ELISA法测定SARS抗体效价

一 358 —— ELISA法测定SARS抗体效价 Drug evaluation，2005 Vo1．2 No．5 ·论 著· 郭采平，洪计灵，张 信，张剑平，蔡钦泉，陈玉琴，庞 日强 (深圳市卫武光明生物制品有限公司，广东 深圳 518107) 【摘要】 目的 利用酶联免疫吸附试验，建立了非典型肺炎(Severe Acute Respiratory Syndrome，SARS)冠状病 毒抗体滴度的检测方法。 方法与结果 经验证 ，该方法检测 249份阴性样本，1份假阳性；47份阳性样本， 均检出阳性，方法的特异性达到 99．7％；在 O．5～8U／ml效价范围内线性 良好，相关系数>0．98；回收率在 85％一 110％之间，重复性良好 ，cv<2％(et=0．05，n=5)；中间精密度 cv<18％(a--0．05，n=5)。 结论 该方法能达到免疫 学定量测定方法的要求，可用于血浆及静脉注射用人 SARS免疫球蛋白制品的 SARS IgG抗体效价检测和质量 控制。 【关键字】 非典型性肺炎；抗体；效价；酶联免疫吸附试验 【中图分类号】R392 【文献标识码】A 【文章编号】1672—2809(2005)05—0358-04 Determination of SARS antibody titer by ELISA method GUo Cai-ping,HONG】 ling,zHANG Xing, et矗． (Shenzhen Weiwu Guangming Biological ducts Co．。Ltd．Shenzhen 518107,ChinaJ Abstract： Objective To develop a determination method for Severe Acute Respiratory Syn． drome (SARS) Coronavirus antibody titer based on the ELISA method． Methods& Results Testing 249 negative and 47 positive samples， all positive samples an d one of 249 negative sam- pies showed positive results．Thus the specificity iS more than 99．7％．Th e calibration curve is lin． ear over the titer range from 0．5U／ml to 8．0U／ml with r>0．98．Recovery ranges from 85％ to 110％． And accuracy of within—day iS less than 2％(or=0．05，n=51．While accuracy of inter—person iS less than 1 8％(ct=0．05，n=51． Conclusion The method complies with the requirement for immunoas． says and can be adapt to determ ine the SARS antibody titer in human plasma or human SARS Im． munoglobulin products． Key W ords： Severe Acute Respiratory Syndrome；antibody；titer；ELISA 染的随机双盲临床观察结果表明，国产注射用多西 环素总痊愈率 63．46％，总有效率 90．38％，对敏感病 原菌清除率为 91．30％，对支原体和衣原体的清除率 为 86．96％，细菌阴转率 93．18％，不 良反应发生率 (34．62％)，主要为静脉炎，但绝大多数均为轻度反 应，不需特殊处理。与对照药注射用阿奇霉素相比临 床疗效和细菌清除率、阴转率无明显差别 ，但不良反 应发生率相对较低。 国产注射用多西环素在对敏感病原体所致感染 性疾病的疗效较好，特别是对目前发病率较高的非 淋菌性尿道炎的治疗值得推荐。 4 参考文献 【1】 殷凯生，殷民生主编．实用抗感染药物手册【 ．北京：人民卫生出 版社，2001，179—181． 【2】 吴 军，黄 海．多西环素治疗非淋菌性尿道炎和黏液性宫颈炎 【J】．医学导报，2003，22(7)：455． 【3】 李 钊，罗 伟，魏 聪，等．进口多西环索不同疗程治疗支原体感 染 l19例 ．皮肤病与性病，2002，3，42～43． (收稿 日期：2005—09—20 修回日期：2005—10-I5) ·国家 863计剐课题，项目编号：2003AA208202 作者简介：郭采平(1971一)，女，湖南永兴人，工程师，从事血液制品和疫苗的研究开发工作。 维普资讯 http://www.cqvip.com 药品评价 2005年 第 2卷 第5期 非典型肺炎 Severe Acute Respiratory Svn． drome．SARS)在 2002年底到 2003年上半年对我国 国民经济和社会稳定造成了极大危害．世界各国的 科学工作者对其病原学、流行病学、诊断学、治疗学 等学科进行了全面深入的研究。其中SARS病毒抗 体测定方法的研究，对上述流行病学、诊断学、治疗 学的研究意义重大．尤其是为疫苗免疫后的抗体产 生水平以及疫苗的质量和有效性评价、抗病毒药物 的筛选提供了基础的方法依据。因此，它被确定为国 家863计划重大项目 “非典型肺炎防治关键技术及 产品研制”课题“SARS病毒特异性免疫球蛋白的研 制”的攻关任务之一。 SARS抗体效价的测定．目前国内外报道的定性 检测方法主要有：间接免疫荧光法(IFA)pl、病毒中和 蚀斑法【2】和ELISA方法【3】。由于ELISA方法具有灵敏 度高，操作简便，样本处理量大，可定量测定等优点。 我们选择了ELISA法进行改进．建立了SARS IgG 抗体效价定量测定的方法。经初步验证，该方法的稳 定性、准确度、重复性、精密度、特异性、线性和范围 等均能达到免疫学定量测定方法的要求．适用于血 浆及静脉注射用人SARS免疫球蛋白制品的SARS IgG抗体效价检测和质量控制。 1 试验材料 1．1 酶标仪：MD—EMAX，上海科华，MK3，雷伯中国 公司。 1．2 洗扳机：DEM—IV，上海科华，MK，雷伯中国公 司。 1．3 37～65℃恒温水浴箱：HH．W21．600。北京精科华 趔 0 0 瑞仪器有限公司。 1．4 SARS抗体效价参比品 40U／ml中国药品生 物制品检定所。 1．5 SARS冠状病毒(IgG)抗体检测试剂盒(ELISA1 ：北京华大吉比爱生物技术有限公司。 2 方法与结果 2．1 试剂盒反应条件验证：分别以阴性、弱阳性、中 阳性、强阳性血清为样本，考察抗原抗体加温结合时 间．加入酶标工作液及加入终止液后时间对OD值 的影响，结果表明，样本与包被抗原在温育30min达 到最大反应平台，90min内均能检定，加入酶标工作 液后则在 20min为最大反应平台．45min内能维持 平台水平。 因此根据试剂盒说明书．确定试验反应程序为： 每次试验设空白对照、阳性对照 1孔、阴性对照2 孔。空白孔不加液体，阴阳对照液直接加50ul于孔 中，其余每孔加 100ul稀释液。再加参比品或待测样 品 l0ul混匀，37℃温育 30min，洗板5次后，除空白 孔外，每孔加入酶标抗人 IgG工作液 lOOul，37℃温 育20min，洗板 5次后，每孔加入底物 A、B各50 ul， 37℃避光温育 10min，显色，每孔加入终止液50 ul， 以空白孔调零．置酶标仪450nm波长下测定OD值 (参比波长为630nm)。 2．2 方法的稳定性 2．2．1以工作参比品稀释5倍、20倍和40倍作为样 品，考察加入终止液后OD值稳定性，每 15min测 OD值。结果如图1示。 由图 1可见，终止反应后，OD值随着时间的延 蠹 ～、建 ⋯⋯涛 一 戴 ～ 瘟 U o 15 30 45 60 15 90 105 120 ● 5倍稀释 o ． 904 0．9545 0．964 0．921 0．901 5 0．8845 0．8685 0．8565 0．8395 【一 2O倍稀释 0．4105 0．：399 0．4O／'0．3915 0．3195 0．316 0．366 0．363 0．355 llll盎l¨ 4O倍稀释 0．235 0．2O5 0．2lS 0．206 0．196 0．19l5 O．1885 0．18T 0．1815 图1 OD值一时间变化曲线图 长而下降，但速度相当慢，在30min内三个样本平均 只下降了3．76％，120min后 OD值下降了16．93％。 因此终止反应后在30min内读板，结果是稳定的。 时问 2．2．2 中国药品生物制品检定所对本法进行方法学 研究表明．阳性对照的稀释倍数与其0D450呈线性 关系【3】。我们取强阳性血浆标本，分别以试剂盒所带 维普资讯 http://www.cqvip.com 稀释液 (pH7．2)、含 2％牛血清的 PBS缓冲液 (pH7．6)、正常人血浆、纯化水及含2％人血白蛋白的 Tris—HCI缓冲液(pH7．0)作倍比稀释，按上法加样试 验，测定OD值，结果发现上述各稀释液对样品的最 Drug evaluation，2005 Vo1．2 No．5 终吸光度影响不大．以稀释倍数对吸光值作双对数 回归，回归系数都能达到0．95以上。说明该法样品 处理可采用上述各种方法进行稀释．加人板孔样品 的pH值范围较宽。 裹 1不同稀释液稀释样品后的OD值 2_3方法的特异性：取本公司的普通健康人血浆 240份，人免疫球蛋白(IMIG)4批，静脉注射用人免 疫球强白(IVIG)5批，原倍按上述方法进行检测，结 果24b份血浆中一份为弱阳性．该份血浆用IFA法 检测SARS抗体为阴性，其余血浆和IMIG、WIG均 为阴性；检测47份确诊SARS康复者血浆，结果均 为阳性，表明该方法特异性达到99．7％。 2．4 线形及范围：将工作参比品用稀释液稀释至 8U，ml，4U／ml，2U／ml，1．0U，ml，0．5U／ml上板反应后 ， 测定其OD值，试验重复三次，结果如表2，效价的对 数为X，OD值的对数为Y，进行直线回归作图，结果 如图2，表明在8～0．5U／ml范围内，方法线形良好，相 关系数分别为0．99、0．99、0．98，可以该系列参比品溶 液绘制标准曲线。 裹2 不同效价参比品的 OD值 U． UUU — J 0 ．00o0 I 一 ． 一 ⋯ “ ⋯ ⋯ 一 0．5000 ’ 睁 熟 一一 一 1．0000 一 1．5ooO 一 0．3010 0．00o0 0．3010 0．602l 0．903l — _．_一第一次 一0．9488 —0．6289 —0．3867 —0．1621 —0姗 0 — I一第二次 —0．8617 —0．5607 —0．3242 —0．1418 0．0661 第三次 一1．0150 —0．6250 —0．3960 —0．2O90 —0．0790 田2 标准曲线线性田 2．5 回收率及重复性：将工作参比品稀释至8．0U／ ml、4．OU／ml和 1．5U／ml，作为高、中、低样品，以0．5～ LOG(效价) 8．0U／ml的标准系列绘制标准曲线，测定其效价，与 理论值比较，计算回收率，回收率在 85～110％，重复 维普资讯 http://www.cqvip.com 药品评价 20o5年 第2卷 第 5期 表3 方法的回收率及重复性 性较好 ，CV分别为 0．65％、1．89％和 1．33％(a=0．05， n=51。 2．6 中间精密度：以不同的人，在本公司实验室，重 复测定 2o031o01和2o03O6SO1两批产成品及中间 品效价，测定次数为 5次，结果表明，变异系数分别 为 8．17％和 17．17％，如表 4。 表 4 中间精密度 3 讨论 SARS—CoV特异性 IgG抗体是一种保护性抗 体，人 SARS免疫球蛋白制品的 ARS—CoV特异性 IgG抗体效价及 SARS疫苗免疫后产生该抗体的滴 度水平直接与其保护力相关【4一。 一 般认为 SARS病毒 中和抗体试验是 检测 SARS抗体效价特异性最高的方法，董关木等报道了 用蚀斑减少中和试验测定血浆中SARS中和抗体效 价【刁，但只限于半定量测定，且不同实验室、不同病毒 株测定的结果差异较大。我们采用经国家药监当局 批准的 ELISA试剂。该试剂经验证特异性和灵敏度 高，重复性好13，61，经本法测定效价后的样本送中检所 进行了病毒中和试验，结果显示，ELISA法与蚀斑减 少中和试验测定的结果呈正相关性。 与病毒中和试验相比。EUSA法稳定性和精密 度高，操作简便易行，无需 P3实验室条件，病毒传染 的危险性也大大低于前者，因此笔者认为，如果制定 出SARS抗体效价测定标准品后 ，以该标准品绘制 标准曲线，ELISA法可以用于人血浆及 SARS免疫 球蛋白制品的SAILS抗体效价定量测定。 4 参考文献 [11 Thomas G．Ksiazek，Dean Erdman，Cynthia Goldsmith etc．A Novel Comnavirus Assocatied with Severe Acute Respiratory Syndrome． www．ncim．org，June 16，2003． 【2】 董关木，安 祺，刘文雪，等．SARS冠状病毒蚀斑形成技术的建立． 《第七次全国生物制品学术会议论文汇编》．225—226． [31 白坚石，王 威，郝 杰．血浆制品SAILS冠状病毒特异性抗体检 测【J]．中国生物制品学杂志，2003，16(5)：281． [4】 李 刚，陈雪娟，陈文思，等．2O例 SARS患者特异性抗体变化规律 叨．中国免疫学杂志，2003，19：372-374． 【5】 李 刚．传染性非典型肺炎抗体的检测及其临床意义评价叨．新 医学，2004，35(3)：133-134． [6】 沈晓娜，谢剑锋，杨式芹，等．传染性非典型肺炎病例 SARS冠状病 毒特异性抗体检测及分析 叨．中I~IA．兽共患病杂志，2003，19(6】： ll一13． (收稿 日期：2005—08-17 修回日期：2005-10-08) 维普资讯 http://www.cqvip.com