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第五章 各种标本直接涂片、染色与显微镜检验 第5章​ 各种标本直接涂片、染色与显微镜检验 细菌是单细胞微生物，因体积微小，须在显微镜下才能观察其形态、大小与结构。菌液标本可直接涂布于玻片上；菌落涂片时，先取生理盐水1滴，置玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。涂片时必须轻轻操作，剧烈的动作会改变细菌原有的排列方式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果判断的准确性。制备的涂片应自然干燥，并经火加热固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细菌形态改变。将固定后的片进行染色。 形态学检查有助于初步识别细菌和选择进一步鉴定细菌的生化试验。有时通过形态学检查可获得初步诊断。 第1节​  第一节 不染色标本检查 不染色标本的检查常用以观察活菌状态、细菌的动力或运动状况。 一、湿片法 用接种环取细菌-生理盐水悬液或细菌培养液2环，置于载玻片中央，轻轻覆以盖玻片。菌液要适量，不可外溢，不可有气泡。 二、悬滴法 加1小滴菌悬液在盖玻片中央，在另一凹玻片凹窝的周围涂少量凡士林，将凹面向下，对准盖玻片中央，盖在凹玻片上。迅速翻转玻片，用小镊子轻压，使盖玻片与凹玻片粘紧，密封凹窝边缘。 三、毛细管法 本法适用于观察厌氧菌动力。先将待检菌接种在适宜的液体培养基中。经厌氧过夜培养后，以毛细管（长60~70mm，管径0.5~1.0mm）接触培养物，使菌液进入毛细管中，用火焰封闭毛细管两端，将毛细管固定在载玻片上，镜检。 镜下观察 先用低倍镜，调成暗光，对准焦距后以高倍镜观察。细菌如有动力，可见细菌从一处移到另一处，无动力的细菌呈分子布朗运动而无位置的改变。 第2节​  第二节 染色标本检查 一、基本方法 细菌胞浆无色透明，不易识别。可用染料使细菌着色，观察形态和特殊结构，按染色特性进行分类。 （一）原理 1．物理吸附 根据毛细管现象和渗透作用，可使染料进入细胞内被溶解吸收。此外，细菌等电点较低，pH值2~5，在一般情况下细菌带负电荷，易和带正电荷的碱性染料相结合。 2．化学反应 菌体内某些物质与染料相结合，发生化学反应使细菌着色，而且不易被脱色剂所洗脱。 3．其他因素 细胞膜的通透性、膜孔的大小、细胞结构完整与否以及培养基成分，染色液中电介质含量、pH值、菌龄等都是影响细菌着色的因素。 （二）操作 1．涂片 临床标本大多可直接涂抹在洁净的载玻片上。若是细菌的液体培养物，可直接加一小滴在载玻片上，稍加涂布。若是从固体培养基上取细菌菌落，用接种环取一环生理盐水置玻片，取少许菌在盐水中轻轻磨匀，再涂布扩大至直径20mm大小的圆形涂膜，待自然或加微热使其干燥。 2．固定 涂片干燥后，在火焰上迅速通过3次加以固定。固定过程可杀死细菌，凝固细胞质和其他细胞结构，增加细菌细胞对染液的通透性，并可使细菌涂膜牢固，不被在染色过程中的流水冲洗脱落。 3．染色 有单染法和复染法。一般用低浓度染色液(1%以下)覆盖涂膜，为促使染料与菌体结合，可在染液中加入酚、明矾等，在染色过程中加碘液、媒染或加热促进着色。 4．脱色 常用乙醇、丙酮或酸类作为脱色剂，掌握脱色时间以获良好效果。 5．复染 可使已脱色的细菌重新着色。 二、常用染色法（染液配方见第9章） （一）革兰染色 1．涂片经火焰固定，加结晶紫液染1min，清水冲去染液。 2．加碘液染 1min，水洗。 3．加脱色液，轻轻摇动约30s，至无紫色洗落为止，水洗。 4．加复染液，约30s，水洗。 5．干后镜检。革兰阳性菌染成紫色，革兰阴性菌染成红色。 （二）抗酸染色 1.萋-尼 (Ziehl-Neelse)抗酸染色法 （1）涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸气出现，切不可沸腾。染5min（奴卡菌需要加长时间），水洗。 （2）加脱色剂，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗。 （3）加复染液，染1min，水洗。 （4）干后镜检，抗酸杆菌呈红色，非抗酸杆菌为蓝色。 2．金胺O-罗丹明B染色法 (1)涂片固定后加第1液30~90s。 (2)弃去第1液后加第2液染15min。 (3)用第3液脱色1~2min，水洗。 (4)滴加第4液染30s，水洗，待干，荧光镜检。 痰标本直接涂片时，应增加涂片厚度，以提高检出率，染涂片时，须掌握复染时间。奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性。 （三）鞭毛染色（改良Ryu法） 1.玻片的处理 将新载玻片浸泡在95%酒精中。临用时取出，以干净纱布擦干。 2.在玻片上滴蒸馏水1滴。 3.挑取培养物少许，轻触蒸馏水滴顶部，仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。 4．置35℃孵箱自然干燥，不能用火焰固定，滴加染液1~2 min轻轻水洗干后镜检，鞭毛和菌体呈紫色。 （四）异染颗粒染色(阿尔培托法) 1.涂片经火焰固定，加甲液染色3~5min。水洗。 2.滴加乙液，染1min。水洗。 3.干后镜检，菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色,用于白喉棒状杆菌染色。 （五）墨汁染色 是一种负染法，通常选用印度墨汁，亦可用优质绘图墨汁或墨水代替。 染色时标本涂片处滴加染液混合后加上盖玻片，轻压，使标本混合液变薄。在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞，转高倍镜确认，如新型隐球菌可见宽厚透亮的荚膜，背景为黑色。 (许志良写 刘建栋审) 第六章 标本的采集、运送及处理原则 第一节 标本采集、运送与处理原则 临床标本的正确采集、运送及细菌培养、鉴定，有助于作出快速、准确的病原学诊断与监测，了解微生物与疾病的关系。对于疾病的临床诊疗、预后观察以及流行病学调查具有十分重要的意义。为了准确鉴别病原菌，避免漏检及误诊，应掌握以下原则： 一、临床标本的采集和运送原则 1．送检申请单应注明被检人的姓名、性别、年龄、足够的临床资料、标本来源、检验目的及抗菌药物使用情况等，使实验室能正确选用相应的培养基和适宜的培养环境。 2. 避免漏检，确保临床病原体的检出， 尽量在抗菌药物使用前采集标本。 3. 标本采集时应严格执行无菌操作，减少或避免机体正常菌群及其他杂菌污染。 4. 标本采集后应立即送至微生物实验室，床边接种可提高病原菌检出率。 5. 以棉拭子采集的标本，如咽拭、肛拭或伤口拭子，可插入运送培养基送检，以吸水性好、不易干燥的材料取样。 6. 混有正常菌群污染的标本，如咳痰、尿液、伤口拭子，不可置肉汤培养基内送检。 7. 盛标本容器须经灭菌处理，但不得使用消毒剂。 8. 向病人详细介绍标本留取的正确方法和注意事项。 二、临床标本处理原则 （一）标本接种与培养 1．实验室收到标本后，应立即根据标本类型、病人的临床资料及检验目的选择合适的培养基接种。如尿标本可接种于血平板和麦康凯平板；痰标本可接种于血平板、麦康凯、巧克力平板和沙保罗平板。 2．混有正常菌群污染的标本，如尿液，应做定量细菌培养。不能精确定量或常规定量操作较困难的痰、伤口、拭子等标本，分离出致病菌及条件致病菌细菌为优势菌时，应作细菌鉴定结果及药敏报告，同时注明细菌量化指标。 3．对已用抗菌药物病人的标本，可在培养基中加入某些物质以中和药物对细菌的抑制作用。 三、常用微生物学检验鉴定思路 常见微生物鉴定思路，见图6-6-1 革兰染色 + - 球菌 球菌 + - + - 触酶 动力 DNA酶 发酵（O/F） + - + - + - + - 微 链 李 棒 卡 奈 氧化酶 非 球 球 斯 状 他 瑟 + - 发 菌 菌 特 杆 莫 菌 弧 肠 酵 科 科 菌 菌 拉 菌 杆 菌 属 （等） 菌 科 菌 群 （O/F:F） 科 （O/F:O/-） 氧化酶+ 注：1.革兰染色将细菌分成革兰阳性菌和革兰阴性菌二大类。 2根据细菌的生物学特性(形态、动力、DNA酶、触酶试验、氧化酶及氧化发酵试验等)初步分类鉴定。 图6-6-1 临床常见细菌学检验鉴定思路 第二节 血液及骨髓标本的采集与处理 一、标本采集 一般情况下应在病人发热初期或发热高峰时，抗菌药物应用之前。对已用药且病情不允许停药的患者，也应在下次用药前采集。不同部位采集血样可选择左、右手臂或颈部，避免通过静脉置管直接采集血样。 （一）采集方法 1.布鲁杆菌感染 最易获得阳性培养的是发热期的血液或骨髓。除发热期采血，还可多次采血，一般 24h采血3~4次。 2.沙门菌感染 根据病程和病情可在不同的时间采集标本。肠热症患者在病程第1~2周内采取静脉血液，或在第1~3周内采集骨髓是最佳时间。 3.亚急性细菌性心内膜炎 除发热期采血外，应多次采血。若24h培养阴性，应继续抽血3份或更多次采样。 4.急性细菌性心内膜炎 治疗前1~2小时内分别在3个不同部位抽血样，进行培养。 5.急败血症 脑膜炎、骨髓炎、关节炎、急性未处理的细菌性肺炎和肾盂肾炎除在发热期采血外，应在治疗前短时间内于身体不同部位采血，分别作需氧和厌氧培养。 6.不明原因发热 可于发热周期内多次采血作培养。若24h培养结果为阴性，应重新采样。 7.肺炎链球菌感染 在寒战、高热或休克时采样，可提高阳性率。 8.分枝杆菌感染 感染初期，容易发生淋巴-血流播散。早期采样，阳性率较高。 9.螺旋体感染 感染早期（一周内）未用药前采样。怀疑回归热螺旋体感染时，间歇性采样可获得较高的阳性率。 （二）采血量 无菌采取病人血样血液与培养基比例以1﹕10为宜，成人5~10ml，儿童3~5ml，骨髓穿刺液1~2ml，并接种于相应培养瓶内。接种血样时应先接种厌氧瓶。 二、病原菌 健康人的血液是无菌的，当人体局部感染向全身播散和出现全身感染时，血液中可出现细菌，依程度不同分为菌血症、败血症或毒血症，当细菌侵入骨髓可引起严重的骨髓炎。常见病原菌见表6-6-1。 表6-6-1 血液、骨髓中常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 脑膜炎奈瑟菌 表皮葡萄球菌 卡他莫拉菌 A群、B群链球菌 伤寒及副伤寒沙门菌 草绿色链球菌 大肠埃希菌 肺炎链球菌 肺炎克雷伯菌 肠球菌 肠杆菌属菌种 厌氧链球菌 沙雷菌 产单核李斯特菌 铜绿假单胞菌 产气荚膜芽胞梭菌 假单胞菌属菌种 丙酸杆菌 不动杆菌 念珠菌 流感嗜血杆菌 胎儿弯曲菌 拟杆菌 梭杆菌 三、标本接种与处理 1.选择合适的培养基 （1）一般细菌培养 可选牛肉浸液培养基、脑心浸液液体培养基及双相培养基等。 （2）布鲁杆菌培养 肝浸液为基础的酚红葡萄糖肉汤。 （3）链球菌和脑膜炎奈瑟菌 胰大豆胨酚红葡萄糖肉汤。 （4）厌氧菌 牛心脑浸液为营养基础的厌氧培养基。 （5）细菌L型 高渗培养基。 （6）仪器配套培养基 可根据临床需要选择合适培养基。一般有需氧培养基、厌氧培养基、高渗需氧培养基、小儿培养基、中和抗生素培养基等。 2．接种与培养 （1）根据需要，血培养应同时最少接种需氧和厌氧两种培养基。经12~18h ，35℃孵育，盲目传种血平板或巧克力平板1次。可提早检出阳性标本。 （2）盲目传种后，培养瓶继续孵育至第7天，每日早晨取出检查有无生长，并摇匀培养 液继续孵育。下列几种情况提示细菌生长。 1)均匀混浊，发酵葡萄糖产生气泡。 2)微混浊有绿色变化。 3)血球层上面出现颗粒状或絮状沉淀物生长，或自下而上的严重溶血。 4)混浊并有胶冻状凝固，瓶壁有颗粒状粘附。 5)表面有菌膜、菌环状生长。下呈混浊。 6）厌氧培养瓶有变化，而需氧培养瓶无细菌生长表现时，则可能为厌氧菌。 （3）肉眼见有细菌生长培养瓶的处理。 1)取生长物涂片，做革兰染色。 2)取生长物做药敏试验(直接试验)。 3)取生长物做相应的生化鉴定。 4)取生长物移种血平板、巧克力和麦康凯或厌氧平板，L-菌须转种高渗平板，分离以获得纯培养。 5）涂片证实为一种细菌生长，可直接用增菌液做鉴定试验。如有二种或多种细菌同时生长，则必须经过分离培养，以获得纯菌后做鉴定。 （4）无细菌生长表现的培养瓶的处理 在观察的7天中，最少应作2次盲目传种。需氧菌第1天和第7天各作l次盲目分离培养；厌氧菌3天和第7天各作1次分离培养。7天仍未见生长，报告阴性。可疑布鲁杆菌可培养28天，可疑军团病菌可培养10天。 四、血液和骨髓细菌检验流程 见图6-6-2 血液和骨髓 增菌培养（需氧及厌氧） 传统方法或自动血液培养仪 涂片、染色 分离培养 直接药敏试验 镜检（一级报告） 35℃4~6 h 需氧培养及CO2培养 厌氧培养 （血平板、巧克力平板及麦康凯） （厌氧血琼脂） 初步报告 （二级报告） 观察菌落 涂片 染色 生化试验 镜检 涂片、 纯培养 染色、 最终报告 镜检 （三级报告） 生化试验 血清学试验 药敏试验 最终报告 （三级报告） 传统方法 细菌鉴定仪 图6-6-2 血与骨髓细菌检验流程 五、报告内容与方式 采取三级报告。 1.一级报告 血培养一经有细菌生长迹象，应立即涂片，染色镜检，将初步结果报告临床。 2.二级报告 转种血平板及巧克力平板，并作初步药敏试验， 6~8h后，将初步药敏试验结果报告临床。 3.三级报告 完成鉴定及药敏试验结果，发出报告单。 4.培养3天仍为阴性时（仪器法48h）应通知临床医生，以便作出相应处理。 六、注意事项 1．所用培养瓶必须仔细检查有无变色或混浊。 2．标本采集必须在治疗前完成，并采用多瓶接种，按一人一瓶一单的原则贴好标签。 3．对疑为细菌性骨髓炎或HIV病人做分枝杆菌培养时，骨髓培养比血培养有更高的敏感性。 4.严格做好患者抽血部位的无菌消毒工作，培养瓶盖的消毒以75%酒精为宜。 5.同时作需氧菌和厌氧菌培养时，应先将标本注入厌氧瓶中，然后再注入需氧瓶。 6.接种有标本的培养瓶应立即送至细菌室。如有特殊情况不能送检的，应将培养瓶置于室温，切勿放入冰箱。 7.采集标本所用的针头、注射器及废弃的培养瓶须经高压灭菌方可丢弃。 8.标本送检过程中应注意保温。种有标本的血培养瓶破碎而引起环境污染，应立即妥善处理。 第2节​  第三节 尿液标本的采集、运送与处理 1．​  正常人体尿液是无菌的。经尿道排出的尿液，会受到尿道中细菌污染。中段尿中细菌数一般小于103cfu/ml。泌尿系统感染时，尿中的菌数通常高于104~105cfu/ml，可作为诊断泌尿系统感染的依据。 一、标本采集 （一）采集时间 1.一般原则 通常应采集晨起第一次尿液送检。原则上应选择在抗菌药物应用之前采集尿液。 2.沙门菌感染 发病2周左右采集尿液培养。 3.钩端螺旋体感染 感染后2周采集尿液培养。 4.结核分枝杆菌感染 留取晨尿或24h尿的沉渣部分10~15ml送检，若为培养，患者应停药1~2天（避免抗结核药物影响）后采集尿液培养。 （二）采集方法 1．中段尿采集方法 （1）女性 成年女性外阴部先用肥皂水清洗，再以灭菌水冲洗尿道口，然后排尿弃去前段尿，留取中段尿10ml左右于无菌容器内，立即加盖送检。 （2）男性 先用肥皂水清洗尿道口，再以灭菌水冲洗，留取中段尿。疑为尿道炎时，可将最初3~4ml尿收集在灭菌容器中。该尿即使细菌数较少，如反复检查为同一细菌，也应考虑为病原菌。 （3）儿童 采集标本较为因难。如尿内细菌明显增多，可高度怀疑为尿路感染。无菌则可否定。菌数居中时，必要时导尿或膀胱穿刺。 2.肾盂尿采集法 用导尿管采集肾盂尿，充分冲洗膀胱，以最后一次冲洗尿作为对照，再用导尿管插入输尿管，分别标记左右两侧收集3次尿；如输尿管菌数比对照尿菌数多或第三次比第一次多，该菌尿可能来自膀胱。此方法一般请泌尿科医师协助。 3.膀胱穿刺采集法 采集中段尿完全避免污染是很困难的，培养结果与病情矛盾时，可采用耻骨上膀胱穿刺取尿。 4.集尿法 结核分枝杆菌集菌检查法，可用一清洁容器，留24h尿取其沉渣10ml~15ml送检。 5.导尿法 采取导尿管留尿是一种较好的无菌采集法，取10ml~15ml于灭菌容器内送检。长期留置尿管者，应在更换新尿管后留取尿标本。 二、常见病原菌 留取中段尿标本后应立即送检、及时培养，以免细菌繁殖影响菌落计数，引起泌尿系统感染的常见细菌见表6-6-2。 表6-6-2 引起泌尿系统感染的常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 淋病奈瑟菌 A群链球菌 大肠埃希菌 腐生葡萄球菌 变形杆菌 表皮葡萄球菌 肺炎克雷伯菌 结核分枝杆菌 产气肠杆菌 假丝酵母菌 沙门菌属 肠球菌 铜绿假单胞菌 厌氧链球菌 沙雷菌 阴道加德纳菌 三、检查方法 （一）涂片检查 取新鲜尿液5~7ml，置无菌试管，3000rpm离心30min，弃去上清液，取沉淀制成涂片，根据临床需要，选择革兰染色、抗酸染色及其它染色、根据细菌的着色、形态及排列，可初步报告。如见有革兰染色阴性双球菌呈肾型时，可初步报告在细胞内外均找到革兰阴性双球菌呈肾型，疑似淋病奈瑟菌。抗酸染色时查见红色杆菌即报告“找到抗酸杆菌”。 （二）培养检查 1．普通培养 （1）一般细菌培养 用无菌接种环取尿液分别接种血琼脂平板和麦康凯平板35℃培养18h~24h，观察结果。根据菌落的形状及涂片镜检菌体特征，选择相应方法进一步鉴定，48h无细菌生长方可报告“无细菌生长”。 2.淋病奈瑟菌培养 将标本立即接种于巧克力平板，置35℃5%~10%CO2培养24h~48h，若有可疑菌落，按淋病奈瑟菌进行鉴定。 3. L型细菌培养 将尿液接种于血琼脂平板和高渗液体培养基，置35℃培养，由于L型细菌生长缓慢，所以高渗管应放5~7天，在液体中，呈现颗粒状生长，可粘附于管壁或沉于管底，吸出颗粒镜下观察，同时转种平板。无阳性发现可报告无L型细菌生长。 4. 结核分枝杆菌培养 将尿液接种于血琼脂平板上，35℃培养18h~24h后无细菌生长，可将尿液离心取沉淀物0.1ml接种在罗氏培养基上。如有细菌生长，需进一步鉴定。 5.厌氧菌培养 必须用膀胱穿刺尿进行培养，接种于厌氧菌培养基。 6.真菌培养 见有关章节。 7.钩端螺旋体培养 见有关章节。 （三）定量培养 1．倾注平板法 在含有9.9ml无菌生理盐水无菌试管中加入被检尿液0.1ml，混匀。取1ml置灭菌平皿，加入冷却至50℃左右的培养基9ml，与尿混匀，待凝固后置35℃培养24h。生长菌落数乘以1000即相当于每毫升中菌数。 2. 平板接种法 取尿5μl滴注在平板培养基上，用无菌接种环（或L型玻璃棒）涂抹均匀，待表面干燥后，35℃培养过夜，计数生长的菌落数，乘以200即相当于每毫升的菌数。 3. 定量接种环涂抹法 用定量接种环（10μl）蘸取尿液，在琼脂平板上作均匀划线接种，置35℃培养24h，计数生长的菌落数，乘以100即相当于每毫升中菌数。做定量培养，菌落生长过多不可计数时，则报告>105cfu/ml。 四、 尿液标本的检验流程见图6-6-3 尿液标本 离心、沉淀、 定量培养、 分离培养 直接药敏 涂片、染色、 细菌计数 镜检 一般细菌培养 特殊培养 35℃4~6小时 （一级报告） 血平板 选择适宜 初步报告 和麦康凯平板 的培养基 （二级报告） 和培养条件 菌落观察 涂片、染色、 纯培养 镜检 鉴定试验 药敏试验 最终报告（三级报告） 图6-6-3 尿液细菌检验流程 五、报告方式 10%的尿路感染患者，可能会在同份尿标本中分离到两种病原菌。若同份标本中检到3种以上不同种微生物，应认为采集或处理标本时被杂菌污染。一般认为，尿标本中革兰阴性杆菌菌落计数大于105cfu/ml或革兰阳性球菌计数大于104 cfu /ml时有临床诊断意义，应报告鉴定结果及药敏试验。 六、注意事项 1.尿液检查应取晨起第一次尿液送检。 2.尿液标本采集时必须严格进行无菌操作。 3.尿液标本采集后应尽快送检，否则会影响细菌检查的准确性。 4.尿液细菌培养应在用药前送检，尿液中不得加防腐剂或消毒剂。 第3节​  第四节 粪便标本的采集与处理 正常人的肠道中栖居大量的不同种类的微生物，组成了对人类健康极为重要的体内微生态环境——微生态菌膜屏障，参与营养、消化、吸收及整洁肠道，维护健康作用。腹泻是因病原菌或病毒在肠道内感染或毒素等引起的结果。 一、常见病原菌 引起腹泻的细菌种类较多。各类腹泻也具有一定的临床特点，病原菌见表6-6-3。 表 6-6-3 粪便标本常见病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 金黄色葡萄球菌 伤寒及其他沙门菌 肠球菌 志贺菌属 厌氧链球菌 致病大肠埃希菌 结核分枝杆菌 弧菌属细菌 产气荚膜芽胞梭菌 气单胞菌 白色念珠菌 邻单胞菌 难辨梭菌 小肠结肠炎耶尔森菌 弯曲菌 二、标本的采集 （一）标本的采集时间 1. 采样原则 腹泻病人应在急性期采集，以提高检出率，尽可能在用药之前。 2. 沙门菌感染 肠热症在2周以后；胃肠炎病人在急性期，早期采集新鲜粪便。 （二）采集方法 1．自然排便采集法 自然排便后，挑取有脓血或粘液部位的粪便2g~3g，液状粪便取絮状物盛于无菌的容器内或置于保存液或增菌液中送检。 2．直肠拭子方法 对难于获得粪便或排便困难的患者及幼儿，可采用直肠拭子方法采集，取出后插入灭菌试管内送检。如不能立即送检应放入运送培养基或pH7.0的磷酸盐甘油中运送或保存。 三、检验方法 (一)直接涂片检查 粪便标本一般不作涂片检查，只有少数细菌，如霍乱弧菌、结核分枝杆菌、难辨芽孢梭菌、葡萄球菌以及念珠菌引起感染时才做直接涂片检查。 1．霍乱弧菌 (1)染色检查 通常为米泔样便，取新鲜标本涂片2张，用乙醇或甲醇固定，分别作革兰染色及1:10稀释的石炭酸复红染色，用油镜检查，观察有无呈鱼群样排列杆状或弧形革兰阴性菌。 (2)悬滴(压滴)检查 取粪便制成悬滴(压滴)标本，检查细菌的动力，霍乱弧菌古典生物型和El-Tor生物型均呈穿梭状运动。在悬滴涂片中加入01群霍乱弧菌诊断血清后，在显微镜下观察，若原运动活泼的现象停止，为制动试验阳性。可初步报告为“疑似01群霍乱弧菌”。并可初步报告有关疾病控制卫生机构及时作出处理。 2．葡萄球菌 疑似葡萄球菌引起的伪膜性肠炎患者，可取水样便或肠粘膜样物涂片，革兰染色后镜检，当见有革兰阴性杆菌明显减少，革兰阳性球菌大量散在或成堆(葡萄状)排列，可提示诊断。 3．难辨梭菌 取患者新鲜粪便涂片，革兰染色后镜检可见大量革兰阳性粗大杆菌，无荚膜，大多能形成卵圆型芽胞位于菌体一端，可提示诊断。 4．结核分枝杆菌 取蚕豆大小粪便与饱和生理盐水10ml~15ml混合。静置1h~2h，取浮面液体涂片作抗酸染色，若找到红色杆菌可报告“找到抗酸杆菌”。 5．空肠弯曲菌 将粪便涂片作革兰染色，镜检可见细小、长而弯曲、S形、螺旋形、成海鸥状的的革兰阴性弧菌，可作初步报告“疑似弯曲菌”。 6．念珠菌 将粪便制成压滴标本，当用高倍镜观察时可发现光亮的卵圆形孢子或假菌丝。涂片革兰染色可见革兰阳性瓜子形状的孢子或假菌丝。若仅见到孢子则报“找到革兰阳性卵圆形芽生真菌孢子”，同时还有假菌丝则可报告“检出念珠菌”。 (二)培养检查 l．在普通培养基上生长的细菌 (1)葡萄球菌 取粪便接种于血平板，经35℃18h~24h，挑取可疑菌落涂片行革兰染色后观察菌体的着色、形态及排列，并进一步进行鉴定。亦可用选择性培养基如高盐卵黄琼脂或高盐甘露醇琼脂分离。 (2)肠球菌 见有关章节。 2．在选择培养基上生长的细菌 (1)致病大肠埃希菌 取样分别接种于麦康凯琼脂及血平板，经35℃培养18h~24 h，挑取发酵乳糖的菌落穿刺接种KIA(三糖铁)和UMI(尿素动力靛基质)进行初步生化鉴定，并进行血清学分型。 (2)沙门菌和志贺菌 取样分别于接种SS和麦康凯平板，必要时接种GN增菌液。置35℃培养6h后，再分别转种上述平板，35℃培养18h~24h，挑取可疑菌落接种KIA和UMI培养基，根据生化反应和血清学分型结果，做出最终鉴定。 (3)霍乱弧菌 将标本直接接种碱性胨水，35℃培养6h~8h后转种4号或TCBS平板，疑似霍乱弧菌感染的标本除增菌外，同时划种平板，35℃培养16h~18h，挑取可疑菌落进行进一步鉴定，必要时可作二次增菌后分离鉴定。 (4)副溶血弧菌 将标本接种于副溶血弧菌增菌液，同时接种副溶血弧菌选择性平板和SS琼脂平板，35℃培养18h~24h，挑取可疑菌落接种KIA、UMI及做耐盐试验进行鉴定。 (5)小肠结肠炎耶尔森菌 将标本接种小肠结肠炎耶尔森菌培养基及麦康凯琼脂，分别置22℃~25℃及35℃培养48h，前者用于分离小肠结肠炎耶尔森菌，后者用于分离沙门菌和志贺菌，挑取可疑菌落接种KlA和MIU，进行鉴定。 (6)难辨芽孢梭菌 将标本立即接种环丝氨酸-甲氧头孢菌素-果糖琼脂(CCFA)平板。也可将粪便作l0-6~10-2稀释后定量分离培养。厌氧培养48h，挑取可疑菌落进行鉴定。 (7)空肠弯曲菌 取液状或带血粪便标本立即接种于弯曲菌选择培养基（Camp-BAP血琼脂）或接种CEM增菌液(经43℃微需氧培养18~48h后，再接种于上述选择培养基上)，在43℃微需氧(亦可用浊缸)条件下培养，最好采用混合气体(85% N2、10% CO2，、5% O2)的方法，培养24h~48h，观察菌落特征，挑取可疑菌落进行鉴定。 (8)结核分枝杆菌 将粪便标本首先进行培养前处理，然后接种L-J培养基，置35℃6~8周。挑取可疑菌落进行鉴定。 (9)念珠菌 将标本接种于含氯霉素的沙保罗平板和血平板,置25℃~30℃和35℃培养24~48h，取培养物进一步鉴定。 (10)菌群失调及菌群交替症 根据临床提示选用数种培养基，包括强选择和弱选择性肠道菌培养基，需氧及厌氧血琼脂平板，甘露醇食盐琼脂平板，Camp-BAP血平板，沙保罗琼脂等。将标本接种于上述各平板，分别孵育于22℃、35℃、42℃需氧、微需氧、厌氧环境等，生长后按各类细菌分别进行鉴定，并观察其数量变化。 四、粪便及肛拭子的细菌检验流程 见图6-6-4 粪便及肛拭子标本 涂片、 悬滴 分离培养 染色、 （压滴） 镜检 镜检 （一级报告） 一般细菌培养 特殊细菌培养 血平板、 选择适当培养基 麦康凯琼脂 和培养条件 分离鉴定 挑取可疑菌落 药敏试验 KIA、UMI 最终报告 生化鉴定 血清学鉴定 药敏试验 最终报告 （三级报告） 图6-6-4粪便及肛拭子的细菌检验流程 五、报告方式 多种细菌可以引起人类腹泻，其中不少菌种要求较特殊培养，当分离粪便中的致病菌时，未提供上述各类菌种生长的必要条件，培养阴性结果，不应采用"无致病菌"或"末检出致病菌"的报告方式。 报告方式应以分离目的菌种的结果而决定，如目前常规用SS和麦康凯平板分离粪便中的致病菌，阳性者报告“分离到沙门菌或志贺菌”，阴性报告“末检出沙门菌属和志贺菌属”。其他培养结果报告方式，与上述原则基本相同。 六、注意事项 1．标本采集最好在用药前完成。 2．标本盛装应尽量采用无菌容器。 3．采集新鲜粪便作培养，可提高阳性率。 4．腹泻病人应尽量在急性期采集标本（3天以内），以提高阳性率。 5．厌氧菌培养标本应尽量避免与空气接触和正常菌群的污染，最好在床边接种。 第五节 痰及下呼吸道标本的采集、运送与处理 正常人体上呼吸道有正常菌群栖居，而下呼吸道是无菌的。因下呼吸道的分泌物须经上呼吸道排出，常受该处的正常菌群的污染，因此，判断下呼吸道分泌物中是否有病原菌存在，须对上呼吸道的正常菌群有所了解。 一、常见微生物 （一）正常菌群 从呼吸系统感染患者的标本中分离出病原菌的机会相当多，对细菌学检验结果的正确解释并非容易，只有区别是病原菌还是上呼吸道的正常菌群，才能判断被检标本中是否有病原菌存在。上呼吸道的正常菌群见表6-6-4。 表6-6-4上呼吸道栖居正常菌群 α、γ链球菌 微球菌 拟杆菌 梭杆菌 厌氧球菌 表皮葡萄球菌 奈瑟菌* 嗜血杆菌* 棒状杆菌* *致病菌除外 （二）病原菌 痰及上呼吸道标本中常见病原菌见表6-6-5。 表6-6-5痰及上呼吸道标本中的病原菌 革兰阳性菌 革兰阴性菌 肺炎链球菌 卡他莫拉菌 金黄色葡萄球菌 流感嗜血杆菌 化脓性链球菌 脑膜炎奈瑟菌 厌氧球菌 肺炎克雷伯菌 结核分枝杆菌 其它肠杆菌科细菌 放线菌 假单胞菌属细菌 奴卡菌 百日咳鲍特菌 念珠菌 嗜肺军团菌 白喉棒状杆菌 炭疽芽胞杆菌 二、标本采集 （一）标本采集的时间 1.痰 （1）以晨痰为好。多数病人晨痰较多，即使对痰量少的患者，也以清晨采集最为容易。对支气管扩张症或与支气管相通的空洞患者，清晨起床后进行体位引流，可采集大量痰液。 （2）最好在应用抗菌药物之前采集标本。 2.鼻咽拭子 时间上虽无严格限制，但应于抗菌药物治疗前为好。咽部又是呼吸和食物的通路，因此亦以晨起后采集为宜。 （二）采集方法 合格的标本采集是取得正确检验结果的关键，因此临床工作人员要教会患者如何采集或亲自去采集，取得深部的痰液而不是唾液。 1.痰液标本 （1）自然咳痰法 患者清晨起床后，用冷开水反复漱口后用力自气管咳出第一口痰，对于痰量少或无痰的患者可采用雾化吸入加温至45℃的100g/L NaCl水溶液，使痰液易于排出。将痰收集于灭菌容器中尽快送检。 （2）支气管镜采集法 用支气管镜在肺内病灶附近用导管吸引或用支气管刷直接取得标本，患者常不愿接受。 （3）胃内采痰法 该方法于清晨空腹时，将胃管插入胃内，用注射器抽取胃液。适用于无自觉症状的肺结核病人尤其是婴幼儿不会咳嗽，常将痰吞咽入胃，可采集胃内容物做结核分枝杆菌培养，其阳性率比咳痰高10%左右。 （4）气管穿刺法 通过气管取得痰液主要用于厌氧菌培养。 （5）小儿取痰法 用弯压舌板向后压舌，用棉拭子伸入咽部，小儿经压舌刺激咳嗽时，可喷出肺部或气管分泌物粘在拭子上，尽快送检。 2.上呼吸道标本 采集上呼吸道标本通常采用无菌棉拭子。采集前患者应用冷开水反复漱口，由检查者将舌向外拉，使腭垂尽可能向外牵引，将棉拭子通过舌根到咽后壁或腭垂的后侧，涂抹数次，但拭子要避免接触口腔和舌粘膜。 三、检验方法 (一)直接涂片检查 接到标本后涂片检查，其目的是确定标本是否适合做细菌培养；初步判定是否有病原菌存在。 1．痰标本 (1)挑取脓性或带血部分痰液制备2张涂片，一张做革兰染色，另一张根据需要做其它染色。 (2)革兰染色后用低倍镜观察白细胞和上皮细胞数量的多少来初步判定，如白细胞<10，上皮细胞>25，则要求重新留取标本，不宜做培养；白细胞>10，上皮细胞<25时，还要参照高倍镜下的情况进行区分： 1)视野中有少量扁平上皮细胞(或无)，少量白细胞，见3种以上细菌，说明为唾液，不宜培养。 2)视野中见有数量不等的白细胞或纤毛柱状上皮细胞或二者同在，有一种细菌或两种(少见，见于免疫功能低下者)，将结果记录下来，同时报告临床医师。 3)标本被证实来自下呼吸道后，用油镜观察细菌的着色、形态及排列，大致可以通过涂片镜检做出初步病原学诊断，如葡萄球菌、肺炎链球菌、念珠菌。 （二）培养检查 1．痰液培养 (1)痰液培养前的处理 1) 痰的洗净 由于痰含有许多正常菌群，影响病原菌检出。将痰加入10ml~20ml无菌生理盐水的试管中，剧烈振荡5s~10s，然后用接种环将沾于管底的脓痰沾出，再放另一试管内，以同样方法反复两次，最后将剩余的脓痰接种在培养基上。 2) 痰的均质化 向痰内加等量约pH7.6的10g/L%胰酶溶液，放置35℃90min，即能使痰液均质化，而对细菌培养无甚影响。 (2)一般细菌培养 根据临床要求将处理后的脓痰选择接种于血平板、麦康凯平板、巧克力平板和沙保罗平板，置适宜的培养环境培养，18~24h后观察菌落特征并涂片行革兰染色，根据菌体的形态、特点做出初步鉴定。 (3)结核分枝杆菌培养 将被检标本中加入等量的4% H2SO4，混匀，放35℃ 20min(粘稠标本在放置期间要振荡数次)促使其液化，对痰中的杂菌进行处理。然后取出3000rpm，l5min离心弃去上清，加BTB指示剂1~2滴，用40g/LNaOH中和(终点为淡绿色)，将其接种于改良罗氏培养基，轻轻转动试管，使其均匀附着于培养基表面，置35℃培养，一般第一周观察两次，以后每周一次，观察菌落出现的时间与形态，阳性结果，随时发出报告，阴性者6周后发出报告。 (4)嗜肺军团菌培养 将均质化的标本接种于血平板、巧克力平板和BCYE平板，置35℃5% CO2环境中培养。若在上述培养基中24h内有细菌生长，此菌不是军团菌。如在BCYE平板上48小时后生长，而血琼脂平板和巧克力平板上不生长，此菌可能是军团菌。应进一步鉴定。 (5)厌氧菌培养 参见有关章节。 2．下呼吸道标本培养 (1)一般细菌培养 方法同痰培养相一致。 (2)百日咳鲍特菌培养 将鼻咽拭子直接接种鲍-金二氏琼脂平板上，亦可采用咳碟法接种。由于此菌生长缓慢，往往需要3~5天，饱和湿度对其生长有利，故将培养平板置于盛有少许水份的容器内进行培养，35℃48h~72h后观察结果。 (3)白喉棒状杆菌培养 将拭子接种血平板或亚碲酸钾血平板或吕氏血清斜面培养基，37℃培养24~48 h，观察各种培养基上的菌落特征，并进一步进行鉴定。 (4)脑膜炎奈瑟菌培养 接种于巧克力平板和0.5%葡葡糖肉汤，置5%~10%C02，35℃24~48小时培养，观察其生长情况。 四、痰及下呼吸道标本的检验流程 痰及下呼吸道标本的检验见图6-6-5。 痰及下呼吸道标本 涂片、 培养前处理 直接药敏试验 染色、 镜检 一般细菌 特殊细菌 35℃4~6 h 初步报告 培 养 培 养 （一级报告） 初步报告 （二级报告） 血平板、 选择适当 麦康凯平板、 的培养基 巧克力平板 和适宜的 沙保罗平板 培养条件 菌落观察 涂片、 纯培养 染色、 镜检 鉴定试验 药敏试验 最终报告 （三级报告） 图6-6-5 痰及下呼吸道标本细菌检验的操作流程 五、报告方式 1．草绿色链球菌为口腔和鼻咽部的正常菌群，痰标本培养48h后仅有草绿色链球菌生长而无致病菌生长，报告“正常菌群”。 2．痰中部分病原菌属于条件致病菌，与正常菌群同在，当其数量超过正常菌群时可报告鉴定结果及其敏感试验结果。同时报告细菌的量化指标见表6-6-6。 3．检出致病菌时，除报告该菌的鉴定名称外，同时报告正常菌群的量化指标（同上）。 表6-6-6 痰标本在平板上的菌落量化指标 分 级 划线区菌落数目 第1区 第2区 第3区 少见（+） <10 少量（++） >10 <5 中等（+++） >10 >5 <5 多量（+++） >10 >5 >5 六.注意事项 1.采集标本以清晨为佳，采集前应先用冷开水充分漱口，以免口腔正常菌群污染标本。 2.标本采集后应立即送检。 3.结核分枝杆菌检查，痰量要多。 4.肺部感染的患者可能患有菌血症，应同时做血液培养。 第4节​  第六节 各种穿刺液标本的采集与处理 穿刺液主要包括脑脊液、胆汁、胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液等。上述体液正常是无菌的，在排除污染的情况下，一旦检出的细菌均视为病原菌，应及时给予正确的治疗。 一、标本采集 （一）标本采集的时间 1.脑脊液 (1)采集时间 怀疑为脑膜炎的病人，应立即采集脑脊液，最好在使用抗菌药物之前采集标本。 (2)采集方法 以腰穿方式采集脑脊液3~5ml，一般放入3支无菌试管，每个试管内1~2ml。如果用于检测细菌或病毒，脑脊液量应大于或等于1ml；如果用于检测真菌或抗酸杆菌，脑脊液量应大于或等于2ml。 2.胆汁等其它穿刺液 (1)采集时间 怀疑感染存在，应尽早采集标本，一般在患者使用抗菌药物之前或停止用药后1~2天采集。 (2)采集方法 用针穿刺法抽取标本或外科手术方法采集标本，然后放入无菌试管或小瓶内，立即送实验室。尽可能采集更多的液体，至少1ml。 二、常见病原菌 脑脊液、胆汁和胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液等穿刺液标本中常见病原菌见表6-6-7、表6-6-8和表6-6-9。 表6-6-7 脑脊液中常见的病原微生物 球 菌 杆 菌 其 它 革兰阳性 革兰阴性 革兰阳性 革兰阴性 葡萄球菌 脑膜炎奈瑟菌 炭疽芽胞杆菌 流感嗜血杆菌 新型隐球菌 B群链球菌 卡他莫拉菌 结核分枝杆菌 产气肠杆菌 白色念珠菌 A群链球菌 产气荚膜芽胞梭菌 大肠埃希菌 病毒 消化链球菌 产单核李斯特菌 肺炎克雷伯菌 寄生虫 肺炎链球菌 假单胞菌 钩端螺旋体 肠球菌 拟杆菌 无色杆菌 不动杆菌 多杀巴斯德菌 脑膜败血性黄杆菌 表6-6-8 胆汁中常见的病原微生物 革兰阳性球菌 革兰阴性杆菌 其它 肠球菌 肺炎克雷伯菌 寄生虫 厌氧链球菌 大肠埃希菌 葡萄球菌 变形杆菌 产气肠杆菌 假单胞菌 伤寒及其它沙门菌 脆弱拟杆菌 产碱杆菌属 气单胞菌 表6-6-9胸水、腹水、心包液、关节液和鞘膜液等其它穿刺液中常见的病原微生物 球 菌 杆 菌 其 它 革兰阳性 革兰阴性 革兰阳性 革兰阴性 肺炎链球菌 淋病奈瑟菌 结核分枝杆菌 大肠埃希菌 放线菌 A群链球菌 类白喉棒状杆菌 肺炎克雷伯菌 奴卡菌 葡萄球菌 产气荚膜芽胞杆菌 臭鼻克雷伯菌 真菌 草绿色链球菌 炭疽芽胞杆菌 梭杆菌 支原体 厌氧性链球菌 拟杆菌 病毒 肠球菌 假单胞菌属 立克次体 军团杆菌 寄生虫 变形杆菌 流感和副流感嗜血杆菌 沙门菌属 不动杆菌属 产碱杆菌属 产气肠杆菌 三、检验方法 (一)涂片检查 1．革兰染色 肉眼观察，混浊或脓性穿刺液可直接涂片。除此之外可将标本3000rpm离心，10~15min，用沉淀物涂片、染色镜检。根据各种感染微生物的形态和染色特性，可初步提示感染细菌的种类，如脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌、抗酸杆菌、新型隐球菌等。 (二)接种和培养 （1）普通细菌培养 直接将穿刺液或离心后沉淀物分别接种血平板、麦康凯平板和疱肉汤，置35℃，培养18h~24，观察有无细菌生长。如果无细菌生长，再转种疱肉汤，继续培养至72h，仍无细菌生长者，可报告无细菌生长。如果有细菌生长，应根据菌落特点和菌体染色形态，初步判断细菌的种类，并进一步作生化反应及血清学检查加以鉴定，并作出报告。主要用于链球菌、葡萄球菌、革兰阴性菌、革兰阳性菌的分离培养。 （2）脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、结核分枝杆菌、新型隐球菌及厌养菌等特殊细菌培养可详见有关章节。 (三)特殊检查 （1）乳胶凝集法 直接测定释放在CSF的各种细菌可溶性抗原。目前国外可供的商品化试剂有肺炎链球菌，A群、B群、C群脑膜炎奈瑟菌和抗B型流感嗜血杆菌，定量隐球菌抗原，B群链球菌抗原等。 (2)分子生物学技术 DNA或RNA探针、PCR技术等，为临床微生物快速、准确检测提供了新的方法。 四、各种穿刺液标本的细菌检验流 程。 见图6-6-6。 脑脊液 穿刺液 胆汁 乳胶凝集 墨汁染 试验（检 色（检 PCR法 测可溶性 测新型 检测结 的致病菌 隐球菌） 核杆菌 涂片 培养 抗原） 革兰染色、 传统方法 自动化仪器 抗酸染色 （镜检） 需氧菌、 结核快速 厌氧菌、 培养 真 菌 L型菌 真菌培养 结核培 一般细 （沙保罗 养（L-J 菌培养 培养基） 培养基） MTB结核 检测系统 需氧 传统方 厌氧 法接种 厌氧肉汤 肉汤 血平板、 厌氧血平板 麦康凯、 巧克力 平板 35℃ 35℃24小时 48小时 纯 培 养 分离鉴定 鉴定药敏 报告结果 图6-6-6 穿刺物标本细菌检验的操作流程 五、报告方式 排除标本污染，穿刺液中检出的细菌均应报告鉴定结果及其药敏试验。 六、注意事项 1.穿刺液细菌涂片或培养标本采集后应15min内送至细菌室，不可置于4℃冰箱内。 2.病毒检测标本，送检时应放置冰块，15min内送到实验室。 3.穿刺液培养时，建议同时作血培养。 4.为了防止穿刺液的凝固，最好在无菌试管中预先加入灭菌肝素。 5.穿刺液普通培养时，应同时做厌氧菌培养。 第七节 生殖道标本的采集与处理 一、标本采集 （一）标本采集 1．尿道分泌物 （1）男性 清洗尿道口，采取从尿道口溢出的脓性分泌物或尿道内2~4cm取出分泌物。如无脓液溢出，可通过按摩，促使分泌物溢出。 （2）女性 清洗尿道口后，从阴道内诊压迫尿道或向前按摩，使分泌物溢出。无肉眼可见的脓液，可用灭菌拭子轻轻深入前尿道内采集标本。 2．巴氏腺、尿道旁腺 清洗或局部消毒后，压迫腺体可使分泌物溢出，集于灭菌容器或用灭菌拭子蘸取。 3．阴道、宫颈分泌物 用窥器扩张阴道，用灭菌棉拭子采取阴道口或宫颈口分泌物培养或涂片镜检。 4．宫腔内容物 在怀疑有急性宫腔内感染时，原则上不采取宫腔分泌物，以免引起感染播散；必要时用灭菌导管抽取，导管外套一层保护膜，经子宫颈插入宫腔后再刺穿保护膜抽取分泌物。 5．前列腺按摩液 清洗尿道口，冲洗尿道膀胱后，用前列腺按摩法采集前列腺按摩液。用无菌容器收集。 6．精液 受检者应在5天以上未排精，清洗尿道口，采用手淫法或体外排精法，射精于灭菌容器送检。 7．溃疡分泌物 先用生理盐水清洗患处，用灭菌棉拭子取其边缘或基底部的分泌物，置灭菌试管内送检。 8．组织标本 感染部位的组织可作组织印片和培养，一、二期梅毒感染时可取活体组织荧光抗体染色或镀银染色，检查病原体。组织磨碎成细胞匀浆接种液体培养基。 二、常见病原菌 与人生殖器官感染有关的常见病原菌见表6-6-10。 表6-6-10 与人生殖器官感染有关的常见病原菌 细菌 金黄色葡萄球菌 腐生葡萄球菌 无乳链球菌 屎肠球菌 聚团肠杆菌 大肠埃希菌 肺炎克雷伯菌 淋病奈瑟菌 坏死梭杆菌 消化球菌属 普通类杆菌 产黑色素类杆菌 表皮葡萄球菌 化脓链球菌 粪肠球菌 产气肠杆菌 阴沟肠杆菌 阴道加德纳菌 奇异变形杆菌 芽胞梭菌属 消化链球菌属 双向类杆菌 脆弱类杆菌 真菌 白色念珠菌 球拟酵母 热带念珠菌 螺旋体 梅毒螺旋体 衣原体 沙眼衣原体等 支原体 人型支原体 解脲脲原体等 三、检验方法 (一)直接显微镜检查 1．不染色检验 取清洁玻片一张，滴加灭菌生理盐水，将采集的生殖道标本于盐水中混匀，覆以盖玻片，镜检。适用于观察清洁度、线索细胞、细菌的数量、形态及运动性。如念珠菌、梅毒螺旋体。 2．染色检验 (1)单染色 亚甲蓝单染色湿片观察线索细胞和淋病奈瑟菌。结晶紫或龙胆紫单染用于镜检阴道念珠菌假菌丝或孢子。 (2)复染色标本 1)革兰染色 用以观察细菌的形态及染色性、炎症细胞的数量及线索细胞，有无念珠菌假菌丝及孢子等。。 2)荧光染色 取尿道、宫颈及下疳处分泌物或脓汁涂布玻片，特异性荧光抗体染色后显微镜镜检。 3)镀银染色：梅毒螺旋体镀银染色呈黑褐色，可见螺旋状结构。 (二)分离培养 l．一般细菌培养 多采用血平板和或麦康凯平板进行培养、分离和鉴定。 2．淋病奈瑟菌培养 接种改良的TM培养基或NYC培养基或巧克力平板或血平板，置70%湿度，5%~10% CO2 35℃孵育，24h~48h，进一步鉴定。 3．沙眼衣原体培养、支原体培养和杜克嗜血杆菌培养 参见有关章节。 四、报告方式 报告鉴定结果及抗生素药敏试验结果。 五、注意事项 1．生殖器是开放性器官，标本采集过程中，应严格遵循无菌操作以减少杂菌污染。 2．阴道内有大量正常菌群存在，采取宫颈标本应避免触及阴道壁。 3．疑有宫腔感染，遇产妇行剖宫产，待胎儿娩出后取宫腔分泌物，并同时取婴儿耳拭子一同送检。 4．沙眼衣原体在宿主细胞内繁殖，取材时拭子应在病变部位停留十几秒钟，并采集尽可能多的上皮细胞。 5．疑有厌氧菌感染，标本采集避免与氧气接触，最佳方法是床边采样，直接接种置厌氧装置内。 第八节 烧伤标本的采集与处理 一．​  一、采集方法及注意事项 l．用无菌棉拭子，无菌操作直接从烧伤创面采取脓汁。 2．严重烧伤患者，发生感染同时易发生败血症，同时做血液培养，初次培养可作普通需氧瓶、普通厌氧瓶，若长期使用抗菌药物后采血应接种在加有青霉素酶、对氨基苯甲酸等高渗需氧瓶或高渗厌氧瓶等，每瓶5ml~10m1。 3．检测厌氧菌时最好是细菌室工作人员亲自去烧伤病人床前采集标本。 4．烧伤后12h内请勿采集创面的标本，否则不能获得阳性结果。 二、常见病原菌 由于烧伤的早期创面是无菌的，12h后创面可出现大量细菌，常见病原微生物见表6-6-11。 见表6-6-11 烧伤标本的常见病原微生物 革兰阳性 革兰阴性 其 它 金葡萄球菌 铜绿假单胞菌 亚氏肠杆菌 念珠菌 A群链球菌 大肠埃希菌 粘质沙雷菌 曲霉菌 肠球菌 产气肠杆菌 普鲁菲登斯菌 毛霉菌 消化链球菌 枸椽酸杆菌 不动杆菌 青霉菌 产气荚膜杆菌 肺炎克雷伯菌 脆弱类杆菌 镰刀菌 坏疽芽胞梭菌 变形杆菌 聚团肠杆菌 单纯胞疹病毒 阴沟肠杆菌 吉氏肠杆菌 巨细胞病毒 坂崎肠杆菌 水痘疱疹病毒 牛痘疱疹病毒 三、检查方法 （一）涂片检查 取脓性分泌物直接涂片，革兰染色，将镜检结果初步报告临床。 （二）培养方法 1．创面脓汁分泌物 （1）需氧菌 把带有脓汁的棉拭子，分别接种血平板和麦康凯平板，并置肉汤中增菌，于35°C培养16~18h，进一步鉴定。 （2）厌氧菌 最好床边接种或在厌氧条件下通过运输培养基迅速把标本送往细菌室。培养方法参见有关章节。 （3）真菌培养 拭子采集标本接种于沙保罗培养基。 四、烧伤标本的检验程序见图6-6-7 烧伤病人 创面分泌物 血液 涂片、 需氧培养 厌氧培养 染色、 37℃16~24 h 35℃48 h 增菌培养 镜检 （需氧及厌氧） （一级 传统方法或 报告） 自动血液培养仪 分离培养 涂片、染色 直接药敏 （需氧厌氧） 镜检 试验（4~6h） 生长菌落 生长菌落 报告 （二级报告） 涂片、染色、 生化反应 血清学试验 药敏 镜检 试验 报告 （三级报告） 图6-6-7 烧伤标本细菌检验流程 五、报告方式 按分离鉴定的菌种报告细菌名称及药敏 试验结果。 第九节 厌氧菌标本的采集与处理 厌氧菌感染是一种内源性感染，常规细菌培养阴性，有可能是厌氧菌感染。厌氧菌感染可遍及临床各科、人体的各个器官和组织，而大部分与需氧菌混合感染。 一、标本采集与运送 （一）采集 采集要尽可能避免正常菌群的污染以及与空气的接触。通过严格无菌技术，抽取血液、胸腔液、腹腔液、心包液、关节液、胆汁、脑脊液及通过外科无菌手术抽出的脓液等。抽取液体标本后，尽快排出空气，有条件可床边直接接种，置便携式厌氧装置内或直接运送（或接种至运送培养基）送至细菌室。 （二）运送 1．注射器运送法 液体标本、脓汁、胸腹水等，立即注入厌氧培养瓶内，尽快送往临床细菌室。用无菌空针抽取标本时，必须先排除多余的空气。 2.无氧小瓶运送法 玻璃小瓶内装有1/2量的运送培养基密封，无氧状态经过高压灭菌。 3．棉拭运送法 一般不采用该方法。 4．组织块运送法 组织块在密闭的厌氧罐中运送。 5．大量标本运送法 装满标本瓶，即刻驱除氧，加盖运送。 标本送入厌氧装置后，应尽快送到实验室，最迟不超过半小时。标本不应放在冰箱里，低温对一些厌氧菌有害，且低温下标本吸收氧气较多。 （三）厌氧菌培养主要失败原因 在采集过程中标本污染正常菌群和接触空气等。 二、临床常见厌氧菌（见表6-6-12） 表6-6-12 临床常见厌氧菌 厌氧性球菌 厌氧性革兰阴性杆菌 厌氧革兰阳性无芽胞杆菌 厌氧革兰阳性芽胞杆菌 消化球菌属 脆弱类杆菌 痤疮丙酸杆菌 破伤风杆菌 消化链球菌属 产黑素类杆菌 贪婪丙酸杆菌 产气荚膜杆菌 矛状消化链球菌 核梭杆菌 衣氏放线菌 肉毒杆菌 厌氧消化链球菌 坏死梭杆菌 难辨梭菌 中间型消化链球菌 死亡梭杆菌 微小消化链球菌 韦荣氏球菌 三、检验方法 （一）初步观察 根据标本性状、特性及细菌形态，判断有否厌氧菌感染及选择合适培养基。镜检对整个鉴定程序有质量控制作用。 （二）接种 1．接种选择性培养基 常用选择性培养基有：卡那霉素、万古霉素溶血平板，卡那霉素、胆盐七叶苷平板，环丝氨酸、头孢甲氧噻吩、果糖和蛋黄平板。标本除接种厌氧血平板外，还可根据涂片镜检情况，确定接种哪种选择培养基。 2．接种液体培养基 接种前，培养基要煮沸10min、排除液体中空气，迅速冷却后底部接种。包括疱肉葡萄糖培养基、脑心浸液及硫乙醇酸钠培养基，后两种需要补充氯化血红素(5μg/ml)，维生素K(l0μg/ml)及半胱氨酸(500μg/ml)。 （三）厌氧培养装置 厌氧菌需要在无氧环境下生长，造成培养环境无氧的方法有两种: 1．厌氧手套箱 价格较昂贵，适合大量标本的培养及鉴定操作，临床使用较少。 2．厌氧缸法和气袋法 接种完标本后将平板放入缸内，撕开气体发生袋立即放入缸内，迅速密闭厌氧缸，置35℃培养至少48h。或用含气体发生药片的气袋，加入l0ml水，放触酶，亚甲蓝或刃天青指示剂。此法方便，可床边接种。抽气送气法，抽气换气装置，抽出空气，送入混合气体(85% N2， l0% H2， 5% CO2)缸中