0000实验教学教案首页本次实验项目：氨基酸纸层析本次实验课时：4学时实验类型：验证性教学要求：通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法掌握氨基酸纸上层析法的操作技术（点样、平衡、展层、显色、鉴定）原理,能够对实验结果做出正确判断重点：：氨基酸纸上层析法的操作技术难点：纸层析法的基本原理教学手段及教具：课堂讲授，学生实验操作。讲授内容及时间分配：课堂讲授课堂讲授实验目的0.2学时实验原理0.3学时仪器、材料和试剂0.2学时操作步骤及注意事项0.3学时实验教学氨基酸纸层析的操作4学时参考资料《生物化学实验》指导
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氨基酸纸层析法（验证性）相关知识层析法（色谱法）：是一种物理的分离方法。它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达分离。2•几种常用的层析法①吸附层析②离子交换层析③薄层层析④凝胶层析（凝胶过滤）⑤亲和层析⑥分配层析（适于在水，有机溶剂中都可溶的混合物）当把一种物质在两种不混溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀的分配。达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数，即分配系数。物质在溶剂I中的浓度a=—物质在溶剂II中的浓度如果某一混全物的各组分在这两相中的分配系数有足够的差异，它们就可以被分离。3•氨基酸的极性大小及各氨基酸结构一、实验目的•通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法•掌握氨基酸纸上层析法的操作技术（点样、平衡、展层、显色、鉴定）二、实验原理纸层析法是分配层析的一种，以滤纸作为惰性支持物。层析溶剂（扩展剂）由有机溶剂和水组成。在纸上水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相移动而进入无溶质的区域，这时又重新进行分配，一部分溶质从有机相进入水相。当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断进行分配。溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的。原点到层析点中心的距离R=原点到溶剂前沿的距离在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、pH层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。氨基酸、糖、核甘酸、甾体激素、维生素、抗生素等很多物质都能用纸上层析法分离。上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。三、仪器、材料和试剂仪器：每组学生准备尺子、小剪子或小刀•层析缸、培养皿、量筒、小烧杯、长颈漏斗、毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱、层析滤纸、手套、透明胶带。实验材料和试剂1.标准氨基酸溶液分别配制0.5%的Lys、Ala、Ile、Met溶液•待分离测定的混合氨基酸溶液.显色剂0.1%水合茚三酮丙酮溶液。4.扩展剂（展层剂）：本实验使用酸溶剂系统酸溶剂系统：正丁醇：80%甲酸:水=15:3:2（体积比），平衡溶剂与扩展剂相同。四、操作步骤•层析缸：三个组共用一个。层析缸中放入三个培养皿（注意垫平）。•配制酸溶液系统：每组用量筒用配制30ml入小烧杯，再放入层析缸中，作为平衡溶剂，密闭。问题：平衡溶剂的作用是？3•戴手套取层析滤纸一张。在纸的一端（纵纹）距边缘1.5~2cm处用铅笔划一条直线，而后进行分隔（5个点）。问题：为什么戴手套取层析滤纸？4•
练习
飞向蓝天的恐龙练习非连续性文本练习把字句和被字句的转换练习呼风唤雨的世纪练习呼风唤雨的世纪课后练习
点样：用毛细管吸水在滤纸条上练习。达到均匀透过滤纸，大小不超过3mm的点样迹。5•正式点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这5个位置上，干后再点一次。注意：两次点样一定不要将不同的样品点在一个点上。小组成员认真仔细合作。不要用手触摸到滤纸。6•点样面朝外，纸的两边不能接触。用胶带小条（1~2mm宽）将滤纸粘成筒状。7•将筒状滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下），盖上层析缸盖，平衡约.10分钟。&将长颈漏斗置于筒状滤纸中并与培养皿底部接触，将约25mL左右扩展剂（即平衡溶剂）沿长颈漏斗倾于培养皿，扩展剂的液面需低于点样线1cm。密闭。问题：为什么加入的展层剂的液面需低于点样线？9•展层：当溶剂展层至距离纸的上沿约1厘米时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。10.显色：将已层析的滤纸用摄子夹住边，在0.1%茚三酮丙酮溶液中双而均匀浸透后拿出，然后置烘箱（65C）烘烤5分钟。问题：除哪几种氨基酸和茚三酮反应产生黄色物质？其它a-氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。其原理是？五、实验结果与
分析
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讨论1•计算各种氨基酸的Rf并排出迁移率顺序。确定混合液中氨基酸成分。从氨基酸结构解释待测的几种氨基酸Rf大小不同的原因4•分析讨论异常状况。六、注意事项思考题1分配层析法指的分配系数的含义2・层析缸中平衡溶剂的作用是什么影响Rf值的因素有哪些？哪几种氨基酸遇茚三酮反应产生黄色物质？
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