Biolog方法与ECO板碳源

EcoPlateTM各区井中的碳源 A1空白 Water 水 一区 A2多碳糖 ?-Methyl-D-Glucoside ?-甲基D-葡萄糖苷 A3有机酸 D-Galactonic Acid y-Lactone D-半乳糖内酯 A4氨基酸 L-Arginine L-精氨酸 A1 Water 水 二区 A2 ?-Methyl-D-Glucoside ?-甲基D-葡萄糖苷 A3 D-Galactonc Acid y-Lactone D-半乳糖内酯 A4 L-Arginine L-精氨酸 A1 Water 水 三区 A2 ?-Methyl-D-Glucoside ?-甲基D-葡萄糖苷 A3 D-Galactonic Acid y-Lactone D-半乳糖内酯 A4 L-Arginine L-精氨酸 B1有机酸 Pyruvic Acid Methyl Ester 丙酮酸甲脂 B2多碳糖 D-Xylose D-木糖 B3有机酸 D-Galacturonic Acid D-半乳糖醛酸 B4氨基酸 L-Asparagine L-天冬酰胺酸 B1 Pyruvic Acid Methyl Ester 丙酮酸甲脂 B2 D-Xylose D-木糖 B3 D-Galacturonic Acid D-半乳糖醛酸 B4 L-Asparagine L-天冬酰胺酸 B1 Pyruvic Acid Methyl Ester 丙酮酸甲脂 B2 D-Xylose D-木糖 B3 D-Galacturonic Acid D-半乳糖醛酸 B4 L-Asparagine L-天冬酰胺酸 C1聚合物 Tween 40 吐温40 C2其他多元醇 I-Erythritol I-赤藻糖醇 C3有机酸 2-Hydroxy Benzoic Acid 2-羟苯甲酸 C4氨基酸 L-Phenylalanine L-苯基丙氨酸 C1 Tween 40 吐温40 C2 I-Erythritol I-赤藻糖醇 C3 2-Hydroxy Benzoic Acid 2-羟苯甲酸 C4 L-Phenylalanine L-苯基丙氨酸 C1 Tween 40 吐温40 C2 I-Erythritol I-赤藻糖醇 C3 2-Hydroxy Benzoic Acid 2-羟苯甲酸 C4 L-Phenylalanine L-苯基丙氨酸 D1聚合物 Tween 80 吐温80 D2其他多元醇 D-Mannitol D-甘露醇 D3有机酸 4-Hydroxy Benzoic Acid 4-羟基苯甲酸 D4氨基酸 L-Serine L-丝氨酸 D1 Tween 80 吐温80 D2 D-Mannitol D-甘露醇 D3 4-Hydroxy Benzoic Acid 4-羟基苯甲酸 D4 L-Serine L-丝氨酸 D1 Tween 80 吐温80 D2 D-Mannitol D-甘露醇 D3 4-Hydroxy Benzoic Acid 4-羟基苯甲酸 D4 L-Serine L-丝氨酸 E1聚合物 a-Cyclodextrin a-环式糊精 E2胺 N-Acetyl-D-Glucosamine N-乙酰基-D-葡萄胺 E3有机酸 y-Hydroxybutyric Acid y-羟基丁酸 E4氨基酸 L-Threonine L-苏氨酸 E1 a-Cyclodextrin a-环式糊精 E2 N-Acetyl-D-Glucosamine N-乙酰基-D-葡萄胺 E3 y-Hydroxybutyric Acid y-羟基丁酸 E4 L-Threonine L-苏氨酸 E1 a-Cyclodextrin a-环式糊精 E2 N-Acetyl-D-Glucosamine N-乙酰基-D-葡萄胺 E3 y-Hydroxybutyric Acid y-羟基丁酸 E4 L-Threonine L-苏氨酸 F1多碳糖 Glycogen 肝糖 F2胺酸 D-Glucosaminic Acid D-葡萄胺酸 F3有机酸 Itaconic Acid 衣康酸 F4氨基酸 Glycyl-L-Glutamic Acid 甘氨酰-L-谷氨酸 F1 Glycogen 肝糖 F2 D-Glucosaminic Acid D-葡萄胺酸 F3 Itaconic Acid 衣康酸 F4 Glycyl-L-Glutamic Acid 甘氨酰-L-谷氨酸 F1 Glycogen 肝糖 F2 D-Glucosaminic Acid D-葡萄胺酸 F3 Itaconic Acid 衣康酸 F4 Glycyl-L-Glutamic Acid 甘氨酰-L-谷氨酸 G1多碳糖 D-Cellobiose D-纤维二糖 G2其他 Glucose-1-Phosphate 葡萄糖-1-磷酸盐 G3有机酸 a-Ketobutyric Acid a-丁酮酸 G4胺 Phenylethyl-amine 苯乙基胺 G1 D-Cellobiose D-纤维二糖 G2 Glucose-1-Phosphate 葡萄糖-1-磷酸盐 G3 a-Ketobutyric Acid a-丁酮酸 G4 Phenylethyl-amine 苯乙基胺 G1 D-Cellobiose D-纤维二糖 G2 Glucose-1-Phosphate 葡萄糖-1-磷酸盐 G3 a-Ketobutyric Acid a-丁酮酸 G4 Phenylethyl-amine 苯乙基胺 H1多碳糖 a-D-Lactose a-D-乳糖 H2多元醇 D,L-a-Glycerol D,L-a-甘油 H3有机酸 D-Malic Acid D-苹果酸 H4胺 Putrescine 腐胺 H1 a-D-Lactose a-D-乳糖 H2 D,L-a-Glycerol D,L-a-甘油 H3 D-Malic Acid D-苹果酸 H4 Putrescine 腐胺 H1 a-D-Lactose a-D-乳糖 H2 D,L-a-Glycerol D,L-a-甘油 H3 D-Malic Acid D-苹果酸 H4 Putrescine 腐胺                         1.4.3　统计试验  采用ＳＡＳ/ｐｃ统计分析系统(6.04版本)中的Ｐｒｏｃｃｌｕｓｔｅｒ,ＰｒｏｃＰｒｉｎｃｏｍｐ(ｆａｃｔｏｒ) 程序分别进行聚类、主成份(因子)分析;并采用Ｂｉｏｌｏｇ系统的Ｍｌｃｌｕｓｔ程序进行聚类分析. 表2.9 计算微生物群落多样性指数的公式 多样性指数 用途 公式 备注 Shannon多样性指数 评估丰富度和均度 H′=-∑pi （lnpi） Pi为第i孔的相对吸光值（C-R）与整个平板相对吸光值总和的比率 Shannon均匀度 通过Shannon指数计算出的均度 E= H′/lnS S为颜色变化的孔的数目 Simpson指数 评估某些最常见种的优势度指数 ni是第i孔的相对吸光值（C-R）； N是相对吸光值总和；Simpson指数用1/D表示 McIntosh指数 基于群落物种多维空间上的Euclidian距离的多样性指数 同上 McIntosh均匀度 由McIntosh指数计算得出的均匀度 同上         2.2.4.6.1 BIOLOG GN微平板 BIOLOG GN微平板是一种多底物的96孔ELISA反应平板。除对照孔A1只装有四氮叠茂和一些营养物质外， 其余95孔作为反应孔还装有不同的单一碳底物。在进行ELISA反应时，各孔中的微生物利用碳底物，呼吸作用产生 NADH，引起四氮叠茂发生氧化还原变色反应用于检测(BIOLOG Inc,1993)。微生物对不同碳底物的利用情况可用反应 孔中的颜色变化来表示。通过对孔中颜色变化的光吸收值的测量，可获得较准确的信息。 2.2.4.6.2 操作步骤 参照Garland 和 Mills（1991）和杨永华等（2000）的方法，利用BIOLOG GN 微平板来研究不同微生物群落对 不同单一碳源利用能力（Sole-Carbon-Sourse Utilization,SCSU）的差异，以获得堆肥微生物群落结构和功能多样性 方面的信息。具体步骤如下： a.  加250mL 0.1mol/L磷酸缓冲液（K2HPO4/KH2PO4,pH7.0）于三角瓶中，灭菌;或用250ml 0.85%的NaCl生理盐溶液，灭菌。 b.  称相当于25g烘干重的新鲜堆肥，加入三角瓶中，封口（1：10提取液）; c.  摇床振荡1min后，冰浴1min，如此重复3次; d.  静置2min，取上清液3mL于已灭菌的50mL的三角瓶中，加入27mL无菌0.1moL/L磷酸缓冲液，稍加振荡（1：100提取液）; e.  重复步骤d, 直至稀释到每毫升稀释液大约3×104～4×104 个微生物; f.  将BIOLOG GN 微平板从冰箱内取出，预热到25℃; g.  用200 μL移液器将稀释液加到微平板孔中，每孔加150μ L。将加好样的BIOLOG GN 微平板在28℃ 条件下温育; h.  在温育过程中，每隔一定时间(24、48、72、96、120h)，用318-微平板读数器（318-microplate reader）在590nm处读数来 测定各孔吸光值（abs），凡吸光值大于0.25的井，则属于阳性反应。与对照井abs相减得负值的井，在统计分析时其反应定为零。 i.在实验过程中，应记录的数据为：吸光值（abs）、吸光值（abs）大于0.25的井数、呈阳性反应井对应的碳源类型。 2.3.2 生物多样性数据处理方法 堆肥微生物群落BIOLOG GN 微平板在温育过程中的平均每孔颜色变化率（Average well color development, AWCD）的计算方法 如下：AWCD值=[∑（C-R）]/95，其中C指各反应孔在578nm下测定的吸光值（OD578）， R是对照孔A1的吸光值。采用堆肥 微生物在BIOLOG GN 微平板反应72h的数据进行计算。除Shannon多样性指数外，在计算其它多样性指标时，将数据扩大1000 倍以防止出现负数。用于计算土壤微生物群落多样性的公式如表2.9（骆世明和彭少麟，1996；杨永华等，2000）。BIOLOG GN 微 平板的碳底物组成如表2.10所示，用于将95种碳底物分类。 表2.10 BIOLOG GN 微平板的碳底物组成 Carbohydrates Adonitol (8)            D-Mannitol(22)        i-Erythritol(12)        Mono-methyL-succinate(35) α-D-Glucose(17)        D-Mannose(23)        L-Arabinose(9)        N-acetyL-D-galactosamine(6) α-D-Lactose(19)          D-Raffinose(27)        Cellobiose(11)        N-AcetyL-D-glucosamine(7) D-Melibiose(24)          L-Rhamnose(28)        D-Psicose(26)        Methyl pyruvate(34) L-Fucose(14)            Sucrose (30)            Lactulose(20)          m-Inositol(18)  D-Sorbitol(29)          D-Galactose(15)        Turanose(32)          Xylitol(33) D-Fructose(13)          Gentiobiose(16)        Maltose(21)          β-MethyL-glucoside(25) D-Trehalose(31)          D-Arabitol(10) Carboxylic acids Acetic acid(36)          Itaconic acid (49)      α-Ketobutynicacid(50)      α-Ketoglutaric acid(51) cis-Aconitic acid(37)      Citric acid(38)        D,L-Lactic acid(53)        D-Galactonic acid lactone(40) D-Glucosaminic acid(43)  D-Glucuronic acid(44)  D-Saccharic acid(57)      γ-Hydroxy-butyric acid(47) Malonic acid(54)          Formic acid(39)      Propionic acid(55)        α-Hydroxybutyric acid(45) α-Ketovaleric acid(52)      Quinic acid(56)      D-Gluconic acid(42)      β-Hydroxybutyric acid(46) D-Galacturonic acid(41)    Sebacic acid(58)      Succinic acid(59)        p-Hydroxy-phenylacetic acid(48) Amino acids D,L-Carnitine(82)      D-Alanine(64)        D-Serine(79)            γ-Aminobutyric acid(83) L-Leucine(74)          Hydroxy-L-proline(73)  L-Alanine(65)            L-Alanyl-glycine(66) L-Aspartic acid(68)      L-Glutamic acid(69)    L-Histidine(72)          GlycyL-L-asparitic acid(70)