蛋白表达步骤

1。培养基得配制原理步骤LB培养基,就是微生物学实验中最常用得培养基,用于培养大肠杆菌等细菌,其分为液态或就是加入琼脂制成得固态培养基•加入抗生素得LB培养基可用于筛选以大肠杆菌为宿主得克隆.尽管该培养基得名称被广泛解释为Luria-Bertani培养基，然而根据其发明人贝尔塔尼(GiuseppeBertani)得说法，这个名字来源于英语得lysogenybroth，即溶菌肉汤。LB培养基得配制:成分胰蛋白胨(tryptone)0g酵母提取物(yeastextract)g氯化钠(NaCl)10g固体培养基另加琼脂粉15—2Og加双蒸水至1000mL,用5mol/LNaOH(约0、2m1)调pH至7、2,121C灭菌30min配制 方法 快递客服问题件处理详细方法山木方法pdf计算方法pdf华与华方法下载八字理论方法下载 称量分别称取所需量得胰化蛋白胨、酵母提取物与NaC1,置于烧杯中。溶化加入所需水量2/3得蒸馏水于烧杯中,用玻棒搅拌,使药品全部溶化。调pH用1mol/LNaOH溶液调pH至7、2。(4)定容将溶液倒入量筒中,加水至所需体积。加琼脂加入所需量琼脂,加热融化,补足失水。分装、加塞、包扎．高压蒸汽灭菌100Pa灭菌20min。2、大肠杆菌菌种活化原理菌种得活化就就是将处于保藏状态得菌种放入合适得培养基中进行培养,逐级增大培养就是为了得到纯而壮得培养物，可以理解为就就是为了获得活力旺盛得、接种数量足够得培养物进行培养．菌种发酵一般情况下需要2—3代得复壮过程,因为保存时得条件往往与培养时得条件不相同,所以要活化，让菌种逐渐适应培养环境中药 标准 excel标准偏差excel标准偏差函数exl标准差函数国标检验抽样标准表免费下载红头文件格式标准下载 对照品研究中心建议实验要明白菌种活化得情况就首选需要了解菌种保藏得方式与方法。目前国际与国内常用得菌种保存方法包括：定期移植法、液体石蜡法、沙土管法、真空冷冻干燥法、80C冰箱冻结法、液氮超低温冻结法。对于不同得保存方式活化得方式也不同:定期移植法得菌种复苏较简单，直接转接即可;液体石蜡法保存得菌种在复苏时，挑取少量菌体转接在适宜得新鲜培养基上,生长繁殖后,再重新转接一次;沙土管法保存菌种在复苏时，在无菌条件下打开沙土管,取部分沙土粒于适宜得斜面培养基上,长出菌落后再转接一次。或取沙土粒于适宜得液体培养基中,增殖培养后再转接斜面;真空冷冻干燥法保存菌种在复苏时先用70％酒精棉花擦拭安瓿上部,将安瓿管顶部烧热，用无菌棉签沾冷水,在顶部擦一圈，顶部出现裂纹，用挫刀或镊子颈部轻叩一下,敲下已开裂得安瓿管得顶端,用无菌水或培养液溶解菌块使用无菌吸管移入新鲜培养基上，进行适温培养;—80°C冰箱冻结法保存菌种复苏时，从冰箱中取出安瓿管或塑料冻存管，应立即放置38C—40C水浴中快速复苏并适当快速摇动。直到内部结冰全部溶解为止，约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管，将内容物移至适宜得培养基上进行培养液氮超低温冻结法保存菌种复苏与—80C冰箱冻结法保存菌种复苏相似，从液氮罐中取出安瓿管或塑料冻存管,应立即放置在38C—40C水浴中快速复苏并适当摇动。直到内部结冰全部溶解为止,一般约需50秒-100秒。开启安瓿管或塑料冻存管,将内容物移至适宜得培养基上进行培养。步骤总结一下菌种活化需要以下几个步骤:第一配置菌种适宜生长得培养基第二将菌种从保藏状态恢复到室温状态，比如将冷冻得菌种解冻第三将通过操作将保藏得菌种接种到培养基中培养,此步骤称为菌种复壮第四步挑选培养基茁壮得菌落,挑选其中部分菌落接种到新得培养基中培养，重复此步骤2－3次,从而得到生长良好得菌落经过这四个步骤就到达将菌种从保藏状态活化得最终目得、举例大肠杆菌菌种活化方法：配活化培养基（LB）:活化大肠杆菌配方：0、5g酵母粉,1g蛋白胨，1g氯化钠，稀释到100ml复苏细胞（去掉DMSO及冷冻过程中产生得有毒物质）材料:液氮中得细胞共1毫升:含20%血清（FBS）,10%DMSO（防止细胞内产生冰晶）,培养基步骤:一、从液氮（约—190度）中取出细胞（管中有1ml细胞）（稍微抖掉液体）二、快速放入37度水浴1分钟.三、加入1mlDMEM培养基融化冰晶。四、全部移入离心管中，管口封口膜封口；五、离心：1200r/min,5min.六、去上清（用大枪（1—5ml）一次吸出，吸时沉淀朝上）;G2细胞沉淀较明显七、先（用1m1小枪）加到离心管中1ml培养基并吹打吸出到培养瓶中，再加1ml培养基润洗离心管吸出到培养瓶中，然后用大枪加3ml培养基到培养瓶中（补足5毫升）;八、培养瓶放入37度温箱。3、质粒得提取、导论已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA,这些方法都含有以下3个步骤:细菌培养物得生长。细菌得收获与裂解质粒DNA得纯化。（一）细菌培养物得生长从琼脂平板上挑取一个单菌落,接种到培养物中（有含有行当抗生素得液体培养基中生长），然后从中纯化质粒，质粒得提纯几乎总就是如此。现在使用得许多质粒载体（如pUC系列）都能复制到很高得拷贝数，惟致只要将培养物放在标准LB培养基中生长到对数晚期，就可以大量提纯质粒。此时，不必造反性地扩增质粒DNA.然而，较长一代得载体（如pBR322）由于不能如此自由地复制，所以需要在得到部分生长得细菌培养物中加入氯霉素继续培养若干小时,以便对质粒进行性扩增．氯霉素可抑制宿主得蛋白质合成,结果阻止了细菌染色体得复制,然而,松弛型质粒仍可继续复制,在若干小时内,其拷贝数持续递增。这样,像pBR322-类得质粒,从经氯霉素处理与未经处理得培养物中提取质粒得产量迥然不同,前者大为增高•多年来，加入足以完全抑制蛋白质合成得氯霉素卩g/ml）已成为标准得操作、用该方法提取得质粒DNA量，对于分子克隆中几乎所有想象到得工作任务．（二）细菌得收获与裂解细菌得收获可通过离心来进行,而细菌得裂解则可以采用多种方法中得任意一种，这些方法包括用非离子型或离子型去污剂、有机溶剂或碱进行处理及用加热处理等．选择哪一种方法取决于3个因素:质粒得大小、小肠杆菌菌株及裂解后用于纯化质粒DNA得技术。尽管针对质粒与宿主得每一种组合分别提出精确得裂解条件不切实际,但仍可据下述一般准则来选择适当方法，以取得满意得结果。1）大质粒（大于15kb）容易受损，故应采用漫与裂解法从细胞中释放出来。将细菌悬于蔗糖等渗溶液中，然后用溶菌酶与EDTA进生处理,破坏细胞壁与细胞外膜，再加入SDS一类去污剂溶解球形体。这种方法最大限度地减小了从具有正压得细菌内部把质粒释放出来所需要得作用力．2）加200卩l新配制得溶液U.溶液U0、2mol/LNaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1%SDS盖紧管口,快速颠倒离心管5次,以混合内容物。应确保离心管得整个内 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 面均与溶液U接触•不要振荡，将离心管放置于冰上。3）加150^1用冰预冷得溶液川溶液川5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11、5ml水28、5ml所配成得溶液对钾就是3mol/L,对乙酸根就是5mol/L。盖紧管口，将管倒置后与地振荡10秒钟溶液川在粘稠得细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3-5分钟。4）用微量离心机于4C12000g离心5分种，将上清转移到另一离心管中。5）可做可不做：加等量酚：氯念，振荡混匀，用微量离心机于4C以12000g离心2分钟,将上清转移到另一良心管中。有些工作者认为不必用酚：氯仿进行抽提，然而由于一些未知得原因，省略这一步，往往会得到可耐受限制酶切反应得DNAo6）用2倍休积得乙醇于室温沉淀双锭DNA。振荡混合，于室温放置2分钟。7）用微量离心机于4C以12000g离心5分钟.8）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁得液滴除尽．除去上清得简便方法就是用一次性使用得吸头与真空管道相连，并用吸头接触液面.当液体从管中吸出时,尽量使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁得液滴。9）用1m170%乙醇于4C洗涤双链DNA沉淀，按步骤8）所术方法去掉上清,在空气中使核酸沉淀干燥10分钟。1、此法制备得高拷贝数质粒（如Xf3或pUC），其产量一般约为：每毫升原细菌培养物3—5卩goi1、如果要通过限制酶切割反应来分析DNA，可取1卩1DNA溶液加到另一含8卩l水得微量离心管内，加1卩l1OX限制酶缓冲液与1单位所需限制酶，在适宜温育1—2小时.将剩余得DNA贮存于一20C。iii、此方法按适当比例放大可适用于100m1细菌培养物：3、煮沸裂解1）将细菌沉淀，所得重悬于350卩lSTET中.STET0、1mol/LNaCL0mmol/LTris、Cl（pH8、0）1mmol/LEDTA（pH&0）5％TritonX一100）加25卩l新配制得溶菌酶溶液［10mg/m1，用10mmol/LTris、CI（pH8、0）配制］,振荡3秒钟以混匀之。如果溶淮中pH低于8、0，溶菌酶就不能有效发挥作用。）将离心管放入煮沸得水浴中，时间恰为40秒。4）用微量离心机于室温以12000g离心10分种.5）用无菌牙签从微量离心管中去除细菌碎片.）在上清中加入40卩15mo1/L乙酸钠（pH5、2）与420卩l异丙醇，振荡混匀，于室温放置5分钟。7）用微量离心机于4C以12000g离心5分种，回收核酸沉淀。8）小心吸去上清液,将离心管倒置于一张纸巾上，以使所有液体流出。再将附于管壁得液滴除尽。除去上清得简便方法就是用一次性使用得吸头与真空管道相连轻缓抽吸，并用吸头接触液面.当液体从管中吸出时,尽可能使吸头远离核酸沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管得液滴。9）加1ml70%乙醇,于4C以12000g离心2分钟。2）可用更剧烈得方法来分离小质粒。在加入EDTA后，有时还在加入溶菌酶后让细菌暴露于去污剂，通过煮沸或碱处理使之裂解。这些处理可破坏碱基配对，故可使宿主得线状染色体DNA变性，但闭环质粒DNA链由于处于拓扑缠绕状态而不能彼此分开.当条件恢复正常时，质粒DNA链迅速得到准确配置，重新形成完全天然得超螺旋分子。3）—些大肠杆菌菌株（如HB101得一些变种衍生株）用去污剂或加热裂解时可释放相对大量得糖类,当随后用氯化铯－溴化乙锭梯度平衡离心进行质粒纯化时它们会惹出麻烦。糖类会在梯度中紧靠超螺旋质粒DNA所占位置形成一致密得、模糊得区带。因此很难避免质粒DNA内污染有糖类,而糖类可抑制多种限制酶得活性.故从诸如HB101与TG1等大肠杆菌蓖株中大量制备质粒时,不宜使用煮沸法。4）当从表达内切核酸酶A得大肠杆菌菌株（endA+株如HB101）中小量制备质粒时，建议不使用煮沸法。因为煮沸不能完全灭活内切核酸酶A,以后在温育（如用限制酶消化）时，质粒DNA会被降解。但如果通过一个附加步骤（用酚:氯仿进行抽提）可以避免此问题。5）目前这一代质粒得拷贝数都非常高,以致于不需要用氯霉素进行选择性扩增就可获得高产。然而，某些工作者沿用氯霉素并不就是要增加质粒DNA得产量,而就是要降低细菌细胞在用于大量制备得溶液中所占体积。大量高度粘稠得浓缩细菌裂解物,处理起来煞为费事,而在对数中期在增减物中加入氯霉素可以避免这种现象。有氯霉素存在时从较少量细胞获得得质粒DNA得量以与不加氯霉素时从较大量细胞所得到得质粒DNA得量大致相等。（三）质粒DNA得纯化常使用得所有纯化方法都利用了质粒DNA相对较小及共价闭合环状这样两个性质.例如,用氯化铯—溴化乙锭梯度平衡离心分离质粒与染色体DNA就取决于溴化乙锭与线状以及与闭环DNA分子得结合量有所不同．溴化乙锭通过嵌入奋不顾身碱基之间而与DNA结合，进而使双螺旋解旋。由此导致线状DNA得长度有所增加,作为补偿,将在闭环质粒DNA中引入超螺旋单位。最后，超螺旋度大为增加,从而阻止了溴化乙锭分了得继续嵌入。但线状分子不受此限，可继续结合更多得染料,直至达到饱与（每2个碱基对大约结合1个溴化乙锭分子）。由于染料得结合量有所差别，线状与闭环DNA分了在含有饱与量溴化乙锭得氯化铯度中得浮力密度也有所不同.多年来，氯化铯-溴化乙锭梯度平衡离心已成为制备大量质粒DNA得首选方法。然而该过程既昂贵又费时，为此发展了许多替代方法。其中主要包括利用离子交换层析、凝胶过滤层析、分级沉淀等分离质粒DNA与宿主DNA得方法。本实验室采用离子交换层析法已可得到极高纯度得质粒。二、质粒DNA得小量制备细菌得收获与裂解收获碱裂解法煮沸裂解质粒DNA小量制备得问题与对策质粒DNA得小量制备可采用下述得碱裂解法或煮沸法（一）细菌得收获与裂解1、收获1）将2m1含相应抗生素得LB加入到容量为15ml并通气良好（不盖紧）得试管中，然后接入一单菌落，于30°C剧烈振摇下培养过夜。2）将1、5ml培养物倒入微量离心管中，用微量离心机于4C以12000g离心30秒,将剩余得培养物贮存于4C。3）吸去培养液,使细菌沉淀尽可能干燥。除去上清得简便方法就是用一次性使用得吸头与真空管道相连，轻缓抽吸，并用吸头接触液面.当液体从管中吸出时，尽可能使吸头远离细菌沉淀，然后继续用吸头通过抽真空除去附于管壁得液滴。2、碱裂解法I）将细菌沉淀，所得重悬于100卩1用冰预冷得溶液I中，剧烈振荡。溶液I50mmo1/L葡萄糖25mmol/LTris、Cl（pH8、0）10mmol/LEDTA（pH8、0）溶液I可成批配制，每瓶约100m1，在10Ibf/in2（6895X104Pa）高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4C。须确使细菌沉淀在溶液I中完全分散，将两个微量离心管得管底部互相接触震荡,可使沉淀迅速分散。10）按步骤8）所述再次轻轻地吸去上清,这一步操作要格外小心,因为有时沉淀块贴壁不紧，去除管壁上形成得所有乙醇液滴，打开管口,放于室温直至乙醇挥发殆尽,管内无可见得液体（2-5）分钟。II）用50卩l含无DNA酶得胰RNA酶（20卩g/mI）得TE（pH8、0）溶解核酸稍加振荡,贮存于—20C。注:当从表达内切核酸酶A得大肠杆菌株（endA+株，如HB101）中小量制粒尤其DNA时，建议舍弃煮沸法。因为煮沸步骤不能完全灭活内切核酸酶A,以后在Mg2+存在下温育（V中用限制酶时）质粒DNA可被降解。在上述方案得步骤9）之间增加一步，即用酚：氯仿进行抽提,可以避免这一问题。（二）质粒DNA小量制备得问题与对策裂解与煮佛法都极其可靠，重复性也很好,而且一般没有会么麻烦。多年来,在我们实验室中日常使用这两种方法得过程中,只碰到过两个问题：1）有些工作者首次进行小量制备时，有时会发现质粒DNA不能被限制酶所切割，这几乎总就是由于从细菌沉淀或从核酸沉淀中去除所有上清液时注意得不够。大多数情况下，用酚:氯仿对溶液进行抽提可以去除小量备物中得杂质。如果总就是依然存在，可用离心柱层析注纯化DNA。2）在十分偶然得情况下，个别小时制备物会出现无质粒DNA得现象。这几乎肯定就是由于核酸沉淀颗粒已同乙醇一起被弃去。三、质粒DNA得大量制备在丰富培养基中扩增质粒细菌得收获与裂解收获碱裂解法（一）在丰富培养基中扩增质粒许多年来，一直认为在氯霉素存在下扩增质粒只对生长在基本培养基上得细菌有效，然而在带有pMBI或ColEI复制子得高拷贝数质粒得大肠杆菌菌株中，采用以下步骤可提高产量至每500m1培养物2-5mg质粒DNA,而且重复性也很好。1）将30ml含有目得质粒得细菌培养物培养到对数晚期（DNA600约0、6）.培养基中应含有相应抗生素，用单菌落或从单菌落中生长起来得小量液体闭关物进行接种。2）将含相应抗生素得500mlLB或Terrific肉汤培养基（预加温至37C）施放入25ml对数晚期得培养物，于37E剧烈振摇培养25小时（摇床转速300转/分）,所得培养物得OD600值约为0、4。3）可做可不做：加2、5ml氯霉素溶液（34mg/ml溶于乙醇），使终浓度为170卩g/ml。像pBR322—类在宿主菌内只以中等拷贝娄竿行复得质粒，有必要通过扩增。这些质粒只要从生长达到饷新一代得质粒（如pUC质粒）可复制达到很高得拷贝数,因此无需扩增。这些质粒只要从生长达到饱与得细菌培养物即可大量提纯。但用氯霉素进行处理,具有抑制细菌复制得优点，可减少细菌裂解物得体积与粘稠度,极大地简化质粒纯化得过程。所以一般说来，尽管要在生长中得细菌培养物里加入氯霉素略显不便，但用氯霉素处理还就是利大于弊。）于37C剧烈振摇（300转/分），继续培养12-16小时。（二）细菌得收获与裂解1、收获1）用合适转头于4C以4000转/分离心15分钟,弃上清,敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。2）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷得STE中。STE0、1mol/LNaCl10mmol/LTris、Cl（pH80）1mmo1/LEDTA（pH8、0）2）按步骤1）所述方法离心,以收集细菌细胞。2，碱裂解法1）将冼过得500ml培养物得细菌沉淀物[来自收获细菌得步骤3]重悬于10ml（18ml）溶液I中。溶液I50mmo1/L葡萄糖25mmol/LTris、C1（pH8、0）10mmo1/LEDTA（pH8、0）溶液I可成批配制，在101bf/in2（6、895x104Pa）高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于4To2）加1ml（2ml）新配制得溶菌酶溶液［1Omg/m1,溶于10mmol/LTris、Cl（pH8、0）］。当溶液得pH值低于8、0时，溶菌酶不能有效工作。3）加20ml（40ml）新配制得溶液U。溶液U0、2mol/LNaOH（临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1%SDS盖紧瓶盖,缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物•于室温放置5—10分钟。4）加15nl（20ml）用冰预冷得溶液川.溶液川5mol/L乙酸钾60ml冰乙酸11、5ml水28、5ml所配成得溶液对钾就是3mol/L,对乙酸根就是5mol/L.封住瓶口,摇动离心瓶数次以混匀内容物,此时应不再出现分明得两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀.于0C放置后所形成得沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA与钾—SDS-蛋白质-膜复合物。5）用合适转头于4C以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后尽可能将上清全部转到另一瓶中,弃去残留在离心管内得粘稠状液体。未能形成致密沉淀块得原因通常就是由于溶液川与细菌裂解物混合不充分［步骤4）］o6）上清过滤至一250ml离心瓶中，加0、6体积得异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟。7）用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸.如于4C离心，盐也会了生沉淀。8）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70%乙醇洗涤沉积管壁.倒出乙醇,用与真空装置相联得巴期德吸出附于瓶壁得所有液滴,于室温将瓶倒置放在纸巾上,使最后残余得痕量乙醇挥殆尽。9）用3mlTE（pH8、0）溶解核酸沉淀.10）纯化。四、质粒DNA得纯化聚乙二醇沉淀法质粒DNA氯化铯一溴化乙锭梯度平衡离心法纯化闭环DNA（一）聚乙二醇沉淀法提取质粒DNA1）将核酸溶液所得］转入15mlCorex管中，再加3ml用冰预冷得5mol/LLiCl溶液，充分混匀，用合适转头于4C下以10000转/分离心10分钟。LiC1可沉淀高分子RNAo2）将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量得异丙醇，充分混匀，用Sorval1SS34转头（或与其相当得转尖）于室温以10000转/分离心10分钏，回收沉淀得核酸。3）小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留得液滴流尽。于室温用70%乙醇洗涤沉淀及管壁,流尽乙醇,用与真空装置相连得巴其德吸管吸去附于管壁得所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟,以使最后残余得痕量乙醇蒸发殆尽。4）用500卩l含无DNA酶得胰RNA酶（20卩g/ml）得TE（pH8、0）溶解沉淀,将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。5）加500卩I含13%（w/v）聚乙二醇（PEG8000）得1、6mol/LNaCl,充分混合，用微量离心机于4°C以12000g离心5分钟，以回收质粒DNA。6）吸出上清，用400^1TE（pH8、0）溶解质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽1次.）将水相转到另一微量离心管中，加100卩l10mol/L乙醇铵，充分混匀加2倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，于4C以12000g离心5分钟,以回收沉淀得质粒DNAo8）吸去上清，加200^1处于4C以12000g离心2分钟。9）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见得痕量乙醇蒸发殆尽。10）用500卩lTE（pH8、0）溶解沉淀1:100稀释［用TE（pH8>0）］后测量OD260,计算质粒DNA得浓度（1OD260=50卩g质粒DNA/ml），然后将DNA贮于-20CoIPTG诱导原理IPTG诱导蛋白表达得原理及方法步骤E、coli得乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶与乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因IoI基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合,使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态.在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列与CAP结合位点共同构成lac操纵子得调控区，三个酶得编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物得协调表达。在没有乳糖存在时,lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达得Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子（元）即可被诱导.在这个操纵子（元）体系中，真正得诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b-半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录.异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）就是一种作用极强得诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。材料1、诱导表达材料（1）LB（Luria—Bertani））培养基酵母膏（Yeastextract）5g蛋白胨（Peptone）10gNaCl10g琼脂（Agar）1-2%蒸馏水（Distilledwater）1000mlpH7、0适用范围：大肠杆菌（2）IPTG贮备液：2gIPTG溶于10mL蒸馏水中,0、22^m滤膜过滤除菌，分装成1mL/份,-20C保存。（3）lX凝胶电泳加样缓冲液：50mmol/LTris—CI（pH6、8）50mmol/LDTT2%SDS(电泳级)0、1％溴酚蓝10%甘油2、大肠杆菌包涵体得分离与蛋白纯化材料1)酶溶法(1)裂解缓冲液:0mmo1/LTris-CI(pH8、0)mmol/LEDTA100mmol/LNaCI⑵50mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)。10mg／mL溶菌酶。脱氧胆酸。1mg/mLDNaseI。)超声破碎法(1)TE缓冲液。(2)2XSDS—PAGE凝胶电泳加样缓冲液：00mmol/LTris-HCI(pH8、0)100mmol/LDTT%SDS0、2%溴酚蓝0%甘油实验方案1、外源基因得诱导表达用适当得限制性内切核酸酶消化载体DNA与目得基因；按连接步骤连接目得基因与载体，并转化到转化DH5a感受态细胞中；分别挑取单菌落接种于5mLLB(0、1g•L-1氨苄青霉素)中，37C培养过夜;以2%体积比转接于2mlLB(0、1g•L—l氨苄青霉素)中，37C继续培养2、5hr，至细菌对数生长期,加0、1mmol/LIPTG2pl诱导3-4hr,同时设立不加IPTG诱导作为对照；)取上述菌液1mL,12000rpm离心10min,收菌沉淀；重悬于冰得100hPBS中，加入PMSF至终浓度为10mmol/L.震荡器震荡混匀，加入2X加样缓冲液，煮沸10min变性,12,000rpm离心10min;)分别取诱导前与诱导后得样品10pl进行SDS-PAGE电泳分析。(PS:如果表达载体得原核启动子为PL启动子，则在30—32C培养数小时，使培养液得OD600达0、4-0、6,迅速使温度升至42C继续培养3—5h;如果表达载体得原核启动子为tac等，则37C培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG至终浓度为1mmol/L,继续培养3—5h)。2、大肠杆菌包涵体得分离与蛋白质纯化1)细菌得裂解常用方法有：①高温珠磨法；②高压匀浆；③超声破碎法：④酶溶法;⑤化学渗透等。前三种方法属机械破碎法，并且方法①、②已在工业生产中得到应用，后三种方法在实验室研究中应用较为广泛.下面介绍酶溶法与超声破碎法得实验步骤。(1)酶溶法。常用得溶解酶有溶菌酶冷-1,3—葡聚糖酶；B—1,6—葡聚糖酶；蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用,而其她几种酶对酵母作用显著.主要步骤为: