crisprcas基因编辑技术原理与应用 ppt课件

CRISPR-CAS基因编辑技术原理与应用LOREMIPSUMDOLORLoremipsumdolorsitamet,consecteturadipisicingelit.Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)systems（常间回文重复序列丛集关联蛋白系统）What0102CRISPR 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 示成簇的规律间隔的短回文重复序列，而Cas是一种和CRISPR系统相关联的蛋白质、基因家族，其可以以序列依赖性的方式对DNA进行切割和靶向作用。What细菌和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制实际上就是一种基因编辑器能怎好CRISPR/Cas基因编辑技术能运用于实际中了吗？相比其它编辑技术CRISPR/Cas基因编辑技术好用吗？怎么用CRISPR/Cas基因编辑技术？2013年2月发表在《Science》杂志上的两篇文章发现CRISPR/Cas9系统能在293T,K562等多种细胞中进行有效的靶向酶切,非同源末端连接同源重组效率约在在3-25%之间,与被《Science》杂志评为2012年十大科学突破之一的TALEN技术的酶切效果相当。可用于编辑人类基因组。发现原理CRISPR/Cas9系统通过将入侵噬菌体和质粒DNA的片段整合到CRISPR中，并利用相应的CRISPRRNAs(crRNAs)来指导同源序列的降解，从而提供免疫性。CRISPR/Cas9利用一段小 RNA 来识别并剪切DNA以降解外来核酸分子。原理示意图RNA指导的CRISPR/Cas9基因剪切系统利用CRISPRCas进行基因组 工程 路基工程安全技术交底工程项目施工成本控制工程量增项单年度零星工程技术标正投影法基本原理 ，图中不同颜色的剪刀代表着不同的Cas9酶用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞操作过程,可快速而有效地建立携带多个基因突变的小鼠。因其不依赖在胚胎干细胞上操作,可用于多生物细胞的基因操作。模型生物的建立也不再局限于小鼠及少数大鼠中,任何可进行胚胎操作的物种都能成为基因组工程的目标。应用应用RudolfJaenisch教授实验室采用CRISPR/Cas技术绕过了胚胎干细胞操作过程，可快速而有效地建立携带多个基因突变的小鼠。这是CRISPR/Cas技术首次被用于多细胞生物的基因操作。应用。基因编辑功能应用疾病治疗方向应用疾病模式动物疾病模式动物科学家们一直改变与特定疾病相关的基因来用小鼠或其他模型动物建立相应的疾病模型。研究者可以应用这些疾病模型研究疾病的发病机制,再现疾病发生过程;也可用于筛选有效治疗药物,或通过研究特异的表面分子、信号通路等开发新的靶向治疗药物等。疾病模式动物传统方式缺陷用特定的手段将目的DNA片段插入到小鼠胚胎干细胞中,筛选出成功修饰的胚胎干细胞,应用显微操作技术将其移入到早期胚胎(即囊庇)中,将改造后的脏胎移植到假孕母鼠中,再自生出的小鼠筛选疾病模型。成本高,应用的物种有限,操纵的基因亦有限。基因编辑功能应用CRISPR-Cas9系统的基因编辑功能主要应用于在不同物种的基因组产生需要的等位基因突变,来研究基因功能或建立疾病模型。如果CRISPR-Cas9系统的基因编辑功能如果真如研究者报道那样强大的话，那该技术在先天性突变或获得突变所致疾病的修复治疗中将有巨大的潜在价值。这一点还有待研究。疾病治疗方向应用以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术在一系列基因治疗的应用领域都展现出极大的应用前景，如血液病、肿瘤和其他遗传疾病。CRISPR/Cas9在多种类型的细胞和组织中都具有高效精确的基因编辑能力，在CAR-T、造血干细胞等体外治疗手段中是一个非常理想的操作平台，在体内也可适用。CRISPR/Cas技术灵魂人物——FengZhang（张锋）MIT麦戈文脑研究所（McGovernInstituteforBrainResearch）助理教授FengZhang获得瓦利基金青年研究家奖（ValleeFoundationYoungInvestigatorAward）。FengZhang目前的研究方向是设计新的分子工具来操控活体大脑，他同时也是布罗德研究所（BroadInstitute）的核心成员。“现在，人们可以用这一技术在活细胞中有效启动任何基因。这个系统可以让科学家们更简便地研究不同基因的功能。”改造后的CRISPR技术，可以快速对整个基因组进行功能筛选，帮助人们鉴定涉及特定疾病的基因。张锋等人在这项研究中就鉴定了让黑色素瘤细胞抵抗癌症药物的几个基因。基因敲除的四种方法1234锌指核酸酶(ZFN)ES细胞打靶类转录活化因子核酸酶(TALEN)CRISPR/Cas基因编辑技术锌指核酸酶(ZFN)010203构成：锌指核糖核酸酶（ZFN）由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成。作用：增强线虫的同源重组前景：ZFN技术亦具有潜在的临床应用前景。04缺陷：1、不能预期引入的ZFN蛋白是不是会引起免疫系统的进攻。2、直接体内注入基因的效率低。3、在细胞内精确度难以预估。定义基因打靶是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。ES细胞打靶原理获得ES细胞系，用同源重组技术获得带有预先设计突变的中靶ES细胞。通过显微注射或者胚胎融合将经过遗传修饰的ES细胞引入受体胚胎内。ES细胞仍然保持分化的全能性，可发育为嵌合体动物的生殖细胞，使修饰过的遗传信息经生殖系遗传。获得的突变动物提供了一个特殊的研究体系，使他们可以在生物活体中研究特定基因的功能。应用基因打靶技术在基因功能研究中的应用、研制人类疾病动物模型、改良动物品系和研制动物反应器等。类转录活化因子核酸酶(TALEN)01020304优点：设计更简单，特异性更高。缺点：具有一定细胞毒性，模块组装过程繁琐，一般需要求助于外包公司应用：基于TALE的基因组编辑技术已经被广泛作用于基因敲除、敲入、转录激活等。简介;TALENs是一种可靶向修饰特异DNA序列的酶，它借助于TAL效应子一种由植物细菌分泌的天然蛋白来识别特异性DNA碱基对。利用CRISPR/Cas技术构建基因敲出小鼠的效率非常高，可以非常高效率地在四个位点上对两个基因进行敲出，效率达到了80%左右。如果利用TALENT技术，单基因敲出的效率只有30%。传统的基因敲除方法需要通过打靶载体构建、ES细胞筛选、嵌合体小鼠选育等一系列步骤，不仅流程繁琐、技术要求很高，而且费用大、耗时较长，成功率受到多方面因素的限制。其他技术的不足方法靶标质粒构建基因下调基因敲除基因定点突变或多点突变基因组改变遗传密码子改变遗传性RNAi(siRNA,shRNA)mRNA（转录水平）简单yes　NONONOsiRNA：瞬转；shRNA:可借助慢病毒实现遗传性CRISPRDNA序列（基因组水平）简单　yesyesyesyesyesTALENDNA序列（基因组水平）复杂　yesyesyesyesyes操作简单，靶向精确性更高，成本低可对靶基因单个位点或多个位点同时敲除可同时对多个靶基因进行敲除是由RNA调控的对DNA的修饰，其基因修饰可遗传可应用于任何物种拥有CRISPR/Cas9腺病毒/慢病毒系统，对分裂期和非分裂期细胞均有感染作用。优点更容易得到纯合子突变体缺点传统的转基因和基因打靶技术，由于技术稳定成熟，可以对小鼠和大鼠的基因组序列进行各种修饰，仍将是模式动物的构建的主要技术。该系统是否有脱靶效应尚需进一步的研究缺点CRISPR-Cas技术尤其是CRISPR-Cas9作为基因编辑的核心技术，它仍然是一项非常新颖的技术，除了存在“脱靶”的主要问 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 外，还有许多的技术难点尚未突破，尤其是临床应用的有效性和安全性依然是科学家关注和争论的焦点。进展010203040506细菌，哺乳动物干细胞的定点突变多基因打靶斑马鱼拟南芥靶序列互补1随着CＲISPＲ/Cas技术的快速发展,它已经被广泛应用于细菌、人类胚胎干细胞、哺乳动物细胞、酿酒酵母、线虫、果蝇和农作物等的基因研究，并具有操作简单、快速、靶向精确性高、可实现对靶基因多个位点同时敲除等特点。在细菌研究方面，确定了副溶血性弧菌的6个不同的CＲISPＲ序列类型，同时CＲISPＲ序列类型被认为与毒力因子测试和MLST基因型明显相关。进展2在斑马鱼研究方面，通过注射两个简单的体外合成的组件(即使用一个密码子优化的Cas9和单链向导sgＲNA)到单细胞期胚胎中，使目标基因突变。这种灵活的基因失活的方法为斑马鱼基因功能和基因相互作用提供了一个有效的方式。进展3干细胞中的定点突变，包括引进或疾病患者特异性突变模型的修正。然而，在人类胚胎干细胞中将一个 报告 软件系统测试报告下载sgs报告如何下载关于路面塌陷情况报告535n,sgs报告怎么下载竣工报告下载 基因整合成一种内源性基因还需要漫长艰苦的两步:首先要正确识别目标然后要排除耐药性。研究发现，tracrＲNA和crＲNA分开单独表达，还能够提高切割的效率。这个发现让大家意识到:可以通过进一步修改sgＲNA的设计 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 ，让它与双ＲNA复合体的结构更加相近，就能够进一步提高Cas9系统的基因组编辑效率。进展4在拟南芥研究方面，利用CＲISPＲ/Cas系统对分裂组织有针对性地定点诱变产生遗传突变，结果表明，在拟南芥中使用CＲISPＲ/Cas系统为RNA引导的核酸内切酶(RGEN)定点突变分裂组织提供了一种有效的遗传基因工程的方法。进展进展5CRISPR/Cas的打靶效率比较高，最高可达80%，且靶位点设计灵活、方便，载体构建简单;CRISPR/Cas技术已经做到了降低脱靶的几率，降低细胞毒性，但这并不是代表不会产生;此外较于ZFN与TALEN，CRISPR/Cas的设计更为简单、廉价，一般普通的试验也可自行操作;现在的技术已经做到，可使CRISPR/Cas同时打靶多个基因，且每多一个靶位点只需多一个gRNA质粒。1.目前CRISPR-Cas9系统中仍有一系列有待解决与发展的问题，例如如何突破PAM序列的限制、如何建立对Cas9特异性(脱靶效应)的全面评价体系、如何构建不同物种中可通用的Cas9与sgRNA导入与表达系统以及如何更有效的激活同源重组修复等。但是基于CRISPR-Cas9系统的迅猛发展速度，我们可以预见，随着相关基础科学研究的深入，CＲISPＲ-Cas9系统将在基因组水平上的基因改造、转录调控与表观遗传调控等不同层次上得到更广阔的发展与应用。前景2.自Cas9被发现以来，研究人员一直把它作为一把有潜力的钥匙来开启遗传疾病的新疗法，并且利用ＲNA导向的Cas9核酸酶在哺乳动物细胞和斑马鱼胚胎中进行基因组编辑。研究发现，Cas9/gＲNA有效诱导了生成的体细胞中etsrp或gata5的双等位基因转换。研究者通过Cas9/gＲNA系统的诱导在斑马鱼胚胎中获得了位点特异性的mloxP序列插入。因此，Cas9核酸酶的功能远远大于目前所了解到的，加大对Cas9核酸酶的特异性研究并深入了解，有助于生命科学的研究。前景3.外源性基因的插入会引起很多负面影响和意外突变，成为研究者们必须解决的问题。而CＲISPＲ/Cas系统的深入研究将是解决这一问题的关键。在人类疾病的研究上，癌症基因的敲除、艾滋病毒等治疗，CＲISPＲ/Cas9技术拥有很大优势，这也将成为未来的研究趋势。同时也将为人类不可战胜的疾病提供了更好的治疗方法前景4.通过目前对CRISPR/Cas系统研究，不管是在细胞中还是在动物胚胎中已经能够对基因进行敲除或是修饰来优化品种或者治疗疾病。为了对遗传缺陷进行纠正或删除，将Cas9系统和相应的靶向致病基因的sgRNA载体导入机体，这种技术在未来较短的时间内会成为一种成熟的非常有效的治疗手段。CRISPR/Cas9系统在疾病治疗、基础理论研究和农牧渔业等领域已经得到广泛研究，这将对分子生物学研究和基因治疗领域产生深远影响。前景5.许多研究利用这种技术为各种人类疾病构建出动物模型，已经取得重大成果。为了扩大这项技术的使用范围，研究者们将CＲISPＲ/Cas9系统与其他的基因组改造技术(如巨核酶技术、锌指核酶技术及TALEN技术等)进行更加深入的比较研究。研究表明，CＲISPＲ系统还参与细菌生长代谢的调控，这说明Cas蛋白和CＲISPＲＲNA的功能已经不只能局限于免疫抑制，对于它的研究还需要更加深入。同时它也呈现出越来越多的可能性和不可知性，这都需要研究者去发现、利用。前景