于血管分叉等血流速度较缓的部位，形成血栓。 血小板激活后释放5-HT、TXA、PF(血小板第?因子)、,-TG等活性物质24 引发血管收缩、血栓形成或血小板聚集，这些物质一方面加重局部微循环障碍，另一方面还可直接损伤神经细胞。研究认为PAF和TXA对脑组织的损伤作用与2 增加脑缺血后氧自由基的产生有关。 (六) 神经细胞凋亡 近年研究发现了很多与细胞凋亡相关的信号途径，如一些细胞因子、生长因子、肿瘤坏死因子(TNF)将存活或凋亡信号从胞外传递到胞内，再通过特定的信号途径，调控细胞凋亡进程。在这些信号途径中与缺血性脑损伤联系比较密切的是半胱氨酸天冬酶家族、Bcl-x家族和P53等蛋白酶家族。 半胱氨酸天冬酶是凋亡程序的启动和执行过程中的一大类蛋白酶家族，直接参与了凋亡的间相互作用参与凋亡的调节和执行。根据Bcl-2对细胞凋亡的作用，分为相互对立的两大类蛋白;?抑制凋亡的bcl-2、bcl-XL。等;?促凋亡的bax、bak、bcl -Xs等。 P53与脑缺血后基因表达调控关系比较密切，P53是一种抑癌基因，它有两种类型:野生型P53和突变型P53。野生型P53促进细胞凋亡，而突变型P53促使细胞增殖。野生型P53在正常细胞内监视DNA状态，若DNA受损则表达增 35 加，终止增殖，使细胞获得DNA修复的时间;如DNA受损无法修复，则P53蛋白表达持续升高，引起细胞凋亡。 二、药物治疗 (一) 抗血小板药 随着人们对血小板活化、聚集、黏附、释放及其在血栓形成过程中作用的深入认识，近年出现了许多特异性较强、毒副反应较少的抗血小板药。目前研究较多的主要集中在抑制花生四烯酸代谢的药物、影响环核苷酸代谢药物以及血小板受体拮抗剂等几类。如环氧化酶抑制剂阿司匹林;合成酶抑制剂Ridogrel、Ifetroban;TXA/PGH受体拮抗剂噻曲司特、达曲班;磷脂酶抑制剂盐酸阿的平;2 影响环磷苷酸代谢的药物Limaprost等;血小板受体拮抗剂阿昔单抗;ADP受体拮抗剂噻氯匹啶等;血小板激活因子受体抑制剂银杏苦内酯B (BN-52021)等。(二)溶血栓药 包括单链脲激酶(ScuPA)、茴香酰化纤溶酶原链激酶激活复合物(APSAC)、组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、重组葡激酶(r-SAK)等。在急性缺血性脑中风应用溶栓治疗有应用前途，但有颅内出血危险，因此应十分谨慎。 (三)抗凝血药 包括肝素和低分子肝素，水蛭素、华法林。脑梗死后抗凝治疗的早期报告出血发生率较高，脑血栓用抗凝治疗至今有争论。一般认为，栓塞性脑梗死反复发作是抗凝治疗适应证。 (四) 降低脑水肿和颅内压的药物 常用速尿和甘露醇，但不能长期应用。低分子右旋糖酐作为血液稀释治疗，临床效果尚未肯定。国内有报告使用低分子右旋糖酐引起急性肾功能衰竭。 (五) 脑(神经)保护剂 1(钙拮抗剂:主要包括尼莫地平、尼卡地平、依拉地平、尼群地平等。 2(自由基清除剂:目前正在进行研究的有Tirazad(V74006F);超氧化物歧化酶(SOD)及其类似物(PEG-SOD)等其它可能抑制氧自由基的药物亦在评价中。 3(兴奋性氨基酸(EAAs)拮抗剂:包括NMAD受休拮抗剂如MK80l，Dextrophan(DX)、Cerestat、CGSl 9755、Eliprodil正在进行临床试验;谷氨酸释 36 放抑制剂Bw-619C89、罗吡唑(1ubelazdle)。 (六) 治疗慢性脑血管病和脑中风后遗症的药物 这类药物以改善脑代谢为主，有些也可改善脑循环作用。目前在临床试用的这类药物有:麦角碱类包括氢化麦角碱，麦角滨烟酯，二氢麦角隐亭，银杏叶，长春西汀，艾地苯醌，吡咯烷酮类包括脑复康和阿尼西坦，二苯美伦，脑活素。蒺藜总苷(心脑舒通)，藻酸双酯钠，丁基苯酞(NBP)。 (七) 抗凋亡的药物 目前已有caspase-1和caspase-3抑制剂，CrmA(作用于caspase家族门冬氨酸位点)、IAP和NIAP(凋亡蛋白抑制剂)。神经营养因子包括一组对神经细胞起特殊作用的多肽分子，主要包括神经生长因子(NGF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子-3、4、5等。实验证明，NT-3可对抗脑缺血引起的神经细胞捌亡。另外，PARP抑制剂3-氧基苯甲酰胺可减轻短暂脑缺血后脑组织损伤。钙调磷酸酶阻滞剂(环孢菌素A，FK506)可减少钙调磷酸酶介导的神经元凋亡。 第四节 研究思路 中风是各种血管性病因引起的脑部局灶性损害的综合征，药效学研究应从增加缺血区脑血流量(溶栓、改善血液流变学、抗血小板聚集和抗凝、扩张脑血管)、神经保护作用的方面进行。 一、增加缺血区脑血流量 (一) 溶栓 缺血性中风多数是由于局部脑血管堵塞(血栓或栓塞)，导致脑组织缺氧缺血性坏死而出现相应神经功能缺损，起病后早期溶栓治疗是恢复梗死区血流的主要方法，可挽救半暗带区尚未死亡的神经细胞，限制梗死范围。许多活血化瘀中药有促进纤溶的作用。补阳还五汤能降低血栓形成后动脉血中血小板活化因子含量，提高血栓形成的堵塞时间值，降低血栓干重和血栓-体重指数，对动脉血栓的形成和发展有抑制作用。有些中成药如脑血康口服液、复方丹参注射液、生脉注射液等有促进纤溶的作用。 (二) 改善血液流变学 近年来通过改善血液流变学的异常从而达到预防和治疗缺血性中风的研究 37 得到了迅速发展。血液流变学的变化对循环血液的流动性和黏滞性，血液的有形成分红细胞和血小板的聚集性和变形性，以及无形成分血浆和血清的流动性和黏滞性等有重要影响。改善某些血液流变学指标的异常，可阻断或缓解疾病的发生发展，主要措施有:影响和调整红细胞比容、改善红细胞变形性、抑制红细胞和血小板的聚集性、降低血浆黏度等。银杏胶囊能使缺血性中风患者血液流变学指标(全血高切比黏度、低切比黏度、血浆指数、凝血因子、血细胞比容等)明显下降。华佗再造丸可使缺血性中风患者全血高切比黏度、低切比黏度、红细胞聚集指数、血浆比黏度及凝血因子等血液流变学指标明显改善。脑血康口服液、脉络宁注射液、复方丹参注射液、葛根素注射液、生脉注射液等都有降低血黏度，改善血液流变学作用。 (三) 抗血小板聚集和抗凝 缺血性中风常因颅内动脉的闭塞，使局部脑血流量减少而发生。这一过程的开始往往激发血小板的活化及聚集，凝血过程活化而加重神经组织的损害。在急性缺血期抗血小板聚集和抗凝治疗可促进动脉的侧支循环，防止血栓的延伸，进而缩小梗死灶的范围。缺血性中风患者血小板聚集功能均有不同程度的增高，而且TXA的含量明显增加，TXB,PGI处于失衡状态。川芎能抑制血浆中,-TG 222 (,-血小板球蛋白)、PF(血小板第?因子)及TXB含量，使TXB,PGI恢复相对4222的平衡。补阳还五汤具有抑制凝血酶刺激血管壁、释放?因子的作用，并可抑制凝血酶凝固纤维蛋白原的活性。脑血康口服液、复方丹参注射液、血塞通注射液、血栓通注射液、灯盏花注射液、葛根素注射液和生脉注射液等中药制剂都有抗血小板聚集的作用。 (四) 扩张脑血管 梗死灶小、无明显脑水肿的缺血性中风可用扩张脑血管的方法，增加缺血区供血供氧，改善脑循环。川芎嗪注射液、灯盏花注射液、葛根素注射液有扩张脑血管的作用，改善局部供血。 二、神经细胞的保护治疗 神经保护治疗的目的是提高神经细胞对任何原因引起的内环境紊乱的耐受力和抵抗力，使神经细胞在病理环境中的生存能力增强。缺血性中风时，梗死区缺血及再灌注使局部自由基产物增多，脂质过氧化，加重血管内皮细胞损伤，使 38 内皮细胞水肿，通透性增加，加重脑组织损伤。内皮细胞内钙离子超载及白细胞内皮细胞黏附的增强是再灌注损伤的另一重要改变，上述改变可加剧微循环障碍，使脑组织坏死加重。神经保护治疗针对缺血性中风的主要病理机制，对缺血性脑损伤的生化和代谢紊乱通过药物阻断细胞坏死不同环节，增加细胞的存活能力，促进神经功能的恢复。刺五加注射液能使急性不完全性脑缺血家兔脑内自由基浓度降低，超氧化物歧化酶水平升高，促肾上腺皮质激素和皮质酮浓度下降。清开灵可对抗大鼠谷氨酸所致脑组织水钠含量的增加，减轻谷氨酸神经毒性所致皮层细胞及海马细胞形态结构的损伤，具有抗谷氨酸神经毒性的作用。灯盏花注射液可防止大鼠脑缺血,再灌注诱发的蛋白激酶C的激活、钙超载，可防治钙超载所诱发的一系列病理生理反应，减轻缺血再灌注所致的神经元损伤。新加天王口服液可阻止脑缺血模型大鼠脑内兴奋性氨基酸的大量释放，明显升高脑组织NOS活性和血清NO浓度。 第五节 研究方法 一、实验动物的选择 防治缺血性中风药物研究常选用大鼠，也选用猫、兔、小鼠、沙土鼠等动物制造全脑或局灶性脑缺血模型。 二、动物模型 (一)局灶性脑缺血动物模型 1(原理:人类脑血管病多发生在动脉某一分支，尤以大脑中动脉(MCA)最为常见，局灶脑缺血模型与人类脑梗死通常由单一脑动脉闭塞所致的情形相同，以手术或其它物理、化学方法阻断大鼠大脑一侧MCA，或阻断一定区域的血液供应，即可形成局灶性脑缺血模型。 2(方法 (1) 开颅机械闭塞法:经颞部开颅暴露大脑中动脉(MCA)并电凝阻断MCA，从而产生相应部位的梗死灶。为研究不可逆性脑缺血提供可靠的动物模型。应用套线或微动脉夹可制备脑缺血再灌注模型。这种开颅机械闭塞MCA的模型在一定程度上模拟了人类一侧大脑半球缺血性梗死的状况，为临床治疗提供理论依据。同时该模型全身影响较小，存活时间长，适于脑缺血后长期的神经运动功能 39 缺损及治疗介入和康复策略的研究。注意:手术过程中容易出血，并使相毗邻脑组织产生损伤;有潜在的脑脊液瘘形成;同时由于对血管的过多操作及继发血管痉挛可影响缺血后的侧支循环。 (2) 血管内栓线阻断法:采用4,0号尼龙单丝线或国产尼龙鱼线，头端加热成圆球形，直径约0.3 mm，经硅化后晾干备用。尼龙线由颈总动脉(CCA)分叉处切口导入或经颈外动脉(ECA)插入，经颈内动脉(ICA)入颅内分叉部时，即可阻断流入MCA的血流，如拟复通，则可抽回尼龙线，恢复MCA血流，实现再灌流。这种模型缺血部位恒定，且可进行再灌注，模拟了人类永久性及短暂性局灶性脑缺血的不同状态。由于对缺血及再通时间能进行准确控制，因而便于分析神经元对缺血的敏感性和耐受性，便于评价再灌注作用以及治疗时间窗的选择。同时该模型勿需开颅，术中不会引起血压、体温、血气的异常变化，对全身影响小，避免了开颅对颅内环境的影响。因此，有学者认为该法将逐渐取代开颅闭塞法。但是，该模型成功率、梗死面积、蛛网膜下腔出血(SAH)发生率、动物早期死亡率等方面各个实验室不尽相同。学者们认为与动物的品系和体重、尼龙线粗细及头端大小、插入深度上的差异、插线时用力大小等有关。为避免实验结果的不稳定性，发挥这一独特MCAO模型的普遍适用性，应对该方法的各种易变因素加以严格的标准化。 (3) 化学刺激诱导血栓性闭塞法:FCl局部浸润动脉可使血管内膜剥脱，内3 膜下组织暴露，从而引起动脉内血栓形成。按Tamura的方法暴露位于嗅束和大脑下静脉之间的一段MCA，置一小片塑料薄膜保护血管周围组织，将吸有50.0% FeCl溶液10 ,L的小片定量滤纸敷于MCA上并保留30 min至血栓形成。此模3 型的建立为抗血栓药的筛选研究提供了较好途径。但是也存在开颅带来的弊端。 (4) 内皮素1(ET-1)灌注诱导血管收缩法:ET-1是目前已知的作用最强的血管收缩活性物质之一，由内皮细胞产生。在中枢神经系统，ET-1除通过其强烈持久的缩血管作用使rCBF减少促进梗死形成外，还可直接损伤神经元及胶质细胞，诱发中风。将清醒鼠固定，经定向导管向MCA管腔周围的脑实质内灌注微量ET-l，10 min后，rCBF减少93%以上，24 h后产生类似于MCA永久闭塞后脑缺血性损害的特征。缺点是该法需要开颅手术，ET-1来源有困难。 (5) 微栓子栓塞法:自颈外动脉(ECA)向CCA逆行插管并注入大鼠自体血凝 40 块碎片或硅酮微球、炭粒微球与生理盐水配制的混悬液，可造成颈内动脉(ICA)系统，主要是MCA供血区的缺血性损害，梗死灶位于同侧大脑皮质、基底节及海马等部位。这种栓塞性脑梗死模型很接近人类自然梗死现象，成功率高，手术创伤较小。但存在诸如不能预见缺血部位和范围、不能控制再通、对侧亦可能受累以及可能导致外源物质引起的炎症反应等缺点。故此法仅限于一些特殊研究的应用，如溶栓治疗及血小板微血栓形成后的脑病理改变研究等。 (6) 光化学诱导血栓形成法:大鼠麻醉后，用立体定位仪固定其头部，将光敏物质(如荧光紊、玫瑰红等)尾静脉注入，在特定波长(560 nm)照射皮层区域5,10 min，发生光化学反应产生单链氧自由基，继而破坏血管内皮细胞膜的完整性，导致血小板聚集及血栓形成，皮层缺血坏死这种方法具有下述优点:脑梗死形成与人类血栓形成性脑梗死的发病过程相似;可预知和控制脑梗死的部位、范围和深度;损伤性较小、存活率高;方法简便、重复性好，短时间内可完成较多样本的制作。尤其适用于某一特定脑皮层损伤后神经行为学、病理形态学和神经生化学改变的定量动态分析以及脑保护剂的量效评价。此法由于光敏物质的导入，对研究全身血液循环系统的变化增加了复杂因素;并且阻塞主要发生在终末小血管，而非人类脑血栓形成的代表特征;加之由于动脉末端阻断，故使得该模型不适于对提高侧支循环药物疗效的评价。 (二) 沙土鼠脑缺血模型 1(原理:由于沙土鼠的解剖特点——没有联系颈内动脉系统和椎基底动脉系统的后交通动脉，不能构成完整的Wills动脉环。因此结扎一侧或双侧颈总动脉，可造成局部或完全性脑缺血模型。 2(方法:结扎沙土鼠单侧或双侧颈总动脉，即可造成局部或完全性脑缺血模型。 3(注意:手术简便易行，模型稳定，但动物来源和饲养不易，动物体重小，不便测定神经损伤指标，且常出现惊厥。 (三) 全脑缺血模型 1(原理:以手术方法阻断大鼠大脑血液供应，造成大鼠全脑缺血，即可形成全脑缺血模型。 2(方法 41 (1) 大鼠两动脉阻断缺血模型:双侧颈总动脉阻断加上放血或药物降压，形成前脑缺血模型。其成功率较高，易于操作，可用来进行脑血管通透性和生化指标(LA、IDH、SOD、MDA、ATP酶等)测定，缺点是麻醉药及降压药会使结果的分析与判断变得较为复杂。 (2) 断头缺血模型:于清醒小鼠脑后2 mm处迅速断头，产生全脑缺血。由于脑的氧耗量占全身耗氧量的五分之一，且脑组织本身几乎没有贮氧和贮能的能力，完全依赖血流供给氧气和葡萄糖。因此小鼠断头后，脑供血中断，能量代谢发生紊乱，脑内三磷酸腺苷(ATP)和磷酸肌酸(PC)迅速耗竭，葡萄糖(G1u)水平迅速下降，而乳酸(LA)明显升高，并出现脑细胞功能障碍。但在脑死亡之前，动物仍有张口呼吸的动作，并可维持一段时间，直至脑死亡。可进行组问比较，适用于药物筛选。 (3) 大鼠四动脉阻断缺血模型:结扎大鼠双侧椎动脉并夹闭双侧颈总动脉，造成全脑缺血，或在一定时间后，开夹重灌，可造成脑缺血性或再灌注性损伤。四动脉阻断缺血模型的优点是可产生严重的全脑缺血。缺点是个体差异大，成功率较低，模型稳定性较差。 (4) 太鼠三动脉阻断缺血模型:即阻断双侧颈总动脉及一侧基底动脉，形成全脑缺血模型。其稳定，成功率较高，但手术创伤较大，易使延髓受损。 3(注意:全脑缺血模型对脑以外的其它脏器影响较大，与人类脑梗死通常由单一脑动脉闭塞所致的情形不同，且无法进行健侧与患侧的自身对照研究。临床上常见于心脏骤停、大出血、脑复苏等急症之后，较局灶性脑缺血少见。 三、客观指标 (一) 脑梗死范围 为局灶性脑缺血模型所考察的重要指标。常采用TTC染色，显现梗死区，用称重法、图像分析计算脑梗死范围;也可直接用透光法测定脑梗死范围。 (二) 神经症状 观察缺血前后及给药前后神经症状的变化。大鼠神经行为分级评分通常采用Bedersonn法、我们在其基础上简化为4级分析法对动物进行行为评分: 1(提鼠尾离开地面约一尺，观察前肢屈曲情况。如双前肢对称伸向地面，记为0分;如手术对侧前肢出现肩屈曲、肘屈曲、肩内旋或既有腕肘的屈曲又有 42 内旋者，记为1分。 2(将动物置于平滑地面上，分别推双肩向对侧移动，检查阻力。如双侧阻力对等且有力者记为0分;如向手术对侧推动时阻力下降者，记为1分。 3(将动物两前肢置一金属网上，观察两前肢的肌张力。双侧肌张力对等且有力者为0分;手术对侧前肢肌张力下降记为1分。 4(提鼠尾离开地面约一尺，动物有不停地向手术对侧旋转者，记为1分;否则，记为0分。根据以上标准评分，满分为4分，分数越高，动物的行为障碍越严重。对行为检测打分值进行组间比较，t检验。本法减少了人为因素更为实用准确。 (三)脑血流量或区域性脑血流量 在形成全脑缺血或局灶性脑缺血模型时，动物脑血流量(CBF)或区域性脑血流量(ICBF)降低。以不同时间点正常动物脑血流量的升高或模型动物脑组织血流量的恢复，来评价药物的作用强度、起效时间及持续时间。常用脑组织血流仪(氢气清除法)，电磁血流量计、激光多普勒血流量仪、超声多普勒脑血流仪测定。其中激光多普勒血流量仪、脑组织血流仪用于测定脑组织血流量，电磁学流量计、超声多普勒脑血流仪用于测定所选血管的血流速度，间接反映血流量的多少。 如结扎正常犬颈外动脉和椎动脉或只结扎颈外动脉，将电磁流量计置于颈内动脉，可以此反映犬脑血流量的变化。此法仪器较为普及，在测定脑血流的同时可计算出脑血管阻力，并可同时监测药物对血压、心率、心电图等的影响，具有简便、准确、重复性好及能连续进行测定等优点，便于判断药物起效的时间点。 近年来，激光多普勒血流仪也用于测量动物脑组织血流:将探头垂直置于大鼠大脑皮层组织表面，连续记录皮层组织血流变化，测得数值以反映脑半球血流的变化;或深入脑组织，测量脑内特定部位血流量。但此法易受多种客观因素影响，如探头位置的变化，探头周围的亮度、探头周围的血管大小，探头与皮层的距离等。 (四) 脑组织含水量 脑缺血后，脑血管通透性增加，形成脑水肿。应观察药物对脑血管通透性及脑水肿的影响。 (五)脑内神经递质 43 脑内神经递质(包括谷氨酸、多巴胺、去甲肾上腺素等)的改变，可作为评价药物作用的参考指标。 (六) 脑组织生化指标 包括能量代谢和毒性产物，如三磷酸腺苷、磷酸肌酸、乳酸、乳酸脱氢酶、自由脂肪酸、脂质过氧化物、兴奋性氨基酸 (EAA)及基因表达等。 (七) 脑电图(EEG) 用于全脑缺血时，确定脑缺血的形成及再灌脑血流恢复正常的时间。 (八) 神经细胞病变程度 应进行定性、定量组织学观测。 (九) 微循环试验 脑梗死后局部血流动力学异常，导致微循环障碍。治疗缺血性中风的药物应能改善微循环障碍。因此，微循环障碍的改善程度可作为评价缺血性中风药的辅助指标之一。通常采用静脉注射高分子右旋糖酐而造成脑膜微循环障碍，观察软脑膜血液流速、流态;亦可用紫外光荧光素或伊文思蓝激光造成脑血管微血栓，检测微血管管径、微血管自律运动、微血流速度、微血管通透性、微血管网络结构、微血栓大小、微血栓形成时间等。前法简便易行，后法特异性较强，但方法较复杂。 (十) 血小扳聚集性试验 血小板聚集性增强是造成血液循环障碍导致脑缺血发生的重要原因之一。药物对兔或大鼠血小板聚集性的影响可作为药效学研究的辅助指标。可用比浊法或其它方法，诱导剂有二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)、胶原、凝血酶等。 (十一) 血栓形成试验 血栓形成是直接导致脑缺血的重要因素之一。药物抗血栓形成和溶栓作用应作为评价缺血性脑血管病药物的辅助指标。通常用电极刺激法观察药物对体内血栓形成时问(OT值)的影响;用大鼠颈总动脉颈外静脉血流旁路法或Chandler血栓形成法，测定血栓的干重、湿重及长度。 (十二) 凝血时间、凝血园子的测定 脑梗死的发生与血栓的形成密切相关。干扰血液的凝固过程，对抑制血栓的形成，减轻脑梗死的范围有一定意义。通常测定凝血时间、凝血酶时间(TT)、凝 44 血酶原时间(PT)和部分凝血活酶时间(APTT)。 (十三) 血液流变学试验 脑梗死发生前后都会有血液流变学的改变，因此测定血液黏度、血细胞比容、红细胞聚集性、红细胞变形性及纤维蛋白原含量等指标，对评价药物的作用有重要意义。 (十四) 耐缺氧试验 耐缺氧是药物提高脑组织耐缺氧能力、改善脑能量代谢的重要机制之一。方法可选用组织中毒性缺氧和小鼠常压、低压缺氧等方法。 (十五)溶栓试验 观察药物对体内血栓的溶解作用。 第五章 抗动脉粥样硬化药物的药效学研究思路与方法 陈鹏 副教授 45 第一节 概 述 动脉粥样硬化(atherosclerosis, AS)的发病机理非常复杂，目前被普遍接受的Ross修正的“损伤反应”学说认为，内皮细胞功能障碍是动脉粥样硬化形成早期的始动环节。内皮细胞的损伤、血脂的沉积和血小板粘附所释放多种生长因子的作用，可激活内皮细胞和动脉中层的平滑肌细胞，使之大量合成并分泌多种生长因子，使自身和周围细胞大量增殖。增殖的平滑肌细胞还可迅速合成胶原等细胞外基质，通过以上多种因素复杂的相互作用，最终形成动脉粥样硬化。因此在抗动脉粥样硬化药物研究中以下指标必须考虑:血管内皮损伤为始动环节，LDL为必备条件，炎症参与全过程。 临床表现主要是受累器官不同程度缺血。脑AS可引起脑缺血、脑萎缩或造成脑血管破裂、出血:冠状AS若管径狭窄达50,以上，则可产生心绞痛、心肌梗死(AMI)及心律失常，甚至发生猝死。远端肢体缺血可致下肢间歇性跛行、肢端溃疡、坏疽、严重时须截肢。 病理特点是受累动脉内膜有类脂质沉着，复合糖类积聚，继而纤维组织增生和钙沉着，并有动脉中层病变。主要累及大中型肌弹力动脉(主动脉、冠状动脉及脑动脉多见)，常导致管腔闭塞或管壁破裂、出血等严重后果。大致分脂质条纹期和纤维斑块期。发病机制目前尚未完全清楚，主要有脂肪浸润学说、损伤应答反应学说、炎症感染学说等。 AS是严重危害人类健康的常见病、多发病之一，多见于40岁以上男性、绝经期后女性以及脑力劳动者。我国近年有明显增加趋势，并随年龄增长而增，例如在40,49岁的人群中，检出率分别为58.36,和88.31%，因而，抗AS药研究日益受到重视。 预防应针对病因，摒弃不健康生活方式，如贪吃、少动、吸烟、酗酒、精神紧张等。由于AS为缓慢隐匿性发展，可长期无任何症状，因此早期常不引起人们注意。一般20岁左右即开始有脑动脉弹性减退趋势，40岁后逐渐明显，50岁后会出现早期症状，故要预防或避免AS早期发生，最好应从儿童时期开始，养成健康生活方式和良好生活习惯。治疗应发挥患者主观能动性，做到合理调配膳食(低脂、低胆固醇)，保持心理健康，适当进行体力活动并戒烟、限酒及减少含糖食物摄入等。药物防治应在医师指导下长期进行，西医多采用调节血脂、软 46 化血管、改善微循环等药物;中医则采用活血通络，祛湿化痰等方剂。 第二节 现代医药学研究 一、病因、病机 (一) 脂质浸润 给动物喂饲富含碳氢和脂肪的饮食，可引起与人类AS相似的血管病变。高脂血症可引起血管内皮细胞损伤和灶状脱落，导致血管壁通透性升高，血浆脂蛋白(LP)进入内膜，其后引起巨噬细胞清除反应、VSMC增生和斑块形成。Anitschkow(1925)的浸润学说、Rossle(1943)的渗入学说以及Doerr(1963)的灌注学说，都是在这样基础上建立的。 病理变化先动脉壁出现楼板样斑块，而CH和CH酯是构成斑块的主要脂质。血浆中CH、甘油三酯(TG)和磷脂是与载脂蛋白结合成LP而溶解和运转的。LDL含CH和CH酯最多;极低密度脂蛋白含TG最多;高密度脂蛋白含蛋白最多。血浆中增高的脂质以LDL和VLDL，或经动脉内膜表面LP脂酶作用而分解成残片，侵入动脉壁。LP到中膜后，堆积在VSMC间、胶原和弹力纤维上，引起VSMC增生，并和来自血液的MC吞噬大量脂质成为泡沫细胞;LP又降解释出CH、CH酯、TG和其它脂质。LDL还与动脉壁的蛋白多糖结合产生不溶性沉淀，刺激纤维组织增生，最终形成斑块。LP中HDL可将CH送到肝脏分解、抑制细胞摄入DL和抑制VSMC增生，因而有抗AS作用。脂质过氧化可产生脂质过氧化物，有细胞毒作用，可损伤细胞膜，促进AS形成。 (二) 损伤应答 1(生长因子(growth factor，GF):饮食、机械、免疫、毒素、病毒等多种病因均可引起VEC损伤，使之分泌GF，吸引MC黏附于内皮，迁入其下间隙，摄取脂质形成脂纹并释放血小板源样生长因子(PDGF)。脂纹可直接演变为纤维斑块，或由VEC脱落而引起血小板黏附。血小板、大单核细胞及血管内皮细胞均可产生GF，刺激中膜VSMC增生。增生病灶内VSMC也可分泌PDGF，使VEC受损，随之刺激中膜VSMC迁人内膜，这种相互作用导致纤维斑块形成并继续发展。如VEC长期反复损伤，将导致脂质不断沉积和VSMC持续增生，经一系列复杂连锁反应和恶性循环而形成AS。 47 2(血管重塑:是细胞——增殖与凋亡失衡，细胞外基质——合成与降解调控障碍结果，也是血管内径和血管壁厚度的一种适应性表现，分结构和功能两种变化，前者包括VSMC增殖、迁移及VECM合成增加;后者包括顺应性降低、对血管活性物质反应性改变等。血管重塑在AS、高血压和血管再狭窄发生与发展过程中起重要作用。 (1) 基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase, MMP):是分解VECM蛋白酶 2+2+类的总称，可水解基底膜及VECM，其活性依赖于Zn和Ca。VECM降解，对启动VSMC迁移和增殖是必要的。循环中巨噬细胞和血小板，先黏附于损伤内膜下，并释放大量细胞因子和PDGF，这些因子一方面刺激VSMC增殖并分泌大量VECM，另一方面又刺激VSMC和VEC合成MMP，以促进细胞摆脱VECM束缚而迁移。由于细胞增殖和VECM沉积，与MMP所致VECM降解之间失去平衡，最终导致斑块形成。因此，AS斑块形成过程实际是VECM的重建过程。 (2) 骨桥蛋白:是VECM中一种重要功能性糖蛋白，在AS斑块形成和血管再狭窄发生发展中起重要作用。参与VR的细胞因子中(PDGF、bFGF、EGF、 、IL-1均能刺激VEC和VSMC中骨桥蛋白过度表达。不仅AS和再狭窄TGP-p 病变部位的VEC和VSMC内骨桥蛋白表达升高，而且VECM中骨桥蛋白含量也明显增加。 3(热休克蛋白(heat shock protein，HSP): HSP 是VEC损伤后产生的一个重要因子，与平滑肌增殖相关。应激反应时有一定数量的热休克基因表达，生成大量HSP，其功能多样，有的作为自身抗原引发血管壁免疫反应，启动AS形成(如HSP);有的则起保护作用，帮助细胞渡过应激阶段(如HSP)，这些作用决定65/6070了AS进程。HSPs在AS疾病中作用复杂。最近报道，清道夫受体(scavenger receptor，SR)吞噬氧化型LDL(OX-LDL)，是一种细胞毒物质，当与MP表面的SR结合时，会使细胞应激而产生HSP。 (三)炎症感染 1(炎症:早期AS病变是白细胞浸润和水肿，其中炎性细胞因子和黏附因子起重要作用。VEC可表达可溶性细胞间黏附因子并辅助巨噬细胞及T细胞进人血管壁。巨噬细胞从VEC移入内膜成为MP，通过OX-LDL变为FC。 48 2. 感染 (1) 肺炎衣原体(PC):可引起AS并可使病变过程加速。体外培养的人MP能摄入一定量脂类物质，如细胞感染PC，摄入量更大。许多感染MP在形态学上都极似AS斑块中FC，病变中存在调节MP的肿瘤坏死因子(TNF)及MMP表达的PC HSP，其作用与AS及其并发症有关;VEC感染PC后，对中性粒细胞及MC通透性增强。曾对PC有效的抗生素可减少冠心病(CAD)发病率。小规模试验也证实，抗生素能够降低CAD发病率，这就从另一方面支持PC是引起AS的原因之一。 (2) 幽门螺杆菌(HP):用聚合酶链反应(PCR)法已在AS斑块中扩增出HP基因片段。 (3) 巨细胞病毒(CMV):用原位杂交等方法发现，AS斑块中存在CMV-DNA，且抗体滴度与与内膜增厚有关。 (4) 其它微生物;艾滋病、柯萨奇、EB、单纯疱疹及风疹等病毒感染可能与AS有关。 (四)受体缺失 1( LDL受体:家族性高CH血症是常染色体显性遗传病，患者由于细胞表面LDL受体功能缺陷而导致血浆LDL水平升高。 2(VLDL受体:其低效率调节对VLDL引起AS发病可起一定作用，如经纤维酸衍生物类降脂药吉菲罗齐处理后，兔腹膜后脂肪组织中VLDL mRNA水平升高6.9倍。消化道平滑肌中升高3.7 倍。 3( SR:体外研究表明，SR-A能介导MP大量摄取修饰LP，使CH酯在细胞内聚集，形成FC。在人、兔和鼠的AS斑块中均有SR-A表达，提示其与AS斑块形成密切相关。 4. 雌激素受体 (1) 抑制VSMC增生:可能通过原癌基因起作用，也有认为是类固醇受体参与抑制生长。 (2) 促进VEC合成NO:雌激素能通过诱导VEC或VSMC产生NO来扩血管，给ER拮抗剂可抑制这些作用;还能降低绝经妇女血脂水平和LDL,HDL比值，从而发挥抗AS作用。但动物研究提示，单用血脂变化不能圆满解释雌激 49 素的抗AS作用，其对AS的有益效应，50,,75,源于非脂质因素。 5(雄激素受体:低雄激素血症可导致AS并预示AMI发生。此外，男性睾酮水平与PAI-l、胰岛素和FG呈负相关，与HDI-C正相关;男性睾酮水平降低还与糖尿病、高葡萄糖血症、高CH血症、高TG血症、高血压、肥胖及凝血?因子增加等心血管危险因素有关，而给予睾酮治疗可降低这些危险因素。 (五)血栓形成与血小板 动脉内膜表面血栓形成，继之被增生的VEC覆盖，血栓中血小板和白细胞崩解而释出脂质和其它活性物质。TXA能对抗血管壁合成的前列环素，促使血2 管收缩和血小板聚集。 二、药物治疗 1(他汀(statin)药:为3一羟3一甲戊二酰辅酶A还原酶抑制药(HMG-COA reductase inhibitor)，能抑制CH合成，加速LDL廓清，使血CH和LDL下降。也可使TG和VLDL下降，而HDL和Apo A?增高。 2(贝特(fibrate)药:降TG作用强于降CH，并使HDL增高;有减少组织CH沉积、降低血小板黏附性、增加纤溶活性和减低FG浓度等抗血凝作用。 3(阿司匹林:小剂量阿司匹林可抑制TXA生成，较少影响PGI产生。 22 4(硝酸酯类:在AS和冠心病心肌缺血中发挥重要作用，不仅改善心脏血流动力学，调整心肌供氧与耗氧平衡，修复VEC功能，尤对发生在冠脉内大传导血管的AS和冠脉狭窄扩张作用最强。外源性供给NO，可在血管局部发挥抗血小板黏附、聚集，抗VSMC增殖、迁移，抗炎性细胞浸润，抗氧自由基损伤等作用，并拮抗血管紧张素?(AT?)和内皮素(ET)，使AS延迟发生，阻止AS和VEC功能减退之间相互影响、相互加重的恶性循环，维持残存VEC功能，防止AS进一步发展。目前认为，台用硝酸酯类、ACEI、HMG-COA还原酶抑制剂和抗血小板药(阿司匹林)对改善VEC功能更有利。 第三节 研究思路 一、调整血脂和Apo 高血脂与中医痰证(痰浊为病证候)十分相似，表现头晕、胸闷、胸痛、心障、肢麻等症状。临床和实验研究已证实，脂质异常变化可作为痰证辨证客观指标。 50 患者血液呈高黏滞性，血液流变性及PL功能改变与血瘀证相一致，并是血瘀证微观辨证重要指标，鉴于中医单纯血瘀理论不能很好解释AS病变过程，因此，可用痰浊血瘀相关理论阐述其形成机制，指导调脂并抗AS中药药效学研究。 近年来，在HL和AS基因治疗方面又有重大突破，即基因转移。关键是必须将外源基因准确导入靶细胞，并在其中高效、长期、稳定表达。Wilson等对渡边遗传高脂血症兔肝细胞进行人LDL受体基因重组逆转录病毒载体传导，并将含有人LDLR全长cDNA逆转录病毒载体LTR-LDLR与ASOR和多聚赖氨酸结合，构成能将LDLR基因转移至肝细胞转运系统，通过Apo- A、ApoE基因传导并增强其表达，对受遗传影响较多的Apo(a)从基因水平减少其表达，或将反义寡核苷酸(OND)、反义RNA表达载体导入VSMC以抑制其表达，从而防治HL和AS。 二、提高过氧化物酶(peroxidase，PO)活性和保护VEC VEC功能和结构改变是AS发生的始动环节，而LPO是VEC损伤主要危险因素，尤其OX-LDL能诱导不同细胞生理功能变化，包括MC,MP形成FC，PL聚集释出多种PL因子，VEC损伤，VSMC内脂质累积或形成FC，VSMC增生损伤，血管痉挛等，导致脂肪斑形成和促进AS发展。机体内PO可清除氧自由基，抑制LPO，保护VEC，减轻AS形成。有人比较研究了活血化瘀(水蛭、 川芎)、健脾化痰(半夏、陈皮)和痰瘀同治三种中医治法对实验性HL。家兔主动脉内膜脂斑形成及脂质水平的影响发现，血中TC、LDL-C含量越高，LPO浓度越高，脂斑形成百分率越高，脂质代谢紊乱越重。血中TC、TG及LDL-C含量升高，LPO累积可能是血管内膜受损及脂斑形成主要原因;而痰瘀同治法降低血清TC、LDL- C，抑制脂斑形成和抗LPO作用最强。 三、抑制VSMC和内膜增殖增厚 AS以VEC损伤为始动因素，VSMC增殖、迁移、吞噬脂质是AS形成主要环节。有人利用空气干燥法建立大鼠动脉损伤模型，观察丹参注射液对动脉去内皮后内膜增生以及对培养家免，VSMC的增殖作用发现，可抑制内膜增厚，体外 3可剂量依赖性抑制H-TdR摄取，减少DNA合成。 四、抑制和消退AS斑块 AS斑块发展是一动态过程，其病理改变大致分早期脂质斑块和后期粥样斑 51 块。AS模型动物斑块，在停止CH高脂食物和接受药物治疗后，呈消退性变化。有人综合国内外文献报告指出，人类AS斑块亦有消退可能，活血化瘀药能阻止AS病变进展或促进其斑块消退;用水蛭治疗家兔AS后，斑块内胶原纤维增生明显，CH结晶减少，斑块消退明显，其机制与水蛭降脂、调整6- keto-PGF,1,TXB平衡有关。 2 第五节 研究方法 一、实验动物选择 家兔:因兔和猪AS模型容易获得、价格便宜、操作简单，故常为首选动物。兔最常用于制造HL和AS模型，对外源性CH吸收率高，对高血脂清除能力低。给高脂饲料经3,4个月即可形成明显AS，但兔为食草动物，脂质代谢与人差异较大。病变主要在胸主动脉，尤其弓部，冠状动脉病变主要在小动脉，而人主要在冠状动脉大分支。兔抵抗力差，易继发感染而死亡。 WHHL是日本渡边于1974年从白色种兔中发现的一只HL变种，经传代筛选于1979年获得成功，为目前惟一有LDL受体缺陷的动物。脂质代谢异常是其主要特征，出生时即表现HL，幼龄时自发形成AS、AMI和黄色瘤，症状与家族性HL患者极其相似，其结合台血中LDL能力仅为正常兔5,。血中CH浓度是正常兔25倍以上;VLDL、中密度脂蛋白(IDL)和LDL，也大大高于正常兔浓度，特别LDL高出正常兔76倍以上)。 大鼠:有饲养方便、抵抗力强，食性与人相似等优点。单纯在饲料中加CH不易引起血清CH升高和AS，必须在饲料中加人胆酸以增加CH吸收。如再加抗甲状腺药物，可使血清CH进一步升高，所形成病变与人早期相似，因不易形成似人的后期病变，故一般不用作抗AS药研究。 鹌鹁:有个体小、实验消耗药品量较少，饲养、管理、采血和给药方便等特点。高脂喂饲2周形成HL，6,8周AS斑块发生率达80,,90,，动脉病变与人类早期脂肪斑相类似。主要病变在动脉分叉处严重，局限于内膜。 鸡:仅在普通饲料中加入CH就可形成AS斑块，病变发生较快。 猴:正常血脂及AS病变与人近似，一般认为，猕猴更理想。给高脂饮食1,3个月，血清CH升高同时AS发生。 二、动物模型 52 (一)家兔高胆固醇饮食致动脉粥样硬化模型的复制:健康雄性家兔64只，体重1.8,2.0 kg，随机分为6组，分别为空白对照组12只，模型对照组 12只、阳性对照(辛伐他汀)组10只，和药物高、中、低剂量组各10只。空白对照组普通饲料饮食，其余各组高脂饲料饮食。8周后抽取模型对照组和空白对照组动物各2只处死，无菌取出主动脉根部至主动脉穿隔肌处，置中性甲醛溶液中浸泡固定，常规乙醇脱水，石蜡包埋，横断面连续切片，制成4 μm厚切片，苏木精-伊红染色。光镜下观察见内膜明显增厚，伴有大量泡沫细胞，内皮细胞排列凌乱、不连续，大量平滑肌细胞迁移内膜，视为造模成功。造模成功后，按上述分组分别给药，连续4周，动物饲养条件不变。 (2)血脂检测:采用酶联免疫试剂盒检测总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)。 (3)血清NO、乳酸脱氢酶(LDH)、OX-LDL测定:从兔耳中间动脉收集血样，离心血清0.5 mL保存于-70?冰箱，采用酶联免疫吸附试剂盒检测。 (4)血浆及血小板释放液中tPA和PAI-1活性测定:自兔耳中间动脉收集血样，用含有EDTA( 270 mmol/L), NaCO( 1.9 mmol/L)和PGE(282 mmol/L)231的抗凝剂抗凝(血与抗凝剂体积比为9:1)。于4 ?1600 g离心30 min，得到贫血小板血浆，于- 40?冻存。自兔耳中间动脉收集血样，用3.8%的柠檬酸钠(血与抗凝剂体积比为9:1)抗凝。室温下180 g离心10 min得富血小板血浆，再以2500 g离心10 min，得血小板团快。细胞悬浮于PBS中(800 g/LNaHPO，947 24g/L NaHPO，432 g/L NaCl，250 g/L牛血清蛋白和100 mg/L葡萄糖，pH 7.38)。24 5洗涤2次后，细胞重又悬浮于上述PBS缓冲液中。血小板数调至3×10 /L,。参照Biemond等方法，于血小板悬液加人1 IU /mL的人凝血酶并于37?温育10 min，或0.1% 的Triton X-100以溶解血小板。血小板聚集或溶解后，混合物在4?4000 g离心30min，沉淀血小板，得到血小板释放物和溶解物的上清液，并于-40?保存待用。 应用发色底物法于96孔酶标板上测定血浆及血小板释放液中tPA和PAI-1的活性。 (5)病理学检查:各组动物实验结束后处死，取胸主动脉标本(由主动脉弓至隔肌)，沿动脉长轴剪开，取斑块最显著部位动脉段1 cm，使用350 g/L 53 磷酸钠缓冲甲醛溶液浸泡固定后，石蜡包埋，用切片机按4 μm的厚度切割，分别采用苏木精,伊红和Mason三色染色制作病理切片，利用图象分析软件比较观察内膜及中膜厚度、细胞形态、弹力纤维和胶原纤维的分布。 (二)药物对内皮细胞的保护作用 实验中分别设正常对照组、模型损伤组、阳性组(Vit E)和药物系列浓度组。 (1)OX-LDL的制备:用密度为1.006溶液(0.85% NaCl-0.01% EDTA，pH7.6)配制密度为1.400 的NaBr母液，用双蒸水稀释后得到1.3000、1.2000、1.1000及1.006等不同密度的溶液:并用固体NaBr调整血浆密度至1.4000，在电子天平上校正密度。将密度为1.4000的血浆置于离心管底部，然后上面分别铺5 mL密度1.2000和23.5 ml密度为1.006的梯度液。10?，50000 rpm离心5 h后，分取LDL，采用Lowry法测定蛋白含量。将所得的LDL对Tris-HCl缓冲液(0.85% NaCl，0.01% EDTA ，0.01% NaN，pH7.4)透析，4?，48 h，3 中间换液4次，除去NaBr，经过滤除菌后置4?保存备用。 氧化前在0.01 mol/L的PBS (pH7.4)中透析24 h以充分除去EDTA，并在 2+ 10 μmol/L的CuPBS(pH7.4)中37?氧化4 h，然后加100 μmol/L的EDTA终止氧化反应，静置2 h，即得OX-LDL。 (2)MTT法检测氧化损伤内皮细胞的增殖:将生长融合的人肝静脉内皮细胞(ED,25)接种于96孔板，各组分别按相应浓度给予样品，正常组和损伤 h后，损伤组给予OX-LDL(终浓度相当组给予不含样品的培养液为对照，24 于1 nmol/L)，作用4 h后，每孔加MTT 20 μL，酶标仪492 nm测定吸光度(A)值。 (3)细胞内MDA含量和培养液中SOD含量的测定:将生长融合的内皮细胞接种于96孔板，各组分别按相应浓度给予样品，正常组和损伤组给予不含样品的培养液为对照，损伤组同时给予损伤组给予OX-LDL(终浓度相当于1 nmol/L)，作用4 h后，分别吸取细胞培养上清液，按试剂盒操作方法测定SOD含量，然后每孔加蒸馏水150 μL，反复冻融细胞4次，取细胞悬液按试剂盒操作方法测定MDA含量。 (4)培养液中tPA和PAI-1活性测定:方法同前。 (5)二苯胺法测定细胞凋亡:将内皮细胞接种于培养瓶里，待细胞贴壁 54 生长融合后，分别给予样品24 h后，(正常组和模型组给予不含样品的培养液为对照)，加OX-LDL(终浓度相当于1 nmol/L)损伤4 h，分别用0.125%的胰蛋 7白酶消化，l000 r/min离心5 min，收集细胞(细胞计数约10个)，PBS洗涤3次，沉淀物用0.4 mL低张缓冲液(pH7.5，含10 mM Tris;1 mM EDTA，0.2% TritonX-100)裂解，于37? 1.5 h溶破细胞。13000 g离心以分离断裂的DNA与完整的染色质。从上清得到的断裂DNA和沉淀得到的完整核酸各在体积分数为12.5%的三氯乙酸中4?过夜。将各部分DNA用仪4 mlL体积分数为10%的高氯酸水解，90?放置10 min，加入0.4 mL 4%的二苯胺溶液(用冰醋酸配制)、20 μL 1.6 mg/mL乙醛水溶液。30?过夜，595 nm测定吸光度(A)值，完整DNA百分数由两部分DNA的吸光度值之和计算。 (三)药物对OX-LDL所致主动脉平滑肌细胞增殖和迁移的影响 (1)OX-LDL的制备:方法同前。 (2)MTT法测定对OX-LDL促进VSMC(0053SMC)增殖的影响: 将生长融合的VSMC接种于96孔板，弃去原培养液，各组分别按相应浓度给予样品，正常组和模型组给予不含样品的培养液为对照，阳性组给予辛伐 h后，每孔他汀，同时造模组给予OX-LDL(终浓度相当于1 nmol/L)，培养24加MTT 20 μL，酶标仪492 nm测定吸光度(A)值。 (3)对VSMC迁移的影响:参照Sarkar等建立的方法，预先于6孔板每孔底部放置1盖玻片，然后将VSMC接种于6孔板，待细胞在盖玻片上贴壁并生长融合后，在无菌条件下将盖玻片取出，用无菌刀片将玻片上的VSMC沿一直线刮除一侧，放回6孔板中，并分别按相应浓度给予样品，空白组给予不含样品的培养基为对照，辛伐他汀为阳性对照药，作用24 h后，取出盖玻片，进行结晶紫染色。在显微镜下观察玻片上细胞迁移距离，测定迁移距离最远的细胞至细胞边缘的距离，每张玻片取3-4处进行测定，取平均值作为细胞迁移距离。 (四)药物对LOX-1蛋白及mRNA表达水平的影响 (1)免疫组化法检测兔胸主动脉LOX-1蛋白表达:上述动脉粥样硬化模型动物胸主动脉标本，去除外膜的脂肪组织，4%多聚甲醛固定24 h ，石蜡包埋，以4-5 μm厚度切片。相关一、二抗均可购自武汉博士德生物工程有限公 55 司，通用型SP (链酶亲合素2生物素2辣根酶标记链酶卵白素复合物)免疫组化检测试剂盒可购自北京中山生物工程公司。图像分析系统分析内膜阳性染色面积比(阳性染色面积/测量窗面积)及平均光密度值(测得光密度/测量窗面积)。 (2)RT- PCR检测兔胸主动脉LOX-1 mRNA表达:采用异硫氰酸胍,氯仿一步法，提取上述动脉粥样硬化模型动物胸主动脉组织总RNA。以琼脂糖凝胶电泳可见较明亮的RNA条带判定总RNA质量符合实验要求。逆转录:各取剩余RNA 15 μL加入oligo,dT 1 μL，5000 g 4?离心3 min，放65?水浴10 min，再放冰上骤冷，加入DEPC处理水20 μL，Rnasin l μL，10 mmol/L DNTPs 2 μL，buffer 10 μL，逆转录酶1 μL，置恒温水溶槽中，42?孵育2 h，取出后置冰上骤冷，贮存-86?备用。 (五)药物对炎症反应的影响 ApoE基因敲除小鼠子高脂饮食喂养13周，待其形成成熟的AS斑块后，继续高脂喂养并给予相应药物治疗后，处死动物，采用双抗夹心ELISA法检测血清超敏C反应蛋白及可溶性白细胞分化抗原40配体水平，并取主动脉根部4个切面，分别行HE染色和Movat染色，用免疫组化染色法观察小鼠主动脉根部斑块内过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR-r)的蛋白表达，实时荧光定量PCR法检测主动脉内PPAR-r及NF-kB mRNA的表达。 第六章 抗骨质疏松症药物药效学研究思路与方法 沈志强 教授 56 第一节 概 述 骨质疏松症(osteoporosis)是威胁中老年人健康的一种常见的代谢性骨病，表现为骨的成分不变，骨含量减少，骨微结构改变，骨折危险性增大，轻微的外伤即可致骨折。也是一种以骨组织纤维结构退化为特征的代谢性疾病，是骨骼单位体积骨量(密度)降低的状态。 骨质疏松是一种多病因疾病，其基本病理机制是在骨代谢过程中骨吸收与骨形成的耦联出现缺陷。现已知体循环中多种激素、骨代谢中一些局部调节因子、体育锻炼，物理因素及营养因素等都可能影响骨代谢和骨再建过程。但众多的环节中，究竟何种因素起主导作用，各种因素之间相互作用如何，还有待于进一步揭示。 随着社会人口日趋老龄化，骨质疏松已成为一种常见病，WHO将此病列为三大老年病之一，对骨质疏松症应坚持预防为主、防治结合的原则，早期预防及综合治疗是减少骨质疏松症的关键。尽管研究人员对骨质疏松症的病理机制和治疗进行了大量的探讨，但目前临床疗教仍欠理想，因此，研究高效、安全的药物和治疗方法，仍是防治骨质疏松症的主要课题。 第二节 现代医药学研究 一、病因、病机 人体骨骼也同其它组织一样不断地进行新陈代谢，即骨的重构(骨的吸收与骨的形成之间达到平衡的过程)。成年人骨重构率约为每年5,,15,。成骨细胞负责骨形成，破骨细胞负责骨吸收。两种细胞在骨表面同一部位相继进行活动，称为基本多细胞单位(BMU)。在一个BMU完成过程中，骨的重构分为3个阶段:破骨细胞吸附在骨表面，吸收少量骨，形成凹陷;成骨细胞进入凹陷，形成新骨;骨基质矿化，新形成的骨量相当于吸收的骨量。若被破骨细胞吸收的凹陷未被新骨填满，形成的新骨量少于被吸收的骨量时即发生负平衡，从而导致骨总量的丢失，引起骨质疏松。 (一) 原发性骨质疏松 原发性骨质疏松包括绝经后骨质疏松和老年性骨质疏松，是一个全身性疾 57 病，其不仅仅是骨代谢的改变，而且是全身性老年退行性改变在骨骼系统的反映。老年内分泌调节功能减退在原发性骨质疏松发生中起主导作用，如性激素水平下降，继发性甲状旁腺素合成、分泌速率改变，降钙素水平下降等等，除此之外，老年人的运动能力、消化、吸收和代谢功能都有明显减退，如钙吸收减少，Vit D转化成活性1，25(OH)VD的速率减慢，各种受体敏感性下降等等，其特点是骨2 量严重减少，尤其是含松质骨的脊柱、股骨颈和长骨端，其形态学特点为骨小梁变细，骨皮质变薄和髓腔增宽等。 1. 绝经后骨质疏松:女性绝经后由于卵巢功能减退，雌激素分泌降低，成骨细胞和破骨细胞的功能都呈亢进状态，是一种高转换型骨代谢，由于骨吸收过程较短而成骨过程较长，最终骨吸收量大于骨形成量，导致骨量丢失而形成骨质疏松。 绝经后骨质疏松病人常见椎骨压缩骨折和桡骨远端骨折，其骨质丢失一般涉及整个骨骼系统，包括中轴及肢体骨的皮质骨和小粱骨部分。骨丢失速度可能不同，在骨骼某些部位可能骨丢失较早较快，在绝经后开始5,10年期间，骨丢失呈现加速，此后，骨丢失速度减慢并持续至20年左右。 2. 老年性骨质疏松:主要是由于成骨细胞老化、成骨细胞功能不全所致，属低代谢转换型骨质疏松症，主要累及70岁以上男性和妇女，由于衰老引起小梁骨和皮质骨逐渐(几十年间)丢失，在患有老年性骨质疏松的妇女中，雌激素缺乏也是总体骨丢失的原因之一，常见椎骨(楔形)骨折和髂部骨折。 在原发性骨质疏松的发病中，遗传因素不容忽视。骨峰值是人体一生中能达到的最大骨量，大约在25,35岁达到。骨峰值越高，则发生和绝经相关及和年龄相关的骨质疏松症性骨折的时间就越晚。已证实美国黑人妇女的峰值骨量大于高加索及亚洲妇女，这种差异与种族间遗传因子不同有关。目前还发现Vit D受体编码基因中的等位基因的变异也许和骨密度的变异有关。 (二) 继发性骨质疏松 l. 长期大量使用糖皮质激素引起的骨质疏松:在临床上，许多自身免疫性疾病患者长期大量服用糖皮质激素的主要并发症之一为骨质疏松，由此引起的骨折发生率为30,,50,。目前糖皮质激素已成为继雌激素缺乏、老年因素之后的第三大导致骨质疏松的原因，由此导致的骨质疏松属低转换型骨质疏松。 58 糖皮质激素对骨的作用遵循质和量的统一规律，体内、外试验都证明，只要其浓度在生理范围内，都表现出刺激成骨细胞的分化作用，随剂量而改变的只是其作用的大小，一旦浓度超过某一极限(度的极限)，即当其浓度超出生理水平后则表现出对成骨细胞分化的抑制作用，生理水平的糖皮质激素有促进骨形成作用，而高于生理水平的糖皮质激素则有抑制骨形成作用。长期大量服用糖皮质激素，使体内浓度远远高于生理水平，抑制了成骨细胞的骨形成作用，导致骨质疏松症的发生。 2. 营养性骨质疏松:由于先天或后天的营养索(主要是构成骨骼的矿物质和有机质)缺乏，造成骨代谢障碍，使骨细胞显微结构改变，骨折的危险度增加。营养不良可造成机体多种疾患，骨质疏松是其中之一，无论任何年龄，构成骨骼的矿物质和骨机质缺乏，不是由其它疾病引起，而仅由于营养因素造成的，即称为营养性骨质疏松症。构成骨骼的营养素包括钙、磷、镁、蛋白质、维生素以及部分微量元素等，它们是影响骨代谢的主要因素，因此，这些营养素的缺乏或比例失调是造成营养性骨质疏松的主要原因。 3. 糖尿病性骨质疏松(Diabetic osteoporosis):指糖尿病并发骨量减少，骨组织显微结构改变，而致发生骨折的一种全身性代谢性骨病，是糖尿病在骨骼系统的重要并发症之一。I型糖尿病较?型糖尿病更易患骨质疏松症。原因是高血糖渗透性利尿，钙磷镁排出过多，致血钙磷镁降低，继发甲状旁腺功能亢进，骨吸收增加，骨量减少及胰岛素相对或绝对分泌不足，骨基质合成降低，肠钙吸收及维生素D合成障碍，引起骨质疏松。与此同时，镁缺乏可导致胰岛素敏感性降低，影响糖代谢的稳定，还可使血钙浓度降低，并直接影响门PTH的分泌。 4. 慢性肝病引起的骨质疏松:慢性肝病与骨质疏松症有很密切联系。皮质骨和锥体骨质疏松在肝硬化尤其是原发性胆汁淤积性肝硬化、酒精性肝硬化、慢性活动性肝炎以及各种病因引起的肝功能衰竭而进行的肝移植手术中都有报道。有关慢性肝病骨质疏松发病机制的研究还不深入。据目前认为，可能的因素有钙吸收障碍、继发性甲状腺功能亢进引起Vit D缺乏、长期胆汁淤积、制动固定术、洒精及药物包括皮质激素、免疫抑制剂和肾功能减退等导致骨吸收增加。 5. 其它类型骨质疏松:主要包括废用性骨质疏松、坐骨神经性骨质疏松、甲状旁腺(甲状腺)功能亢进引起的骨质疏松以及恶性肿瘤引起的骨质疏松等。 59 (三)特发性骨质疏松症 常见于青少年和成人，多伴有遗传性家族史。近来发现，骨质疏松症的发病与遗传困紊及环境因素密切相关。不少作者对不同受体基因，如维生素D受体基因(VDRG)、雌激素受体基因(ERG)等采用限制性内切酶片段长度多态性方法进行研究，结果表明雌激素受体(ER)等位基因分布有个体差异，从分子水平进行基因诊断及定位，对早期诊断、筛选骨质疏松高危人群有一定意义。随着年龄的增长，遗传因素逐渐减弱，而环境因素影响加大，两者存在相互消长的关系。不同生活方式，如饮食习惯、钙的摄人、烟酒嗜好、负重活动等。对遗传因素的表达存在不可忽视的影响。 一、 骨质疏松症的危害 疼 痛 1. 骨吸收增加是疼痛的始动因素。由于骨吸收的不断增加, 骨量严重丢失, 骨形态和结构破坏。在骨小梁表现为骨小梁变薄、变细、穿孔甚至断裂, 在骨皮质表现为皮质变薄、髓腔扩大 2. 骨内压增高, 影响微循环产生淤血, 骨膜应力增加等引起张力性疼痛 脊柱弯曲变形 —身材缩短 、驼背 骨质疏松性骨折:骨折是骨质疏松症的主要并发症 发病率逐年上升 临床疗效不理想 再次骨折发生率高 髋部骨质疏松性骨折死亡原因 肺炎 褥疮 深静脉血栓与肺栓塞 泌尿系统感染与肾衰 老年性痴呆 全身衰竭 三、药物治疗 当前，国内外对治疗骨质疏松症的药物研究逐步深入，新药不断出现。总的来说，治疗骨质疏松的药物有两大类:一类是抑制骨吸收剂，如雌激素类药物、 60 二磷酸盐、降钙素、钙、维生素D等，这类药物大多只能防止骨质进一步丢失，对已经丢失骨量的恢复作用不明显，所以临床疗效欠佳，同时雌激素类药物还有诱发子宫内膜癌的危险;另一类是刺激骨形成剂，如氟化物、甲状旁腺激素、生长激素、骨生长因子、锶盐等，其中重组人甲状旁腺衍生物[rhPTH(1-34)]是美国FDA批准的唯一能显著促进骨形成的药物，治疗骨质疏松疗效较好，是较有前景的一类药物。 中药治疗有较好前景，如下: (一) 单味中药 l. 淫羊藿:为补肾壮阳药，《本草备要》中即有 “补命门，益精气，坚筋骨”之说，近年来对其研究较多。李青南等研究了淫羊藿提取液对醋酸泼尼松所致大鼠骨质疏松的骨形态学的影响。结果表明了激素组大鼠胫骨上段的骨吸收大于骨形成，出现了骨小梁面积和数量减少、骨小梁分离度增加。而淫羊藿提取液预防组的骨吸收率比激素组减少70%，骨量接近正常组水平，提示淫羊藿提取液能抑制骨吸收，促进骨形成，防治激索所致的骨质疏松。 2. 黄芪:本药为补气要药，能防止去卵巢后的骨丢失，预防类固醇性骨质疏松症。高子范等通过黄芪水提液对培养中鸡胫骨生长作用的研究，发现黄芪水提液能增强机体细胞的生理代谢，并对培养中的鸡胫骨生长有明显促进作用。 3. 蛇床子:《神农本草经》称蛇床子“除痹气，利关节”，可明显抑制去卵巢诱发的大鼠骨质高转换，防止骨丢失。它既可维持骨代谢，又有补肾壮阳等作用。 4. 骨碎补:通过组织培养和同位素示踪法，发现骨碎补提取液能明显促进培养中鸡胚骨原基的钙化，同时提高培养组织中碱性磷酸酶活性和促进蛋白多糖合成。 (二) 中药复方 1. 仙灵真宝:仙灵真宝(淫羊藿、骨碎补、枸杞子、杜仲等)对维甲酸所致大鼠骨质疏松治疗后，大鼠骨密度增加，骨组织形态学有明显改善，骨皮质增厚，说明其有良好的治疗骨质疏松作用。 2. 复方黔岭藿合剂:复方黔岭藿合剂(黔岭藿、刺五加、杜仲、黄芪、丹参等)对去卵巢大鼠骨质疏松模型作用后，可改善大鼠的骨丢失状态，起到保护骨骼作 61 用，其作用机制可能是通过兴奋垂体—肾上腺轴或性腺轴功能，通过对体内激素的调整，使雌激素水平增加，促进钙结合蛋白合成，利于肠钙吸收，改善骨质活动。 3. 骨松?号:骨松?号(仙灵脾、黄精、牡蛎)能够增加去卵巢兔成骨细胞数量，产生较多的骨质，使骨质疏松模型兔的骨代谢恢复至衡，达到预防骨质疏松的目的，其作用在一定程度上优于尼尔雌醇。 4. 补肾浸膏:补肾浸膏(肉苁蓉、补骨脂、紫河车、鹿茸、石斛、菊花、牡蛎)能提高地塞米松致骨质疏松大鼠全身骨密度、股骨抗弯强度。该药可能是通过降低血清甲状旁腺素水平和升高血清睾酮水平来防治和治疗地塞米松诱导的雄性大鼠骨质疏松症。 5. 益髓腔囊:李澎涛等观察了益髓胶囊(丹参、淫羊藿、杜仲、黄芪、没药等)对老年大鼠骨质形态及相关功能的影响。用药后骨小粱数量、密度、骨钙含量优于对照组，成骨细胞活跃，数量多，类骨质形成增多，其机制可能是该药的补肾填精作用能维持性激素水平，保持了较高的肠钙吸收率和骨吸收与骨形成的平衡，其益气活血作用改善微循环灌注，对骨营养产生积极影响，保证骨陷窝内组织交换和骨细胞营养从而抑制骨丢失。 6. 密骨片:密骨片(杜仲、胡桃肉、淫羊藿、干地黄、怀牛膝)对去睾丸骨质疏松大鼠作用后，可明显抑制其骨质丢失。治疗后大鼠的骨载荷、骨挠度等生物力学指标较模型组显著提高。 7. 补肾健骨胶囊:补肾健骨胶囊(熟地、淫羊藿、泽泻、山萸、煅牡蛎等)可明显抑制维甲酸造成的大鼠骨质疏松，对骨骼有明显的保护作用。 第四节 研究思路 骨质疏松症的发病为多因多果，而不是单纯的线性因果关系。中药治疗本病不同于常用的抑制骨吸收药，也不同于促进骨形成药，而着重于整体调节，调动内因，作用于多个环节，最终达到纠正机体激素失衡和负钙平衡的功效。骨质疏松是在骨代谢过程中骨吸收与骨形成的耦联出现缺陷，多种激素、骨代谢中一些局部调节因子都可能影响骨代谢和骨再建过程，因此药效学研究思路可以考虑:一、对内分泌及免疫系统的调节乍用 根据“肾主骨”理论，肾虚是骨质疏松症的发病关键。肾虚时，下丘脑垂体 62 性腺(甲状腺、肾上腺)三个靶腺轴功能紊乱，而且在不同靶腺和不同环节均有不同程度的紊乱，大多呈退行性变，而这些腺体分泌的激素多与骨代谢密切相关，同时，肾虚时免疫功能下降，细胞免疫、体液免疫、补体系统、单核吞噬细胞系统吞噬功能均有不同程度的降低，而影响骨代谢的局部调节因子多与此有关。补肾方药可以促进下丘脑—垂体性腺轴系统的功能活动，纠正免疫系统的功能低下，有性激素样作用，可提高去势大鼠血清中雌二醇(E)水平，减少骨质丢失，2 这可能与补肾中药提高性腺上E受体敏感性或E受体数量有关。 22 二、调节微量元素平衡 肾虚患者体内锌含量明显低于正常人，缺锌会影响垂体促性腺激素的分泌，使垂体组织及血浆内促生长激素的含量减少，表现为性腺功能减退、发育不良。补肾方药可调节体内微量元素的平衡，促进矿物质在骨中的沉积，进而发挥抗骨质疏松的作用。切除卵巢的骨质疏松大鼠在补肾密骨液的作用下，其体内钙、镁、锰、铜、锌的含量上升，有利于病骨组织骨胶原的合成、钙磷代谢及骨矿沉积。 三、对骨形成及骨吸收的影响 骨的再建是由骨形成和骨吸收两个过程正常耦联协同进行的。正常情况下两者保持平衡。骨质疏松时，破骨细胞慢性骨吸收量大于成骨细胞骨形成量，其结果导致骨量下降。对骨质疏松症的治疗都最终作用于破骨细胞或成骨细胞，对骨吸收和骨形成产生影响，从而影响整体骨量。 . 增强成骨细胞活性，使骨生成增强:补肾中药可提高大鼠血清中骨钙素 1 的含量。骨钙素主要由新生的成骨细胞合成并释放入血，其数值高低直接反映成骨细胞的活性;另外，用补肾健骨胶囊(熟地、淫羊藿、泽泻、山茱萸、煅牡蛎等)治疗维甲酸造成的大鼠骨质疏松症模型，并与西药特乐定(Tridin)作比较，结果治疗组大鼠骨载荷、骨挠度等生物力学指标与模型组比较有明显提高，且中、大剂量组骨小粱总体积、骨小粱百分比等项指标均显著高于特乐定对照组。提示该方促进骨形成作用可能优于对照组药物。另外，密骨片(杜仲、胡桃肉、淫羊藿、干地黄、怀牛膝)对于去睾丸大鼠骨质疏松模型促进骨形成作用也优于特乐定。 2. 抑制骨吸收作用:黔岭藿合剂治疗大鼠卵巢切除诱发的骨质疏松症，使反映骨吸收的指标尿吡啶,肌酐值比模型组下降25,，表明该药能抑制骨吸收， 63 防止骨质进一步丢失。在淫羊藿预防羟基脲致雄性大鼠骨质疏松症的研究中，发现淫羊藿使大鼠骨吸收率明显下降，几乎接近于正常水平，而骨形成的参数保持不变，结果骨形成大于骨吸收，皮质骨和骨髓腔维持正常组水平。 第五节 研究方法 一、实验动物的选择 选择研究骨质疏松模型动物时首先应考虑:骨质疏松在组织学表现上与人类一致;遗传稳定性;遗传背景明确，资料完整便于交流;动物经济、易饲养、操作简便;符合伦理学标准。常用的动物有: 啮齿目动物:大鼠骨代谢与人确许多相似之处:随年龄增长骨量丢失，相似的骨松质分布及重建功能，卵巢切除后高的骨转化率，肠钙吸收下降及对性激素相似的反应性等，再加上大鼠经济、易饲养等优点使其成为建立骨质疏松模型最广泛的动物。小鼠和豚鼠在遗传背景、饲养、寿命等方面与大鼠有一样的优势，但其骨代谢及骨组织对性激素的反应性与人类不尽一致，应用较少。 兔:以其经济、明显的哈氏重建能力、6个月左右骨骼即发育成熟等优点，在骨质疏松模型研究中被广泛应用。可以用来作合成代谢促进药物对松质骨及哈氏重建作用的研究，还可以作为糖皮质激素诱导的骨质疏松模型。 成年犬:优点:在骨代谢和组织结构方面与人类相似，皮质骨有丰富的哈氏系统，与松质骨比例适当，适于评价药物对哈氏系统重建的影响，另外还可用于研究废用性骨质疏松;缺点:犬卵巢切除术后6个月在组织形态学、骨量等方面无明显改变，对雌激素缺乏的反应差，不适合作研究松质骨的骨质疏松模型。 灵长类:灵长类的内分泌代谢、生殖周期、骨生物力学特性及骨组织变化与人类极为相似，最适于作骨质疏松模型动物，但费用昂贵、实验操作难度高、实验周期长等因素限制了研究应用。 猪的峰值骨量出现在2,3岁，具有与人相当的皮质骨及松质骨丢失与沉积的发生率，且有板层结构，曾被成功地用于氟化物的研究和骨骼实验，但作为雌激素缺失性骨质疏松模型，目前尚不成熟。另外，羊，鸟类，马，牛等动物目前作为骨质疏松症的模型动物应用极少。 二、动物模型 研究骨质疏松要根据形成骨质疏松的各种因素，建立相应的病理模型，然后 64 观察和测定药物对各种指标变化的影响，包括骨密度、骨形态计量学、骨生物力学及骨代谢相关的生化指标等，以确定药物对骨质疏松的治疗作用。 在骨质疏松研究中，正确建立一个理想的骨质疏松实验动物模型，是开展各种与骨质疏松相关研究工作的基础。在进行治疗骨质疏松药物的药效学研究时，选择合理的动物模型，对保证药效学试验结果的正确性与可靠性至关重要。现将常用的动物模型列举如下: (一) 去卵巢致骨质疏松模型 l. 原理:女性绝经后或卵巢切除术后，体内雌激素水平降低，骨代谢呈负平衡状态，骨量逐渐丢失，形成骨质疏松。对大鼠实施卵巢切除术，使之雌激素减少，造成骨质疏松，与人类绝经后的骨量丢失，松质骨变化，骨高转化率等均相似。 2.方法:Wistar或SD雌性大鼠，鼠龄3,12月，3,戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，无菌条件下打开腹腔，找到埋于乳白色脂肪团中的卵巢，用小镊子轻轻夹住脂肪团拉出切口外，分离脂肪团，可见到黄红色的卵巢，剪取时先将卵巢下输卵管(包括脂肪)用细线结扎，再摘除卵巢，同法再摘除另侧卵巢，术后将子宫角送回腹腔中，缝合肌肉及皮肤。术后常规饲养，自由饮水和摄食，3,4十月后，可造成骨质疏松模型。 3. 注意手术过程应按无菌操作规程进行，手术器械应消毒。卵巢应尽量切除干净，不残留卵巢组织，以确保骨质疏松模型的成功。另外，手术中还应尽量避免大量出血。大鼠切除双侧卵巢致骨质疏松模型已被公认为“金标准”模型，并有足够的健康生存时间可供实验研究用，可进行血、尿生化检验，组织形态，骨密度和骨生物力等多项指标观察，饲养方便，是首选的骨质疏松模型。 (二)糖皮质激素致大鼠骨质疏松 1. 原理:临床发现，糖皮质激素长期使用或虽间断使用但用量过大，都可引起骨质疏松。其特征为易发生自发性骨折。本模型是根据糖皮质激素的副作用，诱导继发性骨质疏松模型。 2. 方法:取3月龄雄性大鼠，以醋酸泼尼松龙注射液进行肌注，每次剂量为5 mg/kg，每周两次，对照组肌注生理盐水，连续3个月可形成骨质疏松。 3. 注意:造模型过程中，动物会出现食量减少，体重明显减轻，拱背少动 65 等表现，并且易发生感染，注射部位肌肉萎缩，所以要注意更换注射部位，以免引起注射部位坏死。大鼠糖皮质激素性骨质疏松模型，对研究人类糖皮质激素引起的继发性骨质疏松症有积极意义，糖皮质激素可直接抑制前成骨细胞向功能性成骨细胞的转化，降低前成骨细胞的骨胶原合成，骨基质形成减少。但该模型与原发性骨质疏松的发病机制和病程发展不一致，所以此模型对试图评价药物对骨吸收抑制作用的研究并不完全合适。 (三) 维甲酸致骨质琉松模型 1.原理:维甲酸是维生素A的一类衍生物，用于治疗白血病和银屑病等，对骨质有明显影响，具有致骨质疏松的副作用。用于实验动物，可造成骨质疏松模型。 2. 方法:取3月龄SD大鼠，维甲酸75 mg/kg(以l%纤维素溶液配制)灌胃，每日1次，2周后停用，对照组则以1,纤维素溶液灌胃。给药停止后，动物在标准颗粒饲料和自由饮水条件下饲养，可诱发形成骨质疏松。 3. 注意:维甲酸法因其制作模型所需时间短、骨质疏松明确肯定，易于重复的特点，在国内中药开发研究中被普遍采用。虽然在病因上与人类骨质疏松不同，但此模型在发病症状、组织形态学表现以及对雌激素的骨反应方面与人类有 ，是大鼠急性骨质疏松的造模方法。 较大的相似性 (四) 废用性骨质疏松模型 1(原理:用人工方法使动物部分肢体处于不荷重状态而建立的活体骨质疏松模型，此时，机体骨矿化水平降低，钙磷代谢负平衡，最后导致骨质丢失。由于动物肢体的骨量和骨代谢与载重、肌肉活动、神经血管对肌肉和骨的营养等因素密切相关，所以该模型的复制方法很多，常用的有机械固定法、悬吊法、腱切除法及坐骨神经切除法等四种方法。 2(方法:机械固定法系利用石膏、绷带等物品将动物肢体固定于特殊的不荷重位置，使被固定肢体处于废用状态而造成骨质疏松。悬吊法是将动物尾部悬吊，双后肢悬空，让动物靠两前肢载重并在一定范围内活动，该模型与太空飞行时处于失重状态相似，常用于模拟航天航空人员失重研究。手术切除动物一侧坐骨神经或一侧膝腱甚至跟腱也能成功复制废用性骨质疏松模型。 3.注意:前两种造模方法的优点是在同一动物身上既可研究固定肢失重时骨 66 丢失变化，又可研究承重肢超重时骨代谢变化，而且易于操作，不损伤动物，去除固定因素后还能观察骨质疏松的恢复过程。后两种方法造模时，应预防术后动物舔咬伤口及可能出现的手术肢水肿，营养不良性溃疡等问题。 (五) 营养性骨质疏松模型 该模型的制备对研究因营养缺陷引起的骨质疏松有重要意义，通过给动物喂饲缺乏钙、磷、维生素D等的饮食，可使骨密度下降，血钙磷浓度上升，尿钙增加，符合骨质疏松的表现。 三、体外骨细胞研究模型 四、客观指标 (一)整体动物实验研究 造成骨质疏松的原因不同，模型也不同，但评价骨质疏松的指标是基本相同的，主要有以下五方面的指标: 1. 骨密度测量 骨密度是判断骨质量的依据，是分析骨代谢变化的重要内容，精确定量测定骨密度能判断骨量水平，丁解骨吸收与骨形成功能状态，是研究骨质疏松和评价药效的重要检测手段。 常见的测量手段包括:双能X射线吸收测量法(DEXA)，单光子吸收测量法(SPA)，双光子吸收测量法(DPA)和定量计算机断层扫描法((QCT)，超声法(Ultra Sonic)等。这些测量方法都有各自的特点，稳定性和可信性较为满意。 2. 骨组织计量学观察 骨组织计量学是新近发展起来的一门科学，已用于各种骨质疏松的诊断、治疗和研究。基本方法是将从病人或动物取得的骨活检标本用组织形态学方法观察并测量各种不同的参数，以分析研究骨质疏松的病理变化和动力学特征，探讨骨质疏松的发生发展过程。 骨组织形态学分析，包括骨标本的骨片静态和动态分析测量，具体指标有骨小梁面积、骨小粱周长、骨小梁厚度、骨矿化沉积率、矿化延迟时间等等。 对所建立的骨质疏松模型大鼠，在处死前间隔一定的时间(如8天)，分两次 67 分别给动物腹腔注射盐酸四环素30 mg/kg，四环素能螯合钙，并主要沉积在新形成骨基质钙化的起始点。分两次注射能使骨表面形成双层荧光，表明分两次注射四环素期间骨形成的情况。 处死实验动物，摘取胫骨(或股骨)作骨标本切片。骨标本制作一般分为脱钙骨切片、骨磨片和不脱钙骨切片三种。脱钙法的缺点是不能了解骨的矿化过程。磨片法费时，骨标本又易破碎。通过不脱钙骨切片可了解骨的动力学过程。 3. 骨代谢的生化指标 骨是一种活性的不断进行新陈代谢的器官，旧骨不断被吸收，吸收过程主要是由破骨细胞完成的，同时新骨又不断地被成骨细胞形成，这个过程就是骨的再建。骨再建的速率，也就是骨吸收和骨形成的速率称为骨更新率或骨转换率。骨更新过程是由骨细胞活动以及由此所引起的骨组织成分包括骨基质和骨矿物质代谢活动所构成的。因而骨代谢的改变往往能反映骨细胞、成骨细胞和破骨细胞的活动变化及骨基质、骨矿物质的代谢变化。测定血、尿矿物质的变化及骨腔原和非胶原成分的变化，对于判定骨代谢状态，骨更新率快慢有重要价值。在骨质疏松研究中常用的较为特异的生化指标有以下几种: 与骨形成有关的生化指标: 血清总碱性磷酸酶(ALP)和骨特异性碱性磷酸酶(B-ALP):ALP和B-ALP都是最常见的评价骨形成和骨转换的指标，ALP由骨、肾、肝、肠、胎盘等分泌，因而特异性不强，血清中ALP有50,来源于骨。骨特异性碱性磷酸酶由成骨细胞分泌，是评价骨形成较为特异的生化指标。目前常用ELISA方法来测定骨特异性碱性磷酸酶。 骨钙素(BGP):骨钙素由成骨细胞分泌，是骨骼中最丰富的非胶原蛋白之一，约占非胶原蛋白的10%,20,，其数值大小可反映成骨细胞活性。目前主要有放射免疫测定法(RIA)，双位免疫放射法及酶联免疫测定法(ELISA)。 骨唾液酸蛋白(BSP):BSP大量存在于活性成骨细胞，由成骨细胞分泌。 骨桥蛋白:人骨桥蛋白发现存在于中枢骨与细胞外，在骨矿化前由活性成骨细胞生成，由破骨细胞吸收。根据目前的报道，BSP和和骨桥蛋白更多地反映了骨吸收和骨转换。 血浆或血清抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP):与骨吸收有关的生化指标:主要 68 由破骨细胞释放，血浆中的TRAP水平反映破骨细胞活性和骨吸收状态。血清中TRAP活性的测定方法很多，如化学法，荧光免疫法，放射免疫法，对流免疫电泳等。 破骨细胞生成抑制因子(OCIF),骨保护素(OPG):OCIF,OPG是一种新发现的以可溶性蛋白形式存在的破骨细胞负性调节因子，属于肿瘤坏死因子受体超家族成员，其配基OCIF,OPG被证明是破骨细胞分化因子，OCIF,OPG可与其配基结合阻断其配基的信号下传而抑制破骨细胞生成、活化，其它骨吸收调节因子可能部分或全部通过调节OCIF,OPG生成而发挥作用。该因子的发现，为探讨骨质疏松的发病机制及预防和治疗提出了新方向。 尿吡啶,肌酐:?尿吡啶,肌酐值可以反映破骨细胞的骨吸收功能。?目前尿吡啶的测定常采用美国的试剂盒进行测定。 4. 骨生物力学指标 生物力学是根据已确立的力学原理来研究生物体中力学问题的一门学科，将物理学及应用数学的概念和方法用到生物体中，评价生命现象。骨生物力学的研究有助于对骨质量进行直接评价。 常用长骨的三点弯曲试验来评价骨的生物力学性质。三点弯曲试验中骨结构力学指标主要有最大载荷、断裂挠度、弹性载荷、弹性挠度及弯曲能量，反映骨结构力学的变化，其变化主要受骨尺寸大小和几何形态的影响;骨材料力学指标有最大弯曲应力和弹性模量等，主要反映骨的内在质量，不受骨尺寸的影响。 5. 骨矿成分的测定 取实验大鼠股骨(或胫骨)置于120?烘箱中烘烤12 h后，用电子天平称干重，再置于600,650? 马孚炉中灰化6,8 h，使骨呈白色粉末状，用电子天平称重，其灰重即为无机质重量。用原子吸收仪测定或用离子选择电极法及钼蓝比色法测出骨灰中钙、磷等元素含量。 (二) 体外骨细胞研究 69 细胞水平评价药效 药物对破骨细胞(OC)的影响 药物对破骨细胞 病理图片 ,能否阻抑破骨细 胞的分化、数量 ,能否促进凋亡 The resorption has gone through the trabecula making a hole. 70 药物对成骨细胞(OB)的影响 ,能否促进成骨细 胞分化为骨细胞 ,能否促进增殖 ,是否促进矿化作 用 71