附录干扰素生物学活性测定法
(细胞病变抑制法)
本法系依据干扰素可以保护人羊膜细胞(WISH)免受水泡性口炎病毒(VSV)破坏的作用,用结晶紫对存活的WISH细胞染色,于波长570nm处测定其吸光度,可得到干扰素对WISH细胞的保护效应曲线,以此测定干扰素生物学活性。
试剂(1)MEM或RPMI 1640 培养液取MEM或RPMI 1640 培养基粉末1袋(规格为1L),加水溶解并稀释至1000ml,加青霉素105IU和链霉素105IU,再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀,除菌过滤,4℃保存。
(2)完全培养液量取新生牛血清10ml,加MEM或RPMI 1640培养液90ml。4℃保存。
(3)测定培养液量取新生牛血清7ml,加MEM或RPMI 1640培养液93ml。4℃保存。
(4)攻毒培养液量取新生牛血清3ml,加MEM或RPMI 1640培养液97ml。4℃保存。
(5)消化液取乙二胺四乙酸二钠0.2g、氯化钠8.0g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.152g、磷酸二氢钾0.2g,加水溶解并稀释至1000ml,经121℃15分钟灭菌。
(6)染色液取结晶紫50mg,加无水乙醇20ml溶解后,加水稀释至100ml,即得。
(7)脱色液取无水乙醇50ml、乙酸0.1ml,加水稀释至100ml。
(8)PBS取氯化钠8.0g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g,加水溶解并稀释至1000ml,经121℃15分钟灭菌。
标准品溶液的制备取人干扰素生物学活性测定的国家标准品,按
说明
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书复溶后,用测定培养液稀释至每1ml含1000IU。在96孔细胞培养板中,做4倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2孔。在无菌条件下操作。
供试品溶液的制备将供试品按标示量溶解后,用测定培养液稀释成每1ml约含1000IU。在96孔细胞培养板中,做4倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度做2个孔。在无菌条件下操作。
测定法使WISH细胞在培养基中贴壁生长。按1︰2~1︰4传代,每周2~3次,于完全培养液中生长。取培养的细胞弃去培养液,用PBS洗2次后消化和收集细胞,用完全培养液配制成每1ml 含2.5×105~3.5×105个细胞的细胞悬液,接种于96孔细胞培养板中,每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳条件下培养4~6小时。将配制完成的标准品溶液和供试品溶液移入接种WISH细胞的培养板中,每孔加入100μl。于37℃、5%二氧化碳条件下培养18~24小时。弃去细胞培养板中的上清液。将保存的水泡性口炎病毒(VSV,-70℃保存)用攻毒培养液稀释至约100CCID50,每孔100μl。于37℃、5%二氧化碳培养24小时(镜检标准品溶液的50%病变点在1IU/ml)。然后弃去细胞培养板中的上清液,每孔加入染色液50μl,室温放置30分钟后,用流水小心冲去染色液,并吸干残留水分,每孔加入脱色液100μl,室温放置3~5分钟。混匀后,用酶标仪以630nm为参比波长,在波长570nm 处测定吸光度,记录测定结果。
试验数据采用计算机程序或四参数回归计算法进行处理。并按下式计算试验结果
供试品生物学活性(IU/ml)=Pr×Ds×Es
Dr×Er
式中Pr为标准品生物学活性,IU/ml;
Ds为供试品预稀释倍数;
Dr为标准品预稀释倍数;
Es为供试品相当于标准品半效量的稀释倍数;
Er为标准品半效稀释倍数。
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