中华蜜蜂转录组测序及雌性蜜蜂基因表达分析（可编辑）

中华蜜蜂转录组测序及雌性蜜蜂基因表达分析（可编辑） 中华蜜蜂转录组测序及雌性蜜蜂基因表达分析 本论文得到国家蜂产业技术体系项目.、江西省 自然科学基金.和教育部博士点基金项目 .资助 蛩 。 ., . 。独刨性声明 本人声明,所呈交的学位论文,是在指导教师指导下.通过我的努力 取得的成果.并且是自己撰写的。尽我所知.除了文中作了标注和致谢中 己经作了答谢的地方外,论文中不包古其他人发表或撰写过的研究成果. 也不包台在江西农业大学或其它教育机构获得学位或证书而使用过的材 料。与我一同对本研究做出贡献的同志,都在论文中作了明确的说明井表 示了谢意。如被查有严重侵犯他人知议产权的行为.由本人承担应有的责 任。 阿期:理堡』 学位论文作者亲笔签名:副李孽 论文使用授权的说明 本人完全了解江西农业大学有关保留、使用学位论文的规定.即学校 有权送交论文的复印件,允许论文被查阅和借闻;学校可以公布论文的全 部或鄹分内容.可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密,在 年后解密可适用本授权书。口 口 不保密.本学位论文属于不保密。 请在方框内打“~一 学位论文作者亲笔签名:宣至叠 日期:旦丝』 指导教师亲笔签名: 期:王必王& 盘氢嶝日 ,,?.,.. . 一.一....‘呻 .目录 摘要?。 第一章文献综述?.... 中华蜜蜂的概况?.... :雌性蜜蜂基因差异表达研究进展??.... 甲基化转移酶~ 蜜蜂中的研究进鹾. 测序技术??. ?................................................................ ....................................... 本论文的研究内容?. 第二章中华蜜蜂转录组测序和数字基因表达谱分析? 】;?。.. 材料 关于××同志的政审材料调查表环保先进个人材料国家普通话测试材料农民专业合作社注销四查四问剖析材料 与方法.?? :实验材料 实验蜂群 实验器材及试剂.实验方法 .创建文库和转录组序列? . 序列结果的分析 . 剖建文库并测序. 测序文库与参考转录组数据库比对分析 . 差异表达基因的筛选及功能注释 . .验证 】二 结果..??.】测序和序列组装预测蛋白质的功能注释 标笠测序文库 目录 .标签数据库与参考标签数据库进行比对 中蜂蜂王与工蜂间差异表达基因.差异表达基因的?验证 刊论 第三章 中华蜜蜂基因克隆及表达分析 引言 材料与方法 实验材料 实验蜂群 二? 实验试剂及仪器? .培养基和主要溶液的配制 实验方法 总的提取 】】实验器具的处理与准备 试剂配制和准备 .? 提取步骤.质量检测反转录台成第一链引物设计与合成. 扩增 产物回收产物的克隆 序列的测定和分析 . 荧光定量定量引物设计 反转录反应 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 品的制作 实时荧光定量 数据统计与分析目录 结果与分析.???. 中蜂基因的扩增与鉴定 中蜂基因与其编码蛋白比较分析 中蜂基因的转录表达 讨? ............................. 第四章结论与展望.. 主要结论研究展望参考文献??。 附件 代谢通路 攻读硕士期间发表论文情况致谢摘要 摘要 ”为材料.通过转录组测序技术获得了中 本研究以中华蜜蜂 . 华蜜蜂的转录组信息,并通过数字基因表达谱 测序分析比较丁中华蜜蜂蜂王和工蜂的基因表达差异。另外克隆了中华蜜蜂 甲 基化转移酶.基因及分析了其的表达。 核苷酸。这 通过转录组删序技术.获得丁..条 对应 些组装成.个,平均长度 。基于五个数据库衄、?、 、和用进行相似性比对值。,共有.个 被注释。将获得的转录组数据作为参考数据库,用方法分析比较中华蜜蜂蜂 王 和工蜂的基因表达差异。分别从蜂王和工蜂中获得..和..标签。检 个是上调.个是下调。 测到个基因有差异表达.蜂王与工蜂相比.其中 我们选择了个差异表达的,用.验证了在蜂王和工蜂中的表达. 结果显示这些基因的结果与数据相符台。 采用.技术克隆丁基因:采用荧光定量检测不同发育时期工 蜂和蜂王头部的基因的表达量。结果表明:该基因序列全长 口.编码个氨基酸残基.预测的蛋白分子量为 .等电点为 。经氮基 有%的同源性。该基因在工蜂和蜂 酸亭列比对,与西方蜜蜂加打; ,日 王不同发育时期均有表达.日龄工蜂与日龄工蜂中没有显著差异 龄工蜂中的表达量显著高于日龄与日龄工蜂代 :蜂王蛹中的表达量显著高 于工蜂蛹尸 :产卵 :日龄的蜂王中的表达量显著高于日龄的工蜂 。这表明可能与工蜂劳动分 工蜂与产卵蜂王中的表达量没有差异 工及蜜蜂卵巢发育有关。 关键词:中华蜜蜂:转录组测序:数字基因表达谱测序::表达分析 、『 . ?』 ”.. ?? 州... ’ . ? . ., .?艮,。/ .. ?嘲诵】. 窑 】? .. 尸 口 :?:; ; “: 第一章文献综述 第一章文献综述 中华蜜蜂的概况 是东方蜜蜂的指名亚种.简称中蜂。在我国.除 中华蜜蜂 新疆尚未发现外,其它各省均有分粕。其授粉行为对全球生态及农业生产起到至关重 要的作用.给养蜂人带来显著的经济效益。与西方蜜蜂相比.中蜂 对蜂螨的抵抗能强、嗅觉灵敏?.也能采集零星蜜粉源植物”】等优势。我国土生土长 的中蜂,在长达数千万年的进化中,具有了西方蜜蜂不可取代的优点,对于发展我国 的蜂业生产.保持物种的多样性和维持生态平衡等方面,能起到西方蜜蜂不能起到的 重要作用。 但随着经济的发展和交通日益改善.农民过多的使用农药,对生态坏境的破坏. 生物资源的过度利用及转地放牧西方蜜蜂的数量的逐渐增加.导致中蜂分布区域和种 群的数量在大幅度的减少.使山林植物授粉总量减少,导致生物多样性降低。 在年月日出版的杂志上,公布了西方蜜蜂基因组测序口和分 析结果,这标志着蜂学研究进入了一个全新阶段。中蜂具有西方蜜蜂不可替代的种质 特性和资源优势,因此对中蜂开展相应的基因组学研究和功能基因挖掘很有必要。但 目前为止中蜂的基因组信息还没有公布,杨喻晓等已构建中蜂头部文库和获得 了个有效探针】。在数据库中也仅有个中蜂序列。 雌性蜜蜂基因差异表达研究进展 目前已有西方蜜蜂中雌性蜜蜂蜂王和工蜂基因差异表达的研究报道。等 第一次大规模的对意大利蜜蜂. 级型分化的差异基因表达进行分子生 物学研究”,通过的体外翻译和?方法分析证明在蜂王和工蜂幼虫 期和前蛹期图谱有差异。和通过消减杂交法第一次筛选出 个甥型特异性表达基因位点,其中个可能在级型分化中发挥核心作用】。用芯片进 行分析发现.工蜂幼虫和具有双重发育潜力的早龄未分化幼虫在基因表达上 很接近, 而蜂王幼虫下调了许多早龄幼虫表达的基因,井上调了一套与级型相关基困的表达。 蜂王和工蜂大多数差异表达的基因与代谢过程相关,尤其是蜂王上调了许多代谢酶. 而工蜂上调了一些细胞色素家族、六聚储藏蛋白、二氢二酵脱氢酶和一个脂肪 酸结合蛋白 等发现了多个与缎型分化有关的基因.它们在蜂王和工蜂幼 虫分化时的表达水平有明显差异?。等使用蜜蜂的的微 阵列分析,发现蜂王和工蜂之间有个不同表达的基因?,许多似乎 在级型特异性结构发育过程中起重要作用,像大脑、足、卵巢。等通过蛋白质组 学方法比较了蜜蜂幼虫级型分化期间总蛋白、线粒体蛋白和核蛋白之间的不同表选 其他的研究显示在蜜蜂级型分化期间蜂王和工蜂之『刚许多表达差异基因涉及缺 氧途径七、选径”、胰岛素信号转导途径?”、抗氧化途径四和生殖状况.】。中华蜜蜂转录纽驯序厦雌性蜜蜂基固表述分析 甲基化转移酶 甲基化【 是一种很广泛的遗传学调节机制.在真梭生物 体中普遍存在瞄卫】,甲基化是通过甲基化转移酶 催化和维持的。该酶家族专一地作用于二核苷酸上。 般认为,哺乳动物的有种,分为两个家族:和另有一 种,主要是的甲基转移酶,有报导称也具有微弱的甲基转 移酶活性图.。 持续性甲基转移酶通过端结构域直接靶向复制位 点.参与复制中新合成链的甲基化口,也可直接与组蛋白去乙酰基转移酶 联合作用阻断基因的转录口“”。家族的主要作用是在复制和 修复中维持甲基化,这种维持作用可以将甲基化信息传递给予代细胞。 从头甲基转移酶包括从头甲基转移酶、和调节蛋白 。与的结构域基本相同,它们可通过结构域直接 与结合,也可与转录抑制因子或其他蛋白质发生蛋白蛋白相互作用而募集到 位点,可甲基化。是一种类似蛋白,具有半胱氨酸 富集的锌结合区域,但缺少端的酶催化活性域,因此没有单独的催化活 性。但却是从头甲基化的调节因子.通过与和的端相结合. 提高它们的催化活性,正向调节的从头甲基化】。 是甲基化转移酶家族的重要组成部分,直接导致特定基因启动子 区域口位点发生异常甲基化,进而使基因失活,可能参与细胞生长分化调 控】。 一琳:。‘ ?。’‘ / ? ? 一? ? . ? 图 的家族成员及其结旮 一 第一章文献综连 的结构由端调廿、端催化区和呻间连接医三部分组成。端调?区育多个不同 的结构域目起始密码千.包括核定位信号、细胞核增埴抗原绱台匣、多澳同 游 、富台’胱氮酸锌指结台基序【、四肚染色质结台。端莅 化区有个不同特性的基序,罗马数字表示酶结翰中的一些保守序划.医结台 甲墓供体即一 腺茁甲硫氨酸.区能够童台雇物胞嘧啶; 蜜蜂中的研究进展 随着西方蜜蜂基因组的公布,科学家首次在昆虫中拉现了一个完善的功能性 甲基化系统”习【。蜜蜂拥有种甲基化转移酶.分别是,和 。甲基化在 ,与哺乳动物的甲基化转移酶非常相似,同源性高 意蜂基因组进化上确关键性的作用.与重要的发育过程有关.其中包括级型 分化口”】。 等利用显微注射和干扰技术抑制了基因的表达.经 处理过的蜜蜂幼虫大多数发育成具有成熟卵巢的蜂王,其卵巢管数与蜂群中自 然发育的处女蜂王无显著差别“。等通过人工饲喂蜜蜂雌性幼虫.发现随着蜂王 浆饲喂量的增加幼虫头部 相对表达量显著下降,蜜蜂朝着蜂王方向发 育口”。石元元等通过对日龄的蜜蜂雌性幼虫人工注射 .使其表 选沉默,测定出房蜜蜂的形态指标,发现幼虫也显著朝着蜂王方同发育【”。测序技术 转录组是特定组织或细胞在某一功能状态或发育阶段下转录出来的所有的 .。整个转录组分析的 集合。主要包括和非编码 如起始位点‘ 主要目的是:?对所有的转录产物进行分类;?确定基因的转录结构 及味端.剪接模式和其他转录后修饰:?量化各转录本在发育过程中和不同条件下 表达水平的变化”??。 测序,即测序又称转录组删序,是近几年发展起来的一种高 通量测序技术进行转录组分析”,这种测序技术首先是将细胞中的所有转录产物反转 录为文库”.然后将文库中的随机剪切为小片段或将片 段化后再反转录,可产生成千上万的短 。用参考基因组校对这些短, 或无参考基因组时组装他们从头合成,从而获得包括转录结构和每个基因的表达水平 的基因组转录图谱】。该技术能够在单核苷酸水平对任何物种的整体转录活性进行检 测,对转录本的结构和表达水平进行分析.也能检测到未知转录本和稀有转录本,精 确地识别编码序列单核苷酸多态性和可变剪切位点,提供更为全面的转录组 信息”。 的测序数据具有高度的重复性,技术的变化相对较小。在许多生物体中 这种技术已广泛的用于从头组装,例如白粉虱、褐粉虱五、紫衫『】和巴西橡胶?。 已被用来准确地监测酵母减数分裂、酵母营养生长四、白粉虱发育过程四和小鼠 胚胎干细胞分化‘期间的基因表达,来追踪发育过程中基因表达的变化,并提供不同中华蜜蜂转录纽剥序厦雌性蜜蜂基固表选分析 组织之间基因差异表达的“数字化测量一 即数字基因表达谱,新近开发的一种重要基因表达分析方法,也是基于第 二代高通量测序技术,它是基于标签的转录组溯序方法,产生短的原始标签,使用内 切核酸酶在每个分子。来端产生 的标签特异性标已该基因;后通过高 通量测序技术产生许多标签序列.不同标签序列的数目就代表了相应基因的 表达水 平。通过生物信息学分析得到标签代表的基因、基因表达水平、及样品间基因表达差 异等信息。样品中几乎所有基因的表选水平都可通过每个基因的单个.分子的 计数统计来确定;与?相比.更适合于基因图谱的比较。这两种技术已 经在转录组图谱上进行各种应用的研究,包括细胞发育,癌症.各种生物体的免疫防 御“”】。也已用于蜜蜂营养学及行为学的研究.获得多种有关蜜蜂的数掘 库一。。。除蜜蜂外,在其他社会性膜翅类昆虫间也已经进行基因表达差异分析的研究, 包括熊蜂”,蚂蚁眦”。 本论文的研究内容 本研究,用 测序技术构建了中蜂工蝗文库,获得高质量的 短序列。这些短组装成和在没有基因组参考的前提下通过同源 性比对进行注释。获得丁蜂王和工蜂的数据库并比较了它们之间的基因表达图 谱。还以中蜂为实验材料,对基因进行克隆及测芹.并比较不同发育时期工 蜂和蜂王头部基因的相对表达量。所有的数据和结果将提供一种途径 去识别中蜂新的功能基因和为蜂王与工蜂级型分化的分子生物学研究提供有用的信 息。开展本项研究,不仅是对传统中蜂生物学内容的突破和创新,而且对保 护、开发 和利用我国中蜂这一宝贵资源,有望提供新思路与方法。第二章中华蜜蜂转录组刹序和数字基因表速谱分析 第二章中华蜜蜂转录组测序和数字基因表达谱分析 引言 中蜂在其经济上有重要作用.但是中蜂的基因维信息还没有公布。目前,在 数掘库中仅有个中蜂序列,这些不足以实现对中蜂功能基因的研究。因 此,获得更多的转录组和基因表达信息对中蜂基因功能及生物学机制的研究是至关重 要的。 本研究以中蜂为材料.用/ 测序技术进行转录纽测序,并通过 方法分析比较中蜂蜂王和工蜂的基因表达差异, 材料与方法 .实验材料 实验蜂群 取自江西农业大学蜜蜂研究所饲养的中蜂。分别取日龄工蜂幼虫.日龄工蜂 蛹,刚出房的成年工蜂,哺育蜂头部不断的伸入巢房中,并且巢房中有幼虫和采 集蜂在巢房门口收集腿部带有花粉粒的蜜蜂各作为一个样品。每个样品单独提取 总的,后台并为一个样品用于转录组测序。再分别提取只刚出房的工蜂和蜂 王的总.用于删芋。 ..实验器材及试剂 .? 、,, ”系统和 测亭芯片【和 . .反转录酶及 】荧 试剂盒,分裂缓冲液 光定量试剂。 .实验方法 ..创建文库和转录组序列 用总分离系统分别提取个中蜂样品的总,将个样品台 并为一个样品每个时期取相同质量的用于转录组测序及获得尽可能多的基 因表达信息。根据设计说明把 用带有的磁珠纯化获 得。纯化的在高温下即?分钟用 裂解成短片段。以为模板.用六碱基随机引物和反转录酶合成第一链。 后加入缓冲液,,和 合成第二链。用 中华蜜蜂转最姐州序厦雌性蜜蜂基固表速分析 提取试剂盒对这些短片段进行纯化、加缓冲液洗脱后进行米端修复、加 尾巴和连接铡序接头.然后用琼脂糖凝胶电泳对片段大小进行选择,最后进 行 扩增,产物用 纯化试剂盒进行纯化获得最终的文库,建 好的测序文库用 .进行测序. ‘ . 片段大小大约在如图,。测序过程中,质量胜过产量,小片段 直上】万尽量缩小波动范围,表示过滤后质量不低于的碱基的比例, 泼参数反映总体质量情况都应高于%。 图转录组铡序实验流程 第二章中华蜜蜂转最组测序和数字基固表连谱分析 .. 序列结果的分析 藿量 嘲能显著牲富集分析????一曲出”愠著性富集分蚓 圈信息分析流程测序得到的原始图像数掘经读取删审峰图 通过分析测芋峰图文件. 读取碱基序列信息以及各个碱基的测序质量转化为序列数据图一.即 原始或原始数据.结果以文件格式存储,此文件为得到的撮原始文件.里 面存储的亭列以及的测亭质量。结果中每个都由四行来描述: 第行与第行是其序列名称为节省存储空间常省略第三行“斗‘后面的序列名 称:第行是序列;第行是序列的测序质量,其中的每个字符相对应 于第行的碱基.每个字符对应的值减去“,即为对应的该碱基的测序质量 值,比如对应的值为,那幺其对应的碱基质量值是。从 开始.碱基质量值范围为到。 在进行生物学信息分析之前,这些原始数据经过数据过滤,数据处理的步骤 如下: 去除的比例大于%的,去除只台接头的.去除低质量/质量值 的碱基数占整个的%以上。 我们使用短组装软件,?做转录组从头纽装,寸首先将具有一定 长度重叠片段的连成更长的片段,通过这些重叠关系获得的不古的组 能确 装片段称之为。然后,我们将比对回,通过 定来自同一转录本的不同以及这些之间的距离,再将这些 连在一起.最后得到台撮少,两端不能再延长的序列. 进一步通过 我们称之为髑。中华蜜蜂转录姐别序厦雌性蜜蜂基因表这分析 差塑一?一, ;呈一一, 竺:竺”“” ‰???。 ?:;?:?一 兰;?善掣“二兰;兰:.望?? “?四日。 ?口口 酉短鞋步骤圈 .,是两个著名的蛋白数掘库,其中?是经过严格筛选去冗 余的。是对基因产物进行直系同源分类的数据库,假定每个蛋白都来自祖 先蛋白,数据库是基于真核生物、藻类、细菌具有完整基固组的编码蛋白、 系 统进化关系而进行构建的。数据库是系统分析基因产物的功能以及这些基因 产 物在细胞中的代谢途径的数据库,可以用进一步来研究基因在生物学上的复 杂行为。我们能根据注释信息进一步得到的注释。 将序列与蛋白数据章、、和做比对 值】,取比对结果最好的蛋白来确定的序列方向;如果不同数据库之问 的比对结果相互矛盾,则按、?、和的优先级来确定 的序列方向,跟以上四个数据库都比对不上的我们用软件确定序 列的方向和它的编码区。对于能确定序列方向的我们给出其从到。方向的 序列,对于无法确定序列方向的我们给出组装软件得到的序列。组装后.将 序列通过比对到虽白数据库、、和值. 从而获得 给定的具有虽高序列相似性的蛋白,进一步得到该的蛋 白功能注释信息。我们根据注释信息,使用软件“得到的 .简称注释信息。来全面描述生物体中基因和基因产物的属性。 得?每个的注释后,用软件”对所有做功能分类 统计,总共有三个,分别描述基因的分子功能、细胞组分、参与的生物 过程,进而从宏观上认识该物种的基固功能分布特征。 ..创建文库并测序 用总分解系统分提取日龄工蜂和日龄蜂王样品的总。把 总用带有磁珠吸附纯化获得并以引物导 反转录合成双链。识别并切断的位点,利用磁珠沉淀纯化第二章中华蜜蜂转 录组序和数字基因表连谱分析 带订’端的片段,将其’木端连接接头。接头与位 点;】结合处楚 ;勺识别位点,是一种识别何点与酶切位点外离的内切酶, 脯切 游的片段,产生乜禽接头?手列的。通过磁珠沉淀 上掉懈段历,在术端连接接头,从啊获得两端连有不同接头序列的 避行扩增。经过线性扩增 标档文阼。再加入引物和面 个循环后。通过%琼脂糖凝腔电泳纯化的条带。解链后,单链分 被加到测序芯片掉嘲定,每条分子经过原位扩增后成为‘个单分子簇测 序模板,加入也佚光标记的种核苷酸后,采用边台成边测序洼 .进行测序图。每个通道将产三成干卜盯条臆始.缚条 的测序读为。 .’’?四‘ ????。. 一砩。.墨:???? .型墨:?, 岫 盏夏至自固 一?一一 岫?二暨盈匦图 纱 ~。一 图制备的原理和步骤 一 ’% .. 洲序文库与参考转录组数据库比对分析 删序甜到的原始图像数把经瘦取测序峰阁转化为序列数据,称之为原始数据 或原 始,结果以文件格式存储。驻面存储的序列以及的测序质量。 啡个山叫行描述: 国::】::/ 广 ”、 每个序列有行.第行与第行魁序列名称:第行足序列:第行是序列中华蜜蜂转 录组剥序厦雌性蜜蜂基因表达分析 的测序质量,每个字母对麻辣行每个减基,辞个字母对应的值减出,戡 为峨碱基的测序质量值.比如对应的值为,那么其对应的碱摹质量值是 。碱基质量值范幽为到。 原始序列带有一段’接头序列,并禽有少量低质量序列以及各种杂质成分, 原始序列数据需经过去除杂质后得到可供测序的序列。数据库的原始数据通 过去除空 载只禽。接头而找不??标签序列的、去除’接头序列由于标签强 有而测序长度为.原始上带有一段.接头序列,去除低质量 标签台有未知碱基的、去除睦度大的,取比变为的、 标签序列 去除拷凡数为的‘可能是测序错误,从而获得包台的 的,用于信息分析图。 数捌中,的拷贝数反映了相 应毓司的表达量,其分布统计可以从整体评估数】是甭一常。 根据组装的中蜂转录本序列数槲库.利用软件检索上所有的位, 生成的参考标签数据阼馥后将全部 与参考标箍数据库进行 比对.最多允许一个碱雉错配,对唯。比对到一个肇凼的标签 进行螭虱,释,统汁每个基田对应的原始数,然后对原始数做标 处理,是一个标准化的指标,指每 准化, 一百万 中包青该种转采本的拷虬数。标准化方法为:每个基因包含的原始 数/该样本中总 数,,.获得标准化的基因表达量。从而更准 确、科学地衡量基因的袭达水平。 原始数据 .,..,:一 数据 ? ????? 表达量及分布统计卜????丁???测序饱和度分析 .?......?..............?一 匿因注释、标准例 一..........,....』?? 『差异表选基因筛选 ???????????????????????????一??一 ?功能显著性富集分析卜????肚曲啪显著性富集分析 ?.??。???,?。???????‘????????????????????????????一 。。。‘?。。’。。。。。‘’。。。。。。。。。’。。。’。。。。。。。。。。一 图数字化基因表达谱信息分析游程 :..差异表达基因的筛选及功能注释 统计分十斤蜂王和工蜂的数榭库差异表达基冈。根据等描述的数字化基 圜隶达谱差异基因检测方法,筛选两样奉恒的羲肄表选基囡。去统计分析斑 每个第二章中华蜜蜂转录姐刹序和敷字基因表连谱分析 数掘库的标签频率。在多重假设检验校正和分析中.被用 束确定值的域值。 假设观测到某基因对应的标签数为,已知在文库中,每个基因的表达量 只占所有基因表达量的一小部分,在此情况下,的分布服从泊松分布: ??,为基因的真实转录数 已知,样本一总标签数为,样本二总标签数为,菜基因在 样本一中对应的数为,在样本二中对应的数为,则此基因在两样本 中表达量相等的概率由以下公式来计算: 二爿‘』, 神 或?: 蚀口果二:曲. 一、’ ,柚叫?? 假设挑选了个差异表达基因,其中个是真正有差异表达的基因,另外个 是其实没有差异表达的基因,为假阳性。锗误比例/平均而言不应超过某个临 界值,在统计时预先设定其值不能超过】%”。在获得差异检验的值时, 我们也根据基因的表达量值计算此基因在不同样本问的差异表达倍数。差 异倍数越犬.值越小,就表明表达差异越显著。在此分析中,差异表达基因被 定义为%且倍数差异在倍咀上古倍的基因。获得的差异表达基囡进 ~步做和富集分析。 舒功能显著性富集分析 .简称是一个国际标准化的基因功能分类体系,求全面描述 生物体中基因和基因产物的属性。功能显著性富集分析,在差异表达基因中 显著 富集的功能条目.进而给出这些差异表达基因与哪些生物学功能相关联。总 共有三个本体.分别描述基因的分子功能、所处的细胞位置、参与的生物过 程。 的基本单位是词条、节点.每个珊都对应~个属性。此分析首先把所有 差异表达基因向数据库://.的各映射,计算每 个的基因数,然后利用超几何检验.与整个基因组背景相比.找出在差异表达 基因中显著富集的条目.其计算公式为中华蜜蜂转录蛆剥序及雌性蛮蜂基固 表这分析 ,.一, ~四 ??铷 其中 为基困组中具有注释的基因数目;为中差异表达基圆的数目: 为基因组中注释为某特定的基因数目:为注释为某特定的差 异表达基因数目。计算得到的值利用校正之后,以值 为阚值. 满足此条件的 定义为在差异表达基因中显著富集的 。通过功能 显著性富集分析能确定差异表达基因行使的主要生物学功能。 显著性富集分析 在生物体中,不同基因之刈相互协调进而行使其生物学.基于分析可有 助于更进一步了解其基因的生物学功能。是有关的主要公共数掘库 ,显著性富集分析是以为单位,应用超几何检验,与整个 基因组背景相比,找出在差异表达基因中显著性富集的。该分析的计算公式 同功能显著性富集分析,在这里为芯片中具有越注释的基因数目:为 中差异表达基因的数目:为芯片中注释为某特定的基因数目:为注释 为某特定的差异表达基因数目。 的被定义为在差异表达 基因中显著富集的。通过显著性富集能确定差异表达基因参与的最 主要信号转导途径和生化代谢途径。 .. 验证 提取日龄蜂王和日龄工蜂的总,用变性琼脂糖凝胶电泳监测其完整性. 用紫外分光光度计检测浓度值和纯度佗值 之间。样 品用于反转录。根据试剂盒说明用反转录酶合成。乒口,抽作 .软件台成。 为内参日物”凄于保守、的氨基酸序列的引物用 反应条件:? .? 接着进行个循环循环条件:?】 ,。 。每个样品的产物特异性用溶解曲线进行分析。々扩增效率通过标准曲线 的绘制获得标准品为个倍系列稀释的点;对于每个有个生物学重复 每个生物学重复包括个技术重复。每个样品的内参基因和目的在同一个 板上进行消除板问的差异。每个基因在样品中的相对表达量用以下公式计 算; 灿,/ .;【生皇 . 内参基因的扩增效率,:目的基因的扩增效率,.:内参基因的值, :目的基因的值。 为了标准化相对表达量,计算得来的表达数据先经过开方转换,再进第二章 中华蜜蜂转录组博和数字基固表违谱分析 丁“ 方差分析。 结果 . 铡序和序列组装 通过 测序技术,莛获得..原始他表.。数据过 滤后.获得.. 累计长度为.. ,进一步进行分析。 %.含量 %。这些 含量 组装成.个.平 均长度 。的是 口。这些最终被组装成.个 ,包括.种和 条不同的.平均长度 , 的是 。组装出来的亭列长度是组装质量的一个评估标准。我们 对组装出来的和做一个长度分布统计,大小分布显示有个 长度超过丁图。 表中蜂转录组敦据统计 原始瑚的总数量 的总数量 .... 总的碱基数 % 的百分比 的百分比 % . 的总数目 的平均长度 的 的总数目. 蚰?蚪的平均长度 的 的种类 . 的杂数????????????兰里兰竺墨望兰:坚苎’竺童竺垄里查兰坌堑 、九 ?‘ 【】‘ 。;” 虻 ‰????? 。 ?‘一 “ “?篙嚣? 图南和嘻从头组装的长度分布 《?“酣四。 ? .预测蛋白质的功能注释 将。“。序列与、埘、、和数据库做呶比对 所有的 %符合‘ 俚??通过该方法,总共获得 些翌譬蛋。孳其中通过、?、、和数菇莓菇对到 的结果分别是 %, %】. 】%%。和。? ???坚生塑型竺型塑 数据库 注释四 的数日 注释.。。。鬲吾石瓦~ ?鼍五五?等等:???一型丝 卜,、篓据兰曼篓曼璺得到功能注释。分类是对磊面磊再面虿忑品‘酉历能 进 被分成三大主要类别共有个功磊孬。;昔 行分类。基乏壹型同源性, 出.,:竺苎的三大主要类别参与的生物过程,细胞组分和分子功能;:。磊” 璺篓孽:?::眢竺翼“分子键联”关系分别占主导地位。同时我们也发现代 谢过?、; 胞组分和催化活性的基因也占有很高的比例。第二章中华蜜蜂转录组测序和 教字基因表达谱分祈 口四??? & 凰? 龅的分类】的比例,一边纵坐札发小住袋一竹类, 迎纵罐杯表;扯禁特定功能分类中所 嘶的牡?数。 搜索这屿有:释序列的攮因。已注解的,巾有 柯分类翻?。这些婵有个分类,其中罐人群体楚~般 助能预测”,萁次址“转求”,“复制.重组和修复“.“翻阵,核糖 的加 体结构车?’:物起源”,然而核结构、真核细胞们细胞外结构嗣 川修饰惺最小的英群。 九??? 九??? 自????? “????~ ??“?目~ ??????~ ; ?自&??日口日?一 ?口口却 ~??? ?四目一 ?? 驰 晰?四,??一 四?自~ “?枷嗍??? ???四????【 【 一 ?’??,?“蝌 ?日? 九 铝 功齄分类 图的分类 《 砸 中华蜜蜂转录组剥序殪雌性蜜蜂基固表速分析 将中蜂,已注解的序列比对到数掘库并做进一步注释。比 对到的序列分为条信号通路附件。这些通路毋富集的是代谢途径 ,其次是细胞骨架的调,肿瘤转移途径和运输。这些注 释为进一步研究”蜂中特殊的发行、功能和途径提供有价值的资源。 . 标签测序文库 分别构建中蜂峰王和工蜂们文库片通过基因表达测序法删序,获 得了大约柚,和.个麒始。过滤掉低质最标签后,每个数据库牧得 的总 数是.,和,个表,这些 分别占原始 的“%和.%圈。在中.能够比对到参考序列 的数闷是.,和.个,分别占 %和 %。拷贝数大 的 所占的比例超过了%,而种类的分布不超过%.相反.拷贝数 在和乏问的种类的分巾比较广崮。 表 序列统计 ??坠坐丝型鲤幽卿监??一笨二章中华蜜蜂转录衄剥片和敷字基因袁达谱疗 哳 , ;蕊糕粼: ;麟糕烈享 勰四蛳%?“ 蕊四 :品黼懿黜私: ? 目 国每个样品中不同类鹏的标签在腻始中的分靠 %禽求且】碱塾的杯箍.只禽 接头的序列,拷叽数小:标签和驻始序列【姑经过上昧尔质 褂划的粕、笠所【的比例。括号内的数字表示总的原始标签中罐个类刊的杯 锭所‘白分 【匕。 ..『 “?‘?四%‘?’口 嗍岫“袖眦? ?酬;嚣 惭???蝴? 一糕一 ‰ 九“羞??%哺蚍? 蘸徽 糕一 兮。~兮 圈.每个样品中不同类型的标签在中的分布趼罐‘呕的总数: 表示所有 的种 丧所有 类。盘方括时内的数字表示某一特定种粪标箍的拷口数的范隔。在括弧山的 数字表示在这一类圳 。”杯档的总个数及‘的比例,???????????主兰童兰堕墨垫塑苎些竺苎查苎 坌堑 表达谱测序饱和度分析用检盘检测到的基因数是否随着测序量标签数量, 所水.当两数据库的澜序量达到接近 川。诅?。 ?的增加而增加。如图一 刚?捡测到的基闻数目趋饱和。 :乜萼,;荤 ? 日“ 一?‘ 严一』酬厂一 ’卜囊。卜? 啦:警姻盎黧燃熟害慧,。标签数据库与参考标签数据库进行比对 。,,苎们通芒基冈表达测序法构建了”蜂蜂】二和工蜂的标签数据库片 主篓量氅苎亨标签数据库上述提到儿序列进行比对。首先通过转录磊赫荨 兰篓鉴获望牌个不问的嗬获得.个明确的参考标箍;】荔;谋蒜 蝥掣库。在蜂正和中蜂标箍数掘库分别扶得了,和,种】五;: 蛮:曼箩警数掘库中能唯‘比对到个堪脚的标签大多越标签数据库中的关键 竺杯篓警亭们能:确的确定个转采牟。在蜂:和一蜂杯档数据库‘只,所暑。: 二 %和 %能比刘到单一序列.其,大约中比对到的 . :类粤 义链另半比对到反义链图一。总的的 %承 磊即所箸第二章中华蛮蜂转录组目序和数字基固表选谱分析 ”山?吣脚 ’甲 ”.崦.坤 ?.. ? 户;黪‰ ??? ~黔 “”吣‘‘?“~’?’耶 ?,“一?“? 户霆嚣黧沌蓖漩 ’ 。::絮篙:油批辨?、 。:嚣豁器篇二恐;;甜”川“ 斟 的比卅统计分析 .囤中备项的含义如下轰: 袭硫仝比对剑正义链的.表示一个比对刨一个丝田 农小个【比对到多个毖眦 ’ :义链:;『错配的 、 挺求完令比对到反义链勺 【 扯反义链仃错配的 雒。 个比埘剑苹洲卦个何胤一个比对到麟纠多个何矬 舡雎卦 订?错删曲‘皑 部没竹比对』.的‘ 比对划线粒体 比盯『绿体 .中蜂蜂王与工蜂问差异表达基因 为了检测刚房的蜂王和:蜂之刚的差异表达基因,我们擞捌等描述的 数字化基因表达谱差异螭闳检;方法,筛选两样本蜘的差异表达标签。在蜂?和工蜂 数榭库巾,总』?检测到个茇肆表达基删,蜂王与蜂干比有】个上调桀因和中华蜜蜂转录组剥序及雌性蜜蜂基因表达分析 个调基幽,其唷个罐吲没有被注释或注释为“假定的蛋白“啡确定性蛋 白“,即它们的功能还习;明确图,。 用分类去对这些差异表达基因的功能进行分类。对于个差异表达基心, 仪有个基因有并在三大主要类别叶被分为个功能性群体图?, 分类的三大主要类别中,“细胞”,“起催化作的”.吖谢过程”分别占主导地位。 此外,在“生物学进程’’这一类别中,啊两个娃著性富集.,然而祀、细 胞组分”和“分子功能”类别中没有履著性富集的。 进一步研究这些差异表达基脚所涉及的生化调节途径,把这些差异表达基因与 数据库进行比对并与整个转蒙组数据库进行比较,个不同表达的基因, 个基岗有 并被分类成条途径,其中.条造径显著性富集.发现与代谢 调节逢?;:有关的基因最富集。 矗:这些差异表达基【中.有许多二经被报道称在蜂二和工蜂有表达差异。卵黄 蛋 .被报道足‘生虾沸级分化有关的芙键蛋白质,在蜂 中是调的,具有高表达水平。和 也宵报道称足与社会性昆虫;】衅二和』:蜂级型分化有天的重要凶.在蜂? 也 是二调的。我们也发现报道的与蜜蜂纽型分化有关的其他基因,包括核糖体 蛋白,细 胞包索、表皮蛋自””和气味站台蛋白等。我们技现种核糖体蛋白肇崮 ,.,.., 在工蜂中是上调的.种细胞色素基 .. 在蜂王是渊的。 种表皮蛋白基因 , , ,.在蜂王和工 蜂中裘选差异显著,其中种 , . 在』蜂中是调的,乖在蜂壬中谰。我们发现种 气味结台蛋,?蜂王。上调的,种信息索结合蛋白 在工蜂、扣是二调的。除此外.涉及氧化;;原酶、线粒体基因和转运 蛋门的基因在蜂王和亡蜂中也有表达差异表。 ? ;删 ? 。篇蹴。 图一”蜂王和工蜂之间差异表达基因的数目 。三主兰竺墨丝型生主垫墨旦查兰堂坌堑???????一 口 图筹异表达基因的分类 ”“ 。”。, 以诎的纵毒怀戒示扯个类别】的?数。左边的纵啦杯收小杠这个特定类刖。 琏?所一。‘ 。 。。。【?。“。 ? .;四 的?升比 。【。 四 表差异表选基因薛 ???????????/??一???????????????一 ”。” 。 .. 中华蜜蜂转录组剥序厦雌性蜜蜂基因表达分析】. 一? : : , :.:九 : 一: 他 . . 一 『 ..??????????.???????????????????..?????....??:................... ......................................?? .差异表达基因的.验证 为了验正数据。我们选择了个謦异发选曲,嗣占螗 饪它们:蜂王和工蜂中的表达嵌。提墩蜂王和蜂的总为模板.蜂 ?基凼作为内参。结粜鼹示这些基删的结粜畸数据棚符?阁 一 。 表定量引物 . 。一 琏? ?物 ’’‘ ’不 【 。邢 ‘ ’? 。 ’ ‘ ’ 。 ’ ’ 。 ‘ ’. ’ ? ’? ’ ? :“””“。””“ . ;:器怒镭 。 ’ ’ 。 ’『 , 】 ? 三兰兰竺竺垂垄型生主茎茎兰堕望坌堑????????一 皑划骷粤 一一?; ‘ 四 ? 蠹 煞瑟蒸 鬻黧篡一 黯曩曩鬻徽一 囊耀一中华蜜蜂转录姐测序厦雌性蛮蜂基因表达分析 能。将所有的与西方蜜蜂基因包括选择性剪切变异型,从 ://..// /燃上下载进行比对 值】。.发现西方蜜蜂的基因中基因 %能与中蜂的 比对上。比对结果间接表明我们的转录组序列在所有的中蜂基因上有很高的 覆盖率。 通过分析,我们在蜂王和工蜂间获得个差异表达基因.这是到目舸为 止报道的鼋多的数掘。其中有一些是在以前研究中就已报道是涉及蜂王和工 蜂绒型分 化的关键因子.例如卵黄蛋白原和。等使用蜜蜂的/的 微阵列分析,发现蜂王和工蜂之间有个不同表达的基因训。通过微阵列 表明在蜂王中过量表达??,我们的结果与其相一致。这些结果不仅表明我们的 分析结果是可信赖的,也说明是一种能确定蜜蜂与级型相关基因的有效方 涟。 分泌蜂王浆是工蜂最重要的特征.也是蜂王和工蜂最主要的区别之一。我们发现 个核糖体蛋自基因,它们编码核糖体的主要组分和在蛋白质合成中起重要作用.在 工蜂中是上调的。这可能是因为工蜂需要合成蜂王浆,蜂王浆主要由王浆蛋白组成, 但是蜂王不需要。虽然工蜂样品仅取自刚出房的工峰,但在这个教育阶段.工蜂可能 已经开始上调这些核糖体蛋白基困的表达从而促进王浆蛋白的合成。 除了上述已报道的与中蜂或膜翅类昆虫缴型分化有关的差异表达基因外,我们也 发现了许多蜂王和工蜂的其他差异表达基因,例如,种涉及“毒液”的基因 , ?. 在蜂王中是上调的:更有 趣的是.我们发现种生理节奏基因,周期 和进出巢房’ 相关的基因在工蜂中是上调的。这可能是园为蜂王通常呆在蜂箱里.而工蜂需要外出 采集。因此,工蜂与蜂王相比有较强的生理节奏,这些与生理节奏有关的基因 在工蜂 中的表达水平也比在蜂王中的高。虽然我们仅采取的刚出房的蜂王和工蜂,没有任何 的飞行行为.但是这些基因的转录在这个阶段可能已经开始。这表明蜂王和工蜂的生 理节奏是有差异的。 除了这些注释的功能基困外,还有个差异表达基因的功能还不明确,这些基 因可能涉及蜂王与工蜂的级型分化和许多生理学特征的差异。虽然它们的功能还不明 确,但却有重要的研究价值.其中一些可能是决定蜂王和工蜂级型分化的关键基因。 通过高通量测序我们第一时间获得了中蜂的整个转录组宇列,分析中蜂蜂王和工 蜂的基因表达差异。这些结果为研究中蜂生理特征的分子机制提供了可靠依据。第三章中华蜜蜂 基因克隆及表速分析 第三章 中华蜜蜂基因克隆及表达分析 引言 尽管我们通过技术获得丁大量的差异表达基因,但是有关甲基化的 相关基因却没有检测出来,然而随着对甲基化研究的不断深入,其重要性也越 来越明显。但目前关于蜜蜂甲基化的研究主要集中在西方蜜蜂上,人们对中 华 的甲基化模式知之甚少。中华蜜蜂作为我国特有宝贵蜂种 蜜蜂‘ 资源.了解它的甲基化模式对于保护和利用中华蜜蜂这一宝贵资源具有重要意义。 本研究克隆丁中华蜜蜂基因,并比较丁工蜂和蜂王个体内 表达 特征,分析中华蜜蜂雌性级型分化与甲基化联系.以期揭示中华蜜蜂雌性级型 分化的分子机理。 材料与方法 .实验材料 实验蜂群 取自江西农业大学蜜蜂研究所饲养的中蜂。选用蜂种和蜂群群势~致的中蜂 群.随机分为个重复。 工蜂和蜂王按咀下龄期进行取样。 工蜂:同龄蛹蛹期,,日龄幼年峰.阿龄青年峰. 同龄老年蜂和产卵工蜂。 蜂王:日龄蛹蛹期,,日龄处女王和产卵蜂王。 每个时期每群蜂取头蜜蜂,每头蜜蜂作为个样品,用于甲基转移酶 基因表达量的检测,每个龄期的蜜蜂样品共计个重复.克隆所用的 样品是在巢房口随机取工蜂样。取样后蜜蜂样品立即放入液氮速冻..?保存,用 于提取总。 . 实验试剂及仪器 总提取试?盒?】,?载体,大肠杆菌感受卷细胞,.酬. .酶抑制剂购自全式盒公司: ..反转录酶及】荧光定量试剂购自公司:.? 及 凝胶回收试剂盒购自公司。焦碳酸二乙醋:宝航生物工程有限公 司分装。其它生化试剂和常规试剂均为超纯或分析纯。普通离心机飞鸽 一型,上晦安亭科学仪器厂公司产品,台式玲冻离心机中华蜜蛙转录妞测序 及雌性蜜蜂基因表达分析 公司产品,移液器公司产品,普通仪 ,? 、,?公司产品。 ..培养基和主要溶液的配制 培养基: ,溶于蒸馏水中. 蛋白陈,.酵母粉. 调至.,高压蒸汽灭菌?固体培养基中加入/琼脂粉。 缓冲液: . , , /, 加蒸馏水至。 氨苄青霉素 /; 蒸馏水中,高压灭 溶于 菌,一?分装保存。 .实验方法 .总的提取 ..实验器具的处理与准备 塑料制品:将塑料制品逐个浸泡于】%水中,高压灭菌后在烘 烤箱中烘干或置于?中小时左右烘干。 玻璃制品:在‰水中泡小时左右.高压灭菌,‘烘干.用蒙锡纸 包裹?干烤过夜。 金属制品及瓷研钵:镊子等洗干净后?干烤过夜不需要泡水。 ...试剂配制和准备 水:】双蒸水中加,放在摇床上过夜后备用。泡实 验器具的水不需要高压灭菌.配制其它溶液的水需要高压灭菌。 %醇要在抽提时现配:用无水乙醇和水配制水:无水乙醇 :,然后放于一?备用。 、氯仿、异丙醇:放八棕色瓶。 氯仿:放入棕色瓶。 .. 提取步骤 %双氧水棉球擦净工作台,开启冷冻离心机?预冷转子。 液氮预冷研钵、研棒,缓慢加入少量液氯, 管插冰上预冷。 向. 管中加入 ,插到冰上。 取只蜜蜂头部,液氮研痞卮转移到中,漩涡混匀器上高速震荡裂 解,匀浆后样品于~。孵育分钟,以便核酸蛋白复合体完全解离.后黄于冰第三 章 中华蜜蟑 基因克隆厦表违分析 ? 离心,上清液转移到另一个管已冰上预冷。 .室温放置~。? 离 加入氧仿.用力摇晃 心 ,混合液体将分为下层的红色酚氯仿相,中问层和上层的无色水相, 全部被分配于水相中。将上清转移至另一个管中【己冰上预冷。 ‘加入 .异丙醇.轻轻混匀,室温静置。? 离心. 此时离心前不可见的沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块.移去上清 液。 %乙醇 加入 %配制.用移液器反复吸打乙醇,洗涤 沉淀。? ,弃乙醇:重复操作一次。 离心 用迷你离心机将管内壁上的乙醇甩至管底,用小枪头吸出.开盖置超 净台内晾十几秒.但不能让全部干透,内壁上没有永珠即可。 视的量加入无水~.,轻弹管壁.充分溶解.混 匀后分装出少许用于测定浓度和电泳检测。其余获得的溶液保存于.。。 ... 质量检测 ?取止总进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。 ?紫外分光光度计下读浓度值和/值 之间表示纯 度较好,小于,说明含提取的中可能有蛋白质的污染,可以用酚或氯仿抽提 去除.大于.表示降解.每个样品读数扶.取平均值作为最终数掘。 原液浓度稀释倍数。 ..反转录合成第一链 用反转录试剂盒对总进行反转录.在扩增仪进行反应 操作方法:制各混合反应液: 试剂 体积 反应液 酶抑制剂: 】 .反转录酶/ 无酶水 总体积 体系混匀后,反应,灭活 ,一个循环;反应结束后,将反转录???????????兰皇 堡壁墨塑型生型苎兰兰查釜坌堑 产物放在冰上待用或.。保存。 .引物设计与合成 的序列及比划.设计对简 ,,.銎掘。“登录的西方蜜蜂 和 和由上 未 物妻?和 海生工生物工程公司怠成?进行扩增,用于克隆中蜂的 片段。 寰中蜂甲基化基因克隆引物 一 ?九一? 一 ??????????????????????????????~ 反九呲骼四篙裟辄 爱一 篓嚣 豢赫撇 一..粤孕过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的片段与其它片段分开,用干净的手 术 兰箜苎呈的..片段的琼脂糖凝胶块切下,尽量将多余的部分切除.放入提前 称 重的干净离心管内,称得胶重。 ,其间不断温和地上下翻转离心管,以使 ?.竺尊塞::管置于。水浴 。一 胶块充分溶解。 ‘ ?。竺鉴篓三娄堡型的溶液加入到吸附柱内室锰下放置,。离心, 倒掉收集管中的废液,将吸附柱放回收集管中。 离心 ,倒掉收集管中的 ?,皇竺曼亭胄加入止漂洗液, 废液将吸附柱放回收集管中,将此步骤重复一次。 为尽量除去残留的漂洗液,将空吸附柱和收集管放入离心机。 离心茅三章中华蜜蜂 基因克隆强袁遮分析 .而后将吸附柱在室温下放置数分钟,彻底地晾干,防止歧留的漂沈液影响后 续实验。 ?将吸寸柱故八干净的 离一管中.在吸附膜中央加入.此洗脱液 , ,室温静赶一 。将所得到的溶液置 离一 于一。保存或用于后续试验。 . 产物的克隆 重组质粒的转化及鉴定 克隆反应体系的建立 在微型离心管中依次加入溶掖: 产物 .乩根据产物量可适当增减,撮多不超过 ,. ,轻轻混台室温?.?反应 。反应结束后,将 离心管置于非上, 转化 】加连接产物于止感受态细胞中在感受志细胞刚刚解冻时加入连接 产物,轻弹混匀,冰浴?。 ?热激 ,立即置于冰上 。 加止平衡至室温的/不台,转、 孵育小时。 取 , /混台.均匀地涂于准备好的平板 上,在?放置分钟。 待,被吸收后,取止菌液铺板,培养过夜为得到较多克 隆 离心】.弃掉部分上清,保留乩,轻弹悬浮菌体.取全 部菌液涂扳,培养过夜。 方法鉴定阳性重组子 挑选白色克隆至儿无菌水中,涡旋混台。 反应体系中取“混台液用作反应的模板,用正向引物 和反向引物鉴定重组子。反应条件:预变性】分钟裂解细胞,失火核酸酶.变 性 秒,?退火秒,?延伸个循环,后延伸分钟。确定包含重组子的 克隆。 将验证的包含重组子的白色克隆,接种子/的液体培养基中,过夜培 养。序列测定由上海生工生物技术有限公司完成。 . 序列的测定和分析 利用软件将测序后获得的小片段序列进行拼接获得完整的基因的 序列:利用在网站进行序列相似性