乙醛脱氢酶提取工艺与活性研究

乙醛脱氢酶提取工艺与活性研究 洼压料技大学 论文 政研论文下载论文大学下载论文大学下载关于长拳的论文浙大论文封面下载 题 快递公司问题件快递公司问题件货款处理关于圆的周长面积重点题型关于解方程组的题及答案关于南海问题 目: 乙醛脱氢酶提取工艺与活性研究 申请学位学科:工学硕士 所学学科专业:生物化工 培养单位:生命科学与工程学院 硕士生:李鑫 导师:毛跟年教授 年月 :...................................... .乙醛脱氢酶提取工艺与活性研究 摘要 乙醛脱氢酶 ,,.....广泛存在于 各种动物、植物和微生物体内。在人类和其他许多动物体内,线粒体乙醛脱 氢酶能把对生物体有害的醇类转化,所以在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到 高度关注;同时,乙醛脱氢酶在分子生物学以及相关疾病的 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 方面也多有 研究应用。 本文对啤酒废弃酵母中乙醛脱氢酶进行了提取,采用低浓度偏碱性磷酸 盐缓冲液抽提。破碎酵母细胞释放乙醛脱氢酶采用了高压匀浆法,纯化过程 采用了硫酸铵分级沉淀、? 一离子交换色谱、 凝胶排阻色谱技术,逐步探索出分离、提取、纯化的合适方法和条件。 破碎废弃酵母提取乙醛脱氢酶结果为./酵母泥、匀浆两次结果为 ./酵母泥,最后得到的乙醛脱氢酶样品纯化了.倍,回收率为 .%。同时考察了酶的性质,结果表明,啤酒酵母线粒体乙醛脱氢酶主要以 为辅酶,催化乙醛反应的最适为.,在.以上保存较为稳定, .时,乙醛脱氢酶的值为./、 该酶最适反应温度为?;在 为.;金属离子对乙醛脱氢酶活力影响结果为:对有较 、也表现出一定的激活作用,其他金属离子如、 大的促进作用, 、对酶活性表现出不同程度的抑制作用。该酶具有广泛的底物专 一性,催化包括乙醇在内的某些一级或二级醇、醛和酮的脱氢反应,其中乙 醛为乙醛脱氢酶最佳作用底物。 对乙醛脱氢酶活性研究主要集中在其体内催化乙醛代谢性能上,体外试 验结果表明,乙醛脱氢酶在人工胃液、肠液中以乙醛为底物的反应,导致乙 醛浓度的降低,在人工胃液中乙醛含量降低了.%,在人工肠液中乙醛含 量降低了%。体内试验选用的是昆明种小鼠,以小鼠翻正反射消失、恢复 时间和小鼠血液中乙醇含量变化为指标进行考察。试验表明乙醛脱氢酶解酒 剂量组与对照组,在延长小鼠醉酒时间和缩短小鼠酒后睡眠时间方面有显著 差异,表现了解酒效果。同时,小鼠体内乙醇含量检测表明,阳性对照组和 乙醛脱氢酶各剂量组,在各个时间点都比对照组小鼠血液中乙醇含量低。 关键词:乙醛脱氢酶,分离纯化,活性作用 ,..... .,,,,曲 ;, . , , .?, , , , . . . , . .%. , , ., , ., ?;.,. ./, ;:十 ; ;,矿十 ,,. ?, ,. 懿, ; .%, % ,., ., ,., . : , 目 录 摘要?..?.? 绪论.. .乙醛脱氢酶简介 ..乙醛脱氢酶种类? ..乙醛脱氢酶结构?. ..乙醛脱氢酶的病理生理意义??. ..乙醛脱氢酶的制备??. .啤酒废酵母利用价值?.. .乙醛脱氢酶分离、纯化和鉴定。 ..酶的抽提.. ..初级分离的沉淀技术..离子交换层析?。 ..凝胶过滤?. ..乙醛脱氢酶的鉴定 .课题研究的目的意义?. .主要研究内容.. 啤酒废酵母中乙醛脱氢酶提取工艺研究? .试验材料及仪器设备? ..材料??. ..试剂??. ..仪器设备.. ..啤酒废酵母预处理工艺. .试验方法??。 ..乙醛脱氢酶活性检测方法 ..蛋白质含量的测定..酶原液的提取? ..硫酸铵分级盐析?。 .. .阴离子柱层析分离? . . .. 凝胶层析分离? ?..部分溶液配制? ..仪器设备 .试验方法??一 ..相关定义 ..体外试验 ..体内试验 ..观察并记录时间。 ..统计学处理.结果与讨论. 、结??.. 结论与展望.结论 .展望 致谢?. 参考文献攻读硕士学位期间发表的学术论文? 原创性声明 乙醛脱氧酶提取工艺与活性研究 绪论 .乙醛脱氢酶简介 乙醛脱氢酶 舢,.....广泛存在于真核生物和原 核生物中,在辅酶存在的条件下,它催化包括乙醇在内的某些一级或二级醇、醛和酮 的脱氢反应【。 ..乙醛脱氢酶种类 乙醛脱氢酶家族是一系列氧化各式各样脂肪族醛、芳香族醛为相应酸的酶 【】。使用马同工酶来进行命名,位于细胞液内的命名为。 而位于线粒体内的为。后来根据正向电泳迁移的降低和等电点增加 的序列,将命名为、、和。哺乳动物乙醛脱氢酶根 据其亚细胞所在位置、结构与动力学特性和原始序列的相似性可以分为三类【】。第一类 是细胞质的,第二类是线粒体的,第三类则是可诱导性的细胞质的乙 醛脱氢酶和可诱导性的微粒体的乙醛脱氢酶如。目前,对前两类乙醛脱氢酶进 行了广泛的研究,并发现其有效促使短链脂肪族醛和芳香族醛的氧化。相比较之下对第 三类乙醛脱氢酶的研究较少特别是对微粒体乙醛脱氢酶的研究,大鼠肝脏、兔子肠道、 人类肝脏和人白血细胞中都发现了微粒体乙醛脱氢酶的存在【,但作用机制 尚不明确。 ..乙醛脱氢酶结构 根据四元结构和、酶促动力学特征、组织和细胞分布,人体器官和组织至少有种不 同基因编码、. ,但根据底物特异性和亚单位组成, 只有和才被认为是“真”,为人体肝内的两种主要同工酶,他 们的基因分别位于号和号染色体。位于线粒体内,而、、 位于胞液内。和为纯四聚体,由分子量为的亚单位组成,含. 个氨基酸,他们的氨基序列,%是相同的,并且具有相类似的三维立体结构【。引。 在氨基末端进行乙酰化,而有一个不完整的氨基末端,并且具有不均匀 的其实部分。 胞液和线粒体同工酶的基本结构和蛋白质功能之间存在某种相关性。 残基是酶的活性部位,它可以与碘乙酰胺和戒洒硫发生反应,而与线粒体 同工酶的催化活性直接有关。当东方人同工酶羧基末端被置换后, 的酶功能完全丧失。 的基本结构包括酶的活性部位和辅酶结合部位。是一种独特的多肽四陕西科技大学硕士学位论文 聚体,它的结构与其他脱氢酶完全不同。人和马胞液的结构基本相似,有%的 同源性;而线粒体同工酶只有%的同源性,说明人体两种同工酶有进化 差异。 ..乙醛脱氢酶的病理生理意义【】 的生理意义主要在于它对乙醛的解毒作用。许多生物胺通过单胺氧化酶和胺 氧化酶转换为对应的乙醛,而乙醛对人体器官和组织可以产生多种毒性作用。二胺氧化 酶产生的生物体醛的分解代谢通过的调节。可以催化组胺和丁二胺的代谢,而乙 醛可以干扰这些物质的代谢。 一乙醛的代谢作用 尽管乙醛在大量组织中很快被代谢,但乙醇氧化时,乙醛的大量代谢产物很容易在 肝脏和血液中积聚:而细胞膜进行脂质过氧化时,血液乙醛浓度也增加。大量的乙醛与 血细胞成分进行可逆性结合,经血液运输并在心脏外组织释放。乙醛与多种蛋白质进行 共价结合,改变器官的功能和结构。乙醛.蛋白质加合物的形成可以损害许多酶的催化功 能,导致抗乙醛抗原决定簇抗体的产生,结果加重乙醇诱导的肝损害。眼组织通过光照 射、紫外光吸收和氧的供应合成大量的过氧化醛,角膜和晶状体可以迅速降解 合成的过氧化醛,而发挥重要的解毒作用。 酗酒者和有遗传倾向的个体饮酒后,血液中可形成持续的、高浓度的乙醛,这是酒 精中毒的一个重要生物指标。酒精滥用可以产生大量的乙醛,而这种高浓度乙醛能够增 加组织损伤的危险性,同时形成大量的生物体胺醛,如四氢异喹啉。这样,人体内乙醇 和乙醛代谢的遗传差异,是人体对乙醇产生耐受和成瘾变异的原因。 二乙醇敏感的生物学机制 目前认为,大量饮酒导致的毒性反应不是乙醇造成的。而是乙醇在体内代谢产物乙 醛造成的,乙醛具强烈的拟交感作用,它能促进体内儿茶酚胺的释放,从而导致心率加 快、心排血量增加、外周血管扩张,部分人表现出面部潮红。抗组胺类药物能够阻止乙 醛引起的面部潮红现象。 肝脏和红细胞内的遗传异常是造成面部潮红者血液乙醛浓度升高的因素,与 戒酒硫抑制后血液乙醛浓度提高相似,且乙醛引起的不良反应与乙醇敏感的症状完全相 同,正如前面所述,东方人不能迅速代谢由乙醇代谢生成的乙醛,主要原因是因为 缺损。依据有:?东方人中的线粒体酶的遗传性缺损的发生率高;?低红细胞 活性与饮酒后心率加快负相关:?缺损者的酒精敏感程度与其血液乙醛 浓度升高呈正相关:互缺损者比无面部潮红的正常者有更高的血液乙醛 浓度,但他们的乙醇浓度却相同;?因乙醛转化成乙酸的速率减慢,故缺损者 乙 醇转化成二氧化碳的速率减慢。因此,东方人摄取乙醇后产生的面部潮红可能是由于他 乙醛脱氢酶提取工艺与活性研究 们不能快速而有效地代谢乙醛。这些结果已经清楚地说明由于酶的异常,使乙醛 的氧化减慢、血液乙醛浓度升高、儿茶酚胺释放增多,从而引起烦躁不安的症状。 三异常和酒精过敏 乙醇代谢酶的遗传变异和环境因素是引起酒精个体差异的重要原冈。由于人群中存 在和酶的遗传多态性,乙醇代谢、饮酒习惯和酒精中毒之间存在明显的种 族差异和个体差异。由于是氧化乙醛的酶,因此它的缺损和异常,使得血液乙醛 浓度升高,儿茶酚胺释放增多,从而引起而部潮红等不良反应或酒精中毒,缺损 或异常的人,不能快速代谢体内生成的乙醛,使得血液中乙醛含量升高。因此, 异常的个体比正常人对酒精更敏感,更容易出现酒精过敏,表现为心率过快、面部潮红 等不良反应。 四缺损和酒精中毒的发生率 尽管东方人线粒体酶的遗传缺损的发生率高,但酗酒日本人缺损的 发生率低于对照健康人、精神病人和药物依赖个体;中国人酗酒者和等位 基因的发生率也低于对照健康个体。对个酗酒者进行调查,发现大约%的酗酒者 有缺损,而药物依赖个体、精神分裂症患者和健康对照人中%以上有 缺损。缺损的个体由于饮酒少,很少发展成习惯性饮酒者,因此他们很少患肝脏 疾病,也很少成为酗酒者。 美国和墨西哥印第安人代谢乙醇的速度比白种人快,他们同样对乙醇敏感,容易产 生面红和各种血管舒缩症状,但是他们的缺损发生率相对较低,为%左右。 当地印第安人中酒精滥用和酒精中毒现象相当普遍,而缺失者如果持续饮酒,会 使血液乙醛浓度迅速升高并产生严重毒性,同时通过胺醛浓缩物的形成最终导致成瘾。 尽管美国印第安人缺失发生率相对较低和他们对酒精不耐受,但是社会和文化环 境的改变促使他们容易感染酒精滥用。 同工酶和酒精肝病的关系 乙醇经过和代谢产生大量的乙醛,而高浓度乙醛对和异 常的人产生严重的器官损伤和组织损伤,同时增加与乙醛相关器官和组织损伤的危险性。 事实上,具有正常基因的个体,如果大量酗酒,也会引起严重的肝损害和肝病。 其次,习惯性饮酒的缺损个体,外周淋巴细胞姐妹染色单体交换的发生率明显高 于每天饮酒的正常者。肝硬化和胰腺炎病人,等位基因的发生率也显著 高于健康人。因此,和酶活性的正常人,产生酒精相关器官损害的危险性 高于酶活性异常者。 六酒精滥用和的改变 .肝脏 陕西科技大学硕士学位论文 乙醛、乙醇氧化的活性代谢产物是饮酒造成肝毒性和肝损害的主要原因。酗酒者比 非酗酒者有更高的血液乙醛浓度,这可能是由于肝缺失造成乙醛氧化被损害的结 果脂肪肝的嗜酒者肝胞液内选择性降低,慢性嗜酒者肝内线粒体 和红细胞的活性也降低。然而,当乙醇摄入减少时,肝内活性又会升高。 .红细胞 在人体血液内,红细胞具有氧化大量乙醛的能力和含有活性。慢性嗜酒者与健康 人、非嗜酒精神病人和胃肠道病人相比较,血液红细胞活性明显被耗竭。随着细 胞的老化,红细胞活性逐渐降低。嗜酒者中,幼稚红细胞内活性也很低。 当红细胞按照衰老程度划分为不同等级的细胞时,嗜酒者和健康对照者红细胞内 活性和总蛋白浓度的分布从顶层到底层完全不一致。因此,红细胞内活性的降低 与乙醇所致肝损害的程度没有相关性。红细胞活性的下降主要有以下几方面的原 因:?降低酶蛋白质的合成;?降低酶的催化活性;?酶蛋白质合成的稳定性下降;? 加速酶蛋白质的降解;?翻译后修饰或乙醇及它的代谢产物对酶的抑制,通过过氧化酶、 矿或等阳离子的缺失,以及谷胱甘肽等化合物的缺失,产生了异常的复合物。很明 显,翻译后的改变是嗜酒者红细胞内损失的主要原因,而加速红细胞的老化或损 害红细胞生成所引起的酶分子变性,可能不是酶活性损失的主要因素。正如前面所述, 尽管衰老红细胞活性比幼稚红细胞要低很多,但在嗜酒者中,幼稚红细胞和老化 红细胞活性的降低是相同的。 ..乙醛脱氢酶的制备 目前,天然的难以获得,大多是从动物的肝脏、胰腺或肝细胞线粒体中提取, 其资源有限且价格昂贵,因此很难大规模生产,为了拓展的来源,科学家们探 索 从微生物中提取。国外在此方面做了大量工作,早在上个世纪年代, .【】就对从酿酒酵母中提取进行了研究。国内吴桂英等【】报道了从破碎酵 母细胞提取的新工艺,考察了自溶、反复冻融、超声波和高压破碎仪的细胞破 碎方法对释放的影响:周百灵等【利用超声波破碎、硫酸铵分级盐析以及. 阴离子交换层析等方法提取了酿酒酵母胞浆内的并对其酶学性质进行了研究,这 就为酶的获得提供了宝贵资料。 在探讨从微生物中提取乙醛脱氢酶的同时,学者们还通过对菌种定向诱变和培养基 优化提高微生物的产酶量。刘清利【】等通过紫外线和激光诱变醋酸菌,选育出株 乙醛脱氢酶高产菌株,该正突变发酵酶活为./湿菌体,比出发株提 高了%,且酶活在代内稳定;王红波【”】等通过单因素试验和正交试验,对巴氏醋杆 菌产乙醛脱氢酶的发酵培养基进行了优化,确定了培养基的最适条件和组分,提高了发 酵培养生物量和产酶酶活:吴桂英【】等人还对对酶学性质及发酵条件也进行了初步的研 乙醛脱氢酶提取工艺与活性研究 究,得到酿酒酵母产乙醛脱氢酶的最优发酵条件。 .啤酒废酵母利用价值 我国现在啤酒年产量超过万千升,位居世界第一,并且以%的速度递增。 随着啤酒产业的迅速发展,啤酒生产过程中的副产物及废弃物也迅速增加。啤酒废酵母 指的是啤酒酿造完成后,沉淀在发酵罐底部的酵母泥,主要由仍具有活性的酵母细胞和 酒花碎片及少量死、弱细胞组成,是啤酒生产过程中最主要的副产品之一。据估算,每 生产吨啤酒大约得到湿啤酒酵母..吨含水~%,折合干酵母含 水~%约为...吨,如此推算,目前全国一年可回收干酵母万吨左右。啤 酒废酵母是单细胞微生物,他的细胞内除了含核酸等多种活性物质,还含有多种完整的 酶系如乙醛脱氢酶,因此啤酒废酵母是提取多种生化物质及生化药物的宝贵资源。若能 对此加以开发利用其经济效益非常可观。同时,酵母泥生物耗氧量和化学耗氧 量在/以上,约占啤酒厂总污染的三分之一。因此,回收利用废弃 酵母,可以减轻环境污染,保护生态平衡,使啤酒工业成为绿色循环工业,具有广泛而 长远的社会效益。 .乙醛脱氢酶分离、纯化和鉴定 多数蛋白质可溶于水、酸、碱和盐溶液,部分与脂类结合的蛋白质如膜蛋白则溶 于乙醇、氯仿等有机溶剂中,因此,不同蛋白质或酶所采用的提取方法是不同的。乙醛 脱氢酶的提取和纯化可以使用常规的蛋白质分离纯化方法,如盐析法、离子交换层析、 凝胶过滤及其他一些层析技术。 ..酶的抽提 抽提一般用于蛋白质或酶粗分级阶段,目的是把目标蛋白质或酶从细胞或组织中尽 可能溶解、分离出来。乙醛脱氢酶是胞内酶,抽提首先要考虑的是合适的细胞破碎方法, 图.列出了一些主要的细胞破碎方法。其次,要选择合适的抽提液,因酶的电解质性 质,所以在选择溶剂时多以水溶液为主。提取过程中通常通过添加一定量的中性盐来提 高溶解度,使待分离的酶最大限度溶于提取液中,一般使用盐浓度在../;对 于各种结合蛋白质的提取通常使用更高的盐浓度,用于破坏离子键。酶在其等电点时溶 解度最小,任何偏离等电点的条件都会导致溶解度增加,因此通过调节抽提液的 值,把目的酶最大限度抽提出来;但是应避免使用过低或过高的环境提取液, 否则 容易导致酶失活。陕西科技大学硕士学位论文 固体剪切作用 法 厂机 ‘。 篓 厂????、?? 液体剪切作用 番 三二三二 妻? 干燥处理 非 机 \械 法 酶溶法 厂????、? 溶胞作用 化学法 厂????、 物理法 图细胞破碎方式.? ..初级分离的沉淀技术【他】 初级分离是指从菌体发酵液、细胞培养液、胞内抽提液细胞破碎液及其他各种 生物原料初步提取目标产物,使目标产物得到浓缩和初步分离的下游加工过程旧。初级 分离的对象往往具有体积大、杂质含量高等特点,因此初级分离技术应具有操作成本低、 适合于大规模生产的优势。 ...蛋白质的表面特性 通过降低蛋白质周围的双电层电位亏电位和水化层厚度来降低蛋白质的稳定性, 实现蛋白质的沉淀。电位和水化层厚度与溶液性质如电解质的种类、值、浓度 等密切相关,所以,蛋白质的沉淀可采用不同的方法,例如,加入无机盐的盐析法、 加入酸碱调节溶液值的等电点沉淀法、加入水溶性有机溶液的有机溶剂沉淀法等【。 ...盐析沉淀 .水溶液中蛋白质的溶解度在生理离子强度范围内../最大,低于或 高于此范围时溶解度均降低。盐析法就是利用蛋白质和酶等生物大分子在浓盐溶液中溶 解度的差异,通过向处理溶液中引入一定数量的中性盐,使不同溶解度的生物分子先后 凝聚而从溶液中析出,从而达到分离目的的一种方法。盐析是一个可逆的过程,在低盐 浓度下,蛋白质随着盐浓度升高,溶解度增加盐溶作用;继续升高到一定浓度时,蛋 乙醛脱氧酶提取工艺与活性研究 白质分子不同其溶解度又表现出不同程度下降盐析作用,先后从溶液中析出,达到分 离目的。 盐析的机理是由于高浓度盐离子可破坏蛋白质周围的水化层,使得蛋白质胶体性质 遭到破坏,凝结并沉淀析出。由于不同蛋白质分子的结构不同、侧链残基性质不同,分 子大小和疏水作用各不相同,使得沉淀各种蛋白质所需的盐离子浓度也不相同,因此可 通过调节提取液中盐浓度使各种蛋白质分别沉淀出来。影响盐析的因素有:温度 。 值蛋白质浓度。 蛋白质盐析常用的中性盐,主要有、、、等。因 温度系数小而溶解度大,且不易引起蛋白质变性,所以应用最为广泛。硫酸铵 溶液的 值常在.~.之间,如果使用其他条件盐析时,可使用氨水或硫酸进行调节。盐 析操作结束后,通常需要将蛋白质巾的盐除掉,常用的方法有透析、超滤、过 .或.柱,其中透析除盐需要时间较长,常在低温下操作。 ...等电点沉淀法 蛋白质是一种两性电解质,在等电点时溶解度最小,各种蛋白质因侧链或残基基团 不同,所以等电点各有差别。因此可通过调节蛋白质溶液的值,使不同蛋白质分别 沉淀出来。等电点沉淀法同盐析法沉淀蛋白质相比,其优势是不用进行后续的除盐操作, 但等电点沉淀法很少单独使用,因为过低或过高的环境都容易导致蛋白质变性。 ...有机溶剂沉淀法 向蛋白质溶液中加入丙酮或乙醇等水溶性有机溶剂,水的活度降低,随着有机溶剂 浓度的增大,水对蛋白质分子表面荷电基团或亲水基团的水化程度降低,溶液的介电常 数下降,蛋白质分子间的静电引力增大,从而凝聚和沉淀【。此法分辨力比盐析高,但 容易引起蛋白质变性,应在低温下进行。 ...其他沉淀法 非离子聚合物、聚电解质和某些多价金属离子可用作蛋白质的沉淀剂。例如,非离 子型聚合物聚乙二醇既是蛋白质稳定剂,也可促进蛋白质的沉淀。其作用机理 尚不清楚,一种说法认为与有机溶剂的作用相似,即降低蛋白质的水化度,增大蛋白质 问的静电引力而使蛋白质沉淀;另一种说法认为是的空间排斥作用使蛋白质被迫挤 , 靠在一起而引起沉淀。 聚电解质对蛋白质的沉淀作用机理是在蛋白质问起架桥作用。同时,聚电解质还兼 有降低水化程度和盐析的作用。利用聚电解质的沉淀方法主要应用于食用蛋白质和酶的 提取,用于提取食用蛋白质的聚电解质有酸性多糖、羧甲基纤维素、果胶酸盐、海藻酸 盐和卡拉胶等。 某些多价金属离子可与蛋白质分子上的某些残基发生相互作用而使蛋白质沉淀。例 陕西科技大学硕士学位论文 如和孑能与羧基结合,和能与羧基、含氮化合物如胺以及杂环 化合物结合。金属离子沉淀法的优点是可沉淀浓度很低的蛋白质、沉淀物中 的金属离子 可用螯合剂或离子交换树脂除去。 ..离子交换层析【. 是发展最早的色谱技术之一,是在 离子交换色谱 以离子交换剂为固定相,液体为流动相的系统中进行的,依据流动相中的组分离子与交 换剂上的平衡离子进行可逆交换时的结合力大小的差别而进行分离。离子交换作用是指 一个溶液中的某一组分离子与一个固体巾的另一利具有相同电荷的离子互相调换位置, 即溶液中的离子跑到固体上去,把固体上的离子替换下来。 目前,离子交换色谱在生物大分子分离纯化中应用相当广泛,据调查,在各种蛋白 质分离纯化 方案 气瓶 现场处置方案 .pdf气瓶 现场处置方案 .doc见习基地管理方案.doc关于群访事件的化解方案建筑工地扬尘治理专项方案下载 中,用到离子交换色谱的占/,其次是应用亲和色谱和凝胶过滤色谱分 离,分别为占//和/。在试验或生产过程中,蛋白质的纯化过程往往是通过将若干 纯化技术联合使用而实现的,在此过程中,选择合理的纯化技术和如何将这些技术合理 的组合并按顺序使用是进行分离、纯化操作所必须考虑的。一般来说,在分离纯化的前 处理、粗分级分离和细分级分离阶段,根据所需解决的侧重点不同,人们会选择不同的 纯化技术。 离子交换色谱主要依赖电荷间相互作用,利用带电分子中电荷的微小差异来进行分 离。选择适当条件可使一些溶质分子变成离子态,通过静电作用结合到离子交换剂上, 而另一些物质不能被交换,这两种物质就可被分离。离子交换法根据其操作方式可分为 柱式操作和间歇式分批操作两种,目前以柱层析方式为多。 ..凝胶过滤【】 凝胶过滤色谱 是利用具有多空网状结构的凝胶 颗粒的分子筛作用,根据被分离样品中各组分分子量大小的差异进行洗脱分离的一项技 术。等首次用一种多孔网状高聚物.交联葡聚糖胶作为固定相,在水系流动相或 称洗脱液中分离了不同分子量的物质,被称为凝胶过滤色谱。 凝胶过滤色谱技术是蛋白质研究领域内一种高效的分离纯化手段。一方面从理论上 讲,蛋白质样品在凝胶柱内几乎和固定相基质不发生任何作用,另一方面样品洗脱液均 为含盐或纯水系缓冲液,而且整个操作过程中洗脱液组成不发生变化,所以该技术在分 离纯化蛋白质时具有操作方便、洗脱条件温和、重复性好、不需要有机溶剂、样品不易 变性和回收率高等诸多优点。该技术主要可用于蛋白质的浓缩纯化,分子量及其分布范 围测定,样品脱盐以及更换蛋白质缓冲液等。近年来也在蛋白质复性研究中得到广泛应 用。在研究中为了得到较高纯度的蛋白质样品,通常将凝胶过滤色谱和离子交换色谱结 合使用,而凝胶过滤色谱可在蛋白质纯化的任何一个阶段使用。 乙醛脱氯酶提取工艺与活性研究 作为分离的核心,凝胶首先要具有三维多孔网状的分子筛结构特性,能使各种不同 分子量的蛋白质分子得以分离。凝胶介质要具备较大的外水体积和内水体积,亲水性好 且具有一定的机械强度、化学惰性和良好的色谱稳定性。在凝胶过滤色谱固定相载体的 选择巾被广泛应用的主要有交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝 胶以及聚丙烯酰胺和琼脂糖的交联物等。近年来许多厂家还开发出了硅胶质的固定相载 体,可实现高通量和高流速分离。 .乙醛脱氢酶的鉴定 目前常用的鉴定蛋白质纯度方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳和、毛细管电泳 、等电聚焦、包括凝胶过滤、各种反相、离子色谱、疏水色 谱等,此外也用一些化学法、例如观察末端是否均一。一些新的有效地方法也在引入分 析蛋白质的纯度,如质谱法。特别是电喷雾质谱的发展,仪样品就能做一 次测定,不但鉴定蛋白质的纯度,同时给出精确分子量。 应该指出,只用一种方法鉴定蛋白质纯度是不够的,至少应该用两种以上的方法, 而且是两种不同的分离机理的方法来判断蛋白质纯度才比较可靠。因为常常发现某一样 品在凝胶过滤中是纯的,而在离子色谱中却分辨为两种组分,反之亦然。又如某样品用 凝胶过滤法和.电泳证明是纯的,这仍不充分,因为这两种方法的机理是相同 的。 .课题研究的目的意义 国内外对乙醇脱氢酶的酶学性质、分离纯化等研究比较成熟,而对于乙醛脱 氢酶札的研究相对较少。目前,主要是从动物的肝脏、胰脏或肝细胞线粒 体中分离提取,资源有限且价格昂贵,这就制约了该酶的生产及应用。也有一些关于微 生物的报道,但产业化很少,主要原因一是产量低,二是分离纯化较为困难。 本 论文的主要目的是研究啤酒废酵母中的制备工艺和酶学性质,模拟胃、肠液环境 考察各种因素对乙醛脱氢酶活力的影响,通过体外模拟和动物体内试验研究对乙 醇代谢的影响,为今后的应用提供依据。 如今市场上出售的解酒药物,其药物机理大都是以提高人体自身肝、胃乙醇脱氢酶 的活性或提高血液中丙氨酸和亮氨酸浓度产生稳定来达到解酒作用 的】,直接以酶作为解酒药物成分的研究至今还非常少。是酒精在人体中代谢的 关键酶之一,在其作用下酒精在人体中的代谢物乙醛被氧化为乙酸,乙酸通过循环 代谢为和。研究表明【‘刀,乙醛具有强烈的毒理作用,若乙醛脱氢酶不足, 则饮酒后容易造成乙醛在体内累积而导致中毒发生。将适量直接灌入胃内,使一 陕西科技大学硕士学位论文 部分乙醇迅速氧化成无毒的代谢产物,可减少乙醇吸收的数量,降低乙醇及其中间代谢 产物对人体的损害。可见乙醛脱氢酶具有重要的药用价值,在预防和治疗各种酒精性疾 病方而极具开发潜力,但目前还未见到将乙醛脱氢酶制成预防和治疗各种酒 精性疾病的 药品或保健品的报道。 .主要研究内容 本课题围绕“乙醛脱氢酶提取工艺与活性作用研究”,主要研究了以下几方面内容: 、乙醛脱氢酶的制备 试验从废弃啤酒酵母中提取乙醛脱氢酶,考察了反复冻融、高速分散乳化、超声波 细胞粉碎和高压细胞破碎仪对废弃酵母细胞破碎以及酶提取的影响,选择了合适的提取 液比例、提取、提取液浓度以及提取温度。 凝 利用硫酸铵分级盐析、. 阴离子交换层析和 胶排阻色谱法对提取的粗酶液进行纯化。 、乙醛脱氢酶酶学性质研究 对制备的乙醛脱氢酶分别从辅酶依赖性、最适反应温度、热稳定性、最适、不同 下的稳定性、金属离子的影响、底物专一性等方面考察酶学性质。 、乙醛脱氢酶活性作用研究 通过体外模拟试验和动物体内试验研究啤酒废酵母中的乙醛脱氧酶在乙醇代谢中的 作用。 乙醛脱氢酶提取工艺与活性研究 啤酒废酵母中乙醛脱氢酶提取工艺研究 乙醛脱氢酶 ,,.....属于氧化还原酶类,广泛存在 于各种动物、植物和微生物体内。在辅酶存在的条件下,它催化包括乙醇在内的某些 一级或二级醇、醛和酮的脱氢反应;在人类和其他许多动物体内,线粒体能将对 生物体有害的醇类转化,所以乙醛脱氢酶在细胞解毒研究中受到高度关注;同时,乙醛 脱氢酶在分子生物学以及相关疾病的检测方面也多有应用【?。因此,乙醛脱氢酶的 研究具有重要的理论意义和应用价值。 .】对酿酒酵 酵母乙醛脱氢酶的研究最早可追溯到上世纪年代初, 母乙醛脱氢酶及其性质进行了初步研究。已报导的酵母乙醛脱氢酶分细胞浆乙醛脱氢酶 和线粒体乙醛脱氢酶两种,其中后者对乙醛的亲和力较高【】。本试验拟从废弃啤酒酵母 中提取乙醛脱氢酶,为应用打下基础,并在条件成熟的情况下进行放大试验。 本试验的研究路线如下:首先探讨合适的细胞破碎方法,从酵母泥中提出粗酶液, 凝胶 然后经过硫酸铵分级盐析、. .阴离子交换层析、 排阻色谱一系列纯化步骤得到乙醛脱氢酶,最后用电泳分析其纯 度并计算回收率及纯化倍数。 .试验材料及仪器设备 ..材料 啤酒废酵母:取自金星集团陕西蓝马啤酒有限公司 ..试剂 碳酸氢钠 分析纯 天津市科密欧化学试剂开发中心; 磷酸氢二钠 分析纯 天津天力化学试剂有限公司: 磷酸二氢钠 分析纯 天津天力化学试剂有限公司; 乙醛 分析纯 上海山浦化工有限公司; 公司; 分析纯 分析纯 广东?汕头市西陇化工厂; 氯化钾 . 分析纯 成都市科龙化工试剂厂; 分析纯 天津市河东区红岩试剂厂; 吡唑 分析纯 上海山浦化工有限公司; 分析纯 丙烯酰胺 天津市科密欧化学试剂有限公司;陕西科技大学硕士学位论文 ,.甲叉双丙烯酰胺 化学纯 国药集团化学试剂有限公司; 天津市津北精细化工有限公司; 过硫酸铵 分析纯 溴酚蓝 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司; 甘油 分析纯 天津市红岩化学试剂厂: 分析纯 天津市河北区海晶精细化工厂; %乙醇 分析纯 天津市红岩化学试剂厂: 洛阳市化学试剂厂: 磷酸 分析纯 盐酸 分析纯 北京化工厂; 硫酸铵 分析纯 国药集团化学试剂有限公司; 天津市天力化学试剂有限公司; 甲醇 分析纯 乙酸 分析纯 洛阳吴华化学试剂有限公司: 生化试剂 考马斯亮蓝 中国医药集团上海化学试剂公司: 考马斯亮蓝 生化试剂 中国医药集团上海化学试剂公司; 生化试剂 国药集团化学试剂有限公司; 生化试剂 国药集团化学试剂有限公司; 甘氨酸 生化试剂 北京奥博星生物技术有限责任公司: 次高分子量 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 蛋白 生化试剂 中国科学院上海生物化学研究所监制; . 生化试剂 . 公司; . 生化试剂 北京瑞达恒辉科技发展有限公司; 聚乙二醇 进口分装 广东省化学试剂工程技术研究开发中心 ..仪器设备 以,超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技有限公司; 高速分散乳化仪 上海弗鲁克实业有限公司; 高压匀浆机 陕西科技大学自制 紫外可见分光光度计 上海光谱仪器公司: .台式高速离心机 上海安亭科学仪器厂: 恒温磁力搅拌器 常州国华电器有限公司; 型电泳仪 北京六一仪器厂; .双垂直电泳槽 北京六一仪器厂; .型精密计 上海精科雷磁仪器厂: .×分离柱 上海华美实验仪器厂; .×分离柱 上海华美实验仪器厂; .梯度混合器 上海精科实业有限公司; 乙醛脱氢酶提取工艺与活性研究 型电脑输液泵 上海安洁电子设备有限公司; .恒流泵 上海青浦沪西仪器厂: .自动部分收集器 上海精科实业有限公司。 ..啤酒废酵母预处理工艺【,】 将收集的废弃啤酒酵母液先过筛子,除去酒花等大颗粒物质,然后加入.% 洗涤.,除苦味,最后离心,弃上清得酵母泥。 .试验方法 ..乙醛脱氢酶活性检测方法 乙醛脱氢酶的测定可以采用多种不同的体系,常用的酶活测定采用脱氢酶酶 活测定的方法。以或作为辅底物的脱氢酶可以很容易地利用分光光度法 进行测定,酶、辅酶和底物在一定温度和的条件下反应,通过还原辅底物过程 中 观测在最大光吸收的变化,可以算出每分钟/转化为 的量,从而得到该酶酶活【。常用的检测体系有 【】的反应 .锄【】的.检测体系等。 体系; . 本试验采用赵玉风等优化的活性检测体系:反应体系中含有/ . .、/乙醛.、/ .、酶液.、/ .、./.、/巯基乙醇..和%吡唑., 的酶量为个酶活单位。 蒸馏水.。定义每分钟催化还原 ..蛋白质含量的测定【】 采用考马斯亮兰染色法快速测定蛋白质含量,染料与蛋白质结合后引起染料 最大吸 收的改变,从变为,光吸收增加。蛋白质一染料复合物具有高的消光系数, 因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度,检出限为 蛋白。本试验以考马斯亮兰 为蛋白结合物,在下比色,用标准牛血清白蛋白为标准品。试验方案见表. 表.考马斯亮蓝法测蛋白质含量试验方案 .陕西科技大学硕士学位论文 ..粗酶液的提取 ...细胞破碎 通过对照试验,得到破碎酵母细胞提取乙醛脱氢酶的最适方法 反复冻融‘ 各称取经预处理的啤酒废酵母泥以下简称酵母泥,加入磷酸盐缓冲 / 液. .,;以下简称提取液,放入冰箱中冷冻 ,取出放入?冰箱中慢慢解冻;反复以上操作次。将固液混合物于/ 离心,取上清液测定蛋白质含量及乙醛脱氢酶活性。 高剪切分散乳化 各称取适量酵母泥,按:/比例加入提取液,放入烧杯中,并在冰浴的情况下保 持低温,在不同时间段、不同转速下的实验条件下进行细胞破碎。破碎完成后,迅速取 与其他方法等量的破碎液进行检测。 超声波细胞粉碎 各称取酵母泥,按:/比例加入提取液。在不同时间段、不同功率的实验条 件下进行细胞破碎。 高压匀浆法 各称取酵母泥,按:/比例加入提取液,在不同压力的实验条件下进行细胞 一 破碎。 ...提取工艺优化 考察不同料液比、提取液浓度、提取液以及温度对啤酒废酵母中乙醛脱氢酶提 取效果的影响。 ..硫酸铵分级盐析】 不同蛋白质的表面极性基团和数目分布有所不同,所以随着硫酸铵饱和度的增加, 各种蛋白质溶解度的变化存在或多或少的差异,因此可以通过改变硫酸铵饱和度来实现 蛋白质的初步纯化。 取粗酶提取液分装于个比色管中,每管。缓缓加入经研磨的硫 酸铵,分别使上述个加样比色管中的硫酸铵饱和度达到%、%、%、%、%、 %、%、%,放到冰箱静置后,离心,,检测上清液 中乙醛脱氢酶活力【。 .. 阴离子柱层析分离【.每 . 将经过硫酸铵分级盐析、透析除盐后的酶液微孔滤膜过滤,准备过. 离子交换柱。具体操作步骤如下: 乙醛脱氢酶提取工艺与活性研究 ...填料预处理 .、 .离子交换剂用起始缓冲液. 将未经处理的. 、 在常温下浸泡,将上清液中漂浮物除去。接着用./ 浸泡半小时,除去酸液,用蒸馏水将交换剂洗至中性,再用.浸泡, 然后用去离子水洗至中性,再用./ 浸泡,最后用去离子水洗至中性即 可,平衡离子为。。 ...交换剂装柱 先用缓冲液将色谱柱底部死空间内空气排空,具体操作可将柱下端接口连接 恒流泵, 缓冲液从色谱柱下端泵入,直至柱中可以看到少量液体为止。将预处理好的离子交换剂 放置在烧杯中,倒掉过多的液体,大致使得交换剂:上清体积比:,轻微搅拌混匀, 利用玻璃棒引流尽可能一次性将介质倾入色谱柱,注意液体应沿着柱内壁留下,防止有 气泡产生,当介质沉降后发现需要再向柱内补加交换剂时,应当将沉降表面轻轻搅起, 然后再次倾入,防止两次倾注时产生界面。 装柱后应当对装柱情况进行检查,可以在柱子后方放置一盏灯,或者将柱子对着光, 利用透过光检查柱床是否规整,是否有气泡或界面存在。 ...柱的平衡 平衡的目的是为了确保离子交换剂上的功能基团与起始缓冲液中的平衡离子间达到 吸附平衡。判断色谱柱是否已经达到平衡是通过检验柱中流出的洗脱液与起始缓冲液在 、电导和离子强度方面是否达到一致,由于在这几个指标中通常最难达到平衡, 所以往往检测洗脱液的即可。 ...样品上柱 从柱子出口处排出层析柱填料以上部分的缓冲液,当缓冲液面刚好到达填料表面时, 停止排液,关闭柱下端出口,加入待分离粗酶液,将酶液均匀加到交换剂的表面,开启 柱出口,待粗酶液完全进入柱子后,即可进行离子交换操作;控制好流速,以免影响分 离效果。 ...洗脱 在进行梯度洗脱时,洗脱缓冲液的离子强度或是连续发生变化的,在某一条件 下,吸附最弱的蛋白质先被洗脱,进一步改变洗脱条件后另一种蛋白质被洗脱。试验采 用离子强度梯度洗脱,具体操作通过梯度混合器如图来实现,容器中放置的是/ 溶液,容器放置的是起始缓冲液,容器和通过管路相通,容器内置搅拌 装置常用磁力搅拌子并且底部有管路导出。在洗脱的某一时刻,梯度混合器中流出 的梯度缓冲液中的盐浓度可以根据以下公式计算得出: . .?删批陕西科技大学硕士学位论文 式中: 一容器中流出洗脱剂体积为时洗脱缓冲液的盐浓度; ??起始缓冲液中的盐浓度,一般为; 一极限缓冲液中的盐浓度; 二一已经从梯度混合器中流出的洗脱剂的体积; 旷一梯度洗脱剂的总体积,是起始缓冲液和极 限缓冲液体积的总和; ??容器的横截面积; ??容器的横截面积。 图 梯度混合仪. ...样品的收集和处理 用部分收集器收集洗脱液,/管,测定各管在处的吸光度判断蛋白质组分 何时被洗脱,以及各洗脱峰分别收集在哪几只试管中。通过测定各收集液中 乙醛脱氢酶 活性判定目的蛋白峰。 .. .凝胶层析分离 酶液经过..离子交换柱后得到进一步的纯化,但是为了得到纯度 凝胶柱。凝胶层析分离的试验步骤 更高的乙醛脱氢酶,我们又将酶液过 “ 如下: ...凝胶溶胀 . 称取 置于烧杯中加入适量的./, 溶液置沸水浴中加热溶胀,充分溶胀后,将凝胶匀浆悬浮,观察上 清中是否有杂质或不均一的细小颗粒,如有则反复倾倒去除,直至上清不在浑浊为止。 ...装柱及平衡 凝胶柱的装填与离子交换柱方法类似,可依据离子交换柱的装填方法进行操作。装 填过程中应注意:处理好的凝胶装填应尽量一次完成,若不能一次完成,再次装填料时, 要注意将柱子表层凝胶层轻轻搅起,防止柱面分层。整个装柱过程中,要时刻注意不能 产生气泡和保持柱床内充满缓冲液。 平衡采用洗脱液过柱处理,一般需要用~柱体积的洗脱液来平衡。 ...上样 .离子交换柱后有酶活的组分作为样 取经硫酸铵盐析、透析和. 品。这里采用手动加样法,具体操作如下:填装好的凝胶柱经平衡后,排去多余的洗脱 液,待柱床表面留下薄薄一层洗脱液时关闭出口。用胶头滴管吸取一定体积的样品溶液, 贴柱内壁旋转缓慢加入;加样完毕后,打开柱出口,让样品液缓慢渗入凝胶床内;当样 乙醛脱氢酶提取工艺与活性研究 品液面恰与凝胶床表面持平时,按前面同样方法小心加入几毫升洗脱液冲洗内壁,并使 洗脱液高出凝胶床表面.,待恒流洗脱。 ...洗脱与收集 加样完毕后,检查柱及管路的密封性,将凝胶柱与洗脱液储瓶、恒流泵连接,开始 洗脱。根据预先设定的流速,按每管收集洗脱液,并排好顺序,待分析蛋白含量及 乙醛脱氢酶活性。 ..酶液的浓缩 .凝胶层析,合并经检测有酶活的收集液,透析除盐后放入培养 将过 肌内,在冰箱内冷冻预处理个小时,将经过预冻处理后的酶液迅速转入真空冷冻 干燥机内,真空冷冻干燥处理小时,干燥后的所得呈多孔海绵状结构的物质,即 我们所要分离的纯度较高的乙醛脱氢酶,将所得乙醛脱氢酶制品冷冻保藏。 .. .聚丙烯酰胺凝胶电泳】 蛋白质纯度和亚基分子量的测定采用卜聚丙烯酰胺凝胶电泳法,其中分离胶浓 度为%、浓缩胶浓度为%,考马斯亮蓝染色,甲醇:冰醋酸:蒸馏水:: 脱色。 标准蛋白为:兔肌动蛋白,分子量为. ;牛血清白蛋白,分子量为. ; 兔磷酸化酶,分子量为. ;钙调素结合蛋白,分子量为. ;肌球蛋白重 链,分子量为. 。 ...试剂配制 %丙烯酰胺溶液 、 .加重蒸水至,至于棕色瓶 中,?可保存一个月。 %、 分离胶缓冲液: .、 重蒸水,?可储存数月。 / %、 浓缩胶缓冲液: .、 重蒸水,?可储存数月。 / ×样品缓冲液:. ..、%甘油.、% .、.%溴酚蓝.、巯基乙醇.。 、重蒸水定容至 电泳缓冲液: 、.甘氨酸、 %过硫酸铵:.过硫酸铵、重蒸水。现用现配 %甲醇、冰醋酸。 染色液:.考马斯亮蓝加入 脱色液甲醇、冰醋酸与重蒸水混合。 ,放入 :市售化学纯需重结晶后使用。重结晶方法如下:称取 圆底烧瓶中,加约半牛角匙活性炭及无水乙醇,搅拌,摇匀。烧瓶上接一 陕西科技大学硕士学位论文 个小冷凝管。在水浴上加热至乙醇微沸,同流约分钟,用热过滤漏斗乘热过滤。滤液 应透明无色。滤液冷至室温后,移至.?冰箱中过夜。次日,通过预冷的布氏漏斗抽滤, 用少量.?无水乙醇洗沉淀次,尽量抽干,将结晶置真空干燥器中干燥或?以下 烘箱中烘干。 ...操作方法 灌制分离胶、浓缩胶。试剂加入量如表. 表 .电泳胶配制 .. 将聚合好的凝胶连同制胶模具放入电泳槽,固定后,拔掉样品槽梳子,用电极缓 冲液清洗样品孔,然后将电极槽注满电泳缓冲液,检查有无泄漏,即可进行加 样。 。加样完毕后,打开直流稳压 用微量进样器向凝胶样品孔内加样,每孔加. 电源开关,将电压调至,保持电压不变,染料进入分离胶时,改用电压电泳。 待蓝色染料迁移至距凝胶下端约处,停止电泳。 染色将凝胶取出放入染缸内,染色液染色。 脱色用脱色液脱色过夜,中间更换脱色液几次。 ..纯化倍数与回收率的测定 分别测定各纯化步骤的酶活和蛋白浓度,则酶比活为: 比活/蛋白每步所得总酶活//每步所得总蛋白浓度/ 纯化倍数的计算公式为: 纯化倍数每步所得酶液比活/粗酶提取液比活 回收率的计算公式为: 回收率每步所得酶液总酶活/粗酶提取液总酶活 乙醛脱氢酶提取工艺与活性研究 .结果与讨论 ?? ..蛋白质含量测定标准曲线 用标准牛血清白蛋白配制成/的溶液,取含~ 蛋白质溶液于小试管 中,用缓冲液调体积到.,然后加入考马斯亮蓝溶液,充分振荡混合,分钟 后于测定光吸收值。以.缓冲液及考马斯亮蓝溶液作为空白对照。结 果如图:毯 来签 鼠 邑誉 . 蛋白质含量 图蛋白质舍量标准曲线 . ..提取方法预试验 ...反复冻融法酵母细胞在.下冷冻,再在。冰箱下溶解,反复冻融次,利用细 胞内 冰晶的形成和细胞液浓度增高引起溶胀,使细胞破碎,结果见图,由图?可以 看出, 破碎液离心后上清液中蛋白质含量随时间的增大而增大,冻融次后,酶活力 呈现出下 降趋势。 一 兽 嘲 缸 峰 一烬嚣 ? 嘲冻融次数 图冻融次数对乙醛脱氢酶提取影响 . 陕西科技大学硕士学位论文 ...高剪切分散乳化 在固定时间为时,考察不同剪切速度下的破碎情况,结果见图.。剪切速度 /以下时对破碎没有明显影响,随着转速增力瞧白质含量和酶活力早缓慢增 长, 转速大于时,蛋白质含量和酶活增加不明显且有大量气泡产生。 图转速对乙醛脱氢酶提取影响 .在固定剪切速度/时,考察不同时间下的破碎情况,结果见图.,由图 可知,蛋白质含量随乳化时间的延长而增大,在一之间,酶活随时间的增 加而增大;但分散乳化超过在时,酶活反而降低,酶活损失随时间的延长而加 大, 可能由于破碎时间长产生大量气泡和热量影响活性的缘故。 图分散时间对乙醛:晓氢酶提取影响 . 乙醛脱氢酶提取工艺与活性研究 ...超声破细胞粉碎 在固定破碎时间为时,考察不同超声功率下提取效果,其结果见图.。由 图可见,随着超声强度的增加酶活力和蛋白质含量都表现出增长趋势,说明 超声功率对 破碎效果有很大的影响,输出功率的增大有利于“空穴作用的增强,使破碎效 率增大, 但功率超过时,乙醛脱氢酶活力表现出下降趋势,可能超声功率过大时影响 了酶 的空间结构】。从图中可以看出超声功率为时,提取效果最佳。 . 爸 目 卿 加 .? 越 避 皿 阍 . 超声强度 图超声强度对乙醛脱氢酶提取影响 .在固定功率为时,考察不同时间下的提取效果,对提取液进行破碎, 每间隔,摇匀取样一次取样量为,分别检测酶活和蛋白质含量,结果见图 .。由图可见,破碎液中蛋白质含量随破碎时间的延长而增大,当破碎时间至 时, 蛋白质含量增加已不明显。在~之间,活力随时间的延长而增大;在 之间,活力随时间的延长而下降,说明超声波使部分酶失活【。 . 售 、, ? 咖 钿 囊 憾 溢 皿 嘲破碎时问 图破碎时间对乙醛脱氢酶提取影响.陕西科技大学硕士学位论文 ...高压匀浆法 常温下,考察不同操作压力对酵母细胞破碎提取乙醛脱氢酶影响,结果见 图.。由 图可知,随着压力的增大,破碎液蛋白质含量呈现出增长趋势,说明随着压力 的增大, 细胞破碎率也增大了,更多的细胞内含物释放出来。但当压力超过以后, 一 活力迅速下降,可能由于压力过大,破坏了酶的空间结构【。 一 吕 兮 唧 、, 钿 遐 避 ? 啦 压力 图.压力对乙醛脱氢酶提取影响 .?..四种提取方法比较 选择四种方案的最优工艺参数,对酵母泥进行细胞破碎提取乙醛脱氧酶,结 果 见图。由图可以看出,采用高压匀浆法进行破碎提取,蛋白质含量较高,而且 酶的 活力也明显高于其他提取方法,该法是在现有条件下最理想的提取方法。 ? ? 们 ? 加 加 一螟溢:凹占栅如喀皿避 实验方案 图四种实验方案比较 .. 乙醛脱氢酶提取工艺与活性研究 ..乙醛脱氢酶提取工艺优化 ...单因素试验 料液比对提取的影响 在破碎压力为、提取液为. /、.磷酸盐缓冲液条件下,考察不 同料液比对乙醛脱氢酶提取的影响,试验结果见图.。由图可知,料液比对提 取结果 无显著影响。 仓 棚 缸 餐 皿 嘲 提取液/酵母泥/ 图.料液比对乙醛脱氢酶提取影响 . 对提取的影响 磷酸盐缓冲液条件下, 在破碎压力为、料液比:/、提取液为. 考察不同提取液对乙醛脱氢酶酶活的影响,试验结果见图.。由图可知,当提 取 液的从.增加到.时,乙醛脱氢酶的活性明显升高,在.处达到第一个峰值, 增大至.时,提取活性很快降低,继续增大提取液至.,酶活又随着提取液 的增大而逐渐升高,并在.处达到第二个峰值,此后随的增大酶活又迅速下 降。分析原因可能是乙醛脱氢酶在不同下的稳定性和溶解性