不同截留分子量超滤膜去除丹参注射液中细菌内毒素的实验研究

64 第 1 3卷 第 2 期 2011 年 2 月 辽 宁 中 医 药 大 学 学 报 JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM Vol. 13 No. 2 Feb .，2011 丹参注射液是以提取的丹参药材水溶性部位 配制而成的注射剂，具有活血化瘀、通脉养心的作 用。在临床上主要用于冠心病、胸闷、心绞痛。与其 它中药注射剂一样，热原的污染是一个棘手的问题。 注射剂中的热原主要是细菌内毒素，为革兰阴性菌 外壁层的脂多糖物质，此类物质具有耐热性和化学 稳定性，不易被去除。 目前注射剂生产常用活性碳吸附法除热原，去 除效率并不能保证，且存在有效成分被吸附损失的 问题。超滤法是一种较理想的除热原方法，已有不 少文献报道超滤技术可有效去除细菌内毒素[1]。对 丹参注射液的内毒素检查已有报道[2]，但很少有文 献报道通过动态浊度法 检测 工程第三方检测合同工程防雷检测合同植筋拉拔检测方案传感器技术课后答案检测机构通用要求培训 超滤技术去除丹参注射 液中细菌内毒素的效果。 本研究参照2005年版《中华人民共和国药典》 二部中细菌内毒素检查法中的动态浊度法定量检测 丹参注射液经截留分子量为5、10、50K的超滤膜超 滤前后细菌内毒素的含量，同时用HPLC检测超滤 前后有效成分的变化情况，以此评价不同孔径超滤 膜去除中药注射液中细菌内毒素的效果和对有效成 分的影响，来为注射剂生产工艺中除热原提供依据。 1 仪器与试药 1.1 仪器 Millipore蠕动泵，Millipore板框（平板式）超滤 器（Waters公司），超滤膜（大连屹东膜工程设备有 限公司，PS，截留分子量，MWCO=5K、10K、50K）。 BET-16M细菌内毒素测定仪、蜗旋混合仪（天津市 天大天发科技有限公司），Agilent 1100高效液相色 谱仪，G1311A Quat Pump，G1314A VWD检测器，在 线真空脱气机，Agilent全自动进样器，Agilent色谱 工作站，HT-230A柱温箱。 1.2 试药 动态浊度法鲎试剂（批号：0910160，λ=0.03 EU/mL，规 格：0.6mL/Amp，湛 江 博 康 海 洋 生 物有限公司）；细菌内毒素工作标准品（批号： 150601-200965，规 格：180EU/Amp，中 国 药 品 生 物制品检定所） ；细菌内毒素检查用水（批号： 0910190，规格：5mL/Amp，湛江博康海洋生物有限 不同截留分子量超滤膜去除丹参注射液中细菌内毒素的实验研究 张同星，李存玉，郑云枫，彭国平 （南京中医药大学药学院，江苏 南京 210029） 摘 要：目的：考察不同截留分子量超滤膜对丹参注射液中细菌内毒素的去除效果。方法：采用5、10、50K不 同截留分子量超滤膜对丹参注射液进行超滤，以动态浊度法和HPLC分别检测超滤前后丹参注射液中细菌内毒 素和有效成分的变化。结果：5、10、50K 3种超滤膜对丹参注射液中的细菌内毒素去除率分别为99.78%、99.25%、 87.99%，对注射液中丹参素钠的透过基本无影响，对原儿茶醛有一定影响。结论：5K和10K截留分子量的超滤膜能 很好的去除丹参注射液中的细菌内毒素，且对有效成分有很好的透过率，能用于丹参注射液的生产。 关键词：超滤技术；细菌内毒素；有效成分；丹参注射液 中图分类号：R283 文献标识码：A 文章编号：1673-842X (2011) 02- 0064- 03 收稿日期：2010-09-14 基金项目：江苏省六大人才高峰 计划 项目进度计划表范例计划下载计划下载计划下载课程教学计划下载 项目（2009） 作者简介：张同星（1986-），男，山东肥城人，硕士研究生，研究方向：中药提取分离与中药制备技术研究。 通讯作者：彭国平（1963-），男，研究员，博士生导师，研究方向：中药提取分离的研究与开发，中药化学产物的分离与精制。 E-mail：guopingpeng@sohu.com。 Experimental Study about Removing Bacterial Endotoxins in Danshen Injection by Ultrafiltration Membranes of Different Cut-off Molecular Weight ZHANG Tong-xing，LI Cun-yu，ZHENG Yun-feng，PENG Guo-ping （College of Pharmacy，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，Jiangsu，China） Abstract：Objective：To study the elimination of bacterial endotoxins in Danshen injection by ultrafiltration membranes of different cut-off molecular weight（MWCO）. Methods：Danshen injection was ultrafiltrated by 5K，10K，50K ultrafiltration membranes and the content of efectual components and bacterial endotoxins were detected by HPLC and kenitie-turbidimetry respectively. Results：The removal efficacy of bacterial endotoxins was 99.78%，99.25%，87.99% by using ultrafiltration membranes with molecular weight 5K，10K，50K. Ultrafiltration had little effect on the concenttration of Salvianic acid A sodium but its compound of Protocatechuic aldehyde had some lost. Conclusion：Ultrafiltration membranes， with cut off molecular weight 5K and 10K，which can efectively eliminate bacterial endotoxins and reserve effeetual components，are applied to used in the production of Danshen injection . Key words：ultrafiltration；endotoxins；effectual components；danshen injection 65 1 3 卷 辽 宁 中 医 药 大 学 学 报 公司）。原儿茶醛对照品（批号：1107492200511）、丹 参素钠对照品（批号：1107362200526）均购自中国 药品生物制品检定所。丹参药材（购于南京市药材 公司，经本校中药鉴定教研室吴启南教授鉴定为唇 形科植物丹参Salviamiltiorrhiza Bge.的干燥根及根 茎）。 2 方法与结果 2.1 溶液的制备 丹参注射液：称取丹参药材2kg，分别加10、8 倍量水煎煮2次，每次2h，合并2次上清液后浓缩 至相对密度1.2左右（70℃）的清膏，加入乙醇使醇 含量达70%，搅匀，静置，滤取上清液，回收乙醇，浓 缩至相对密度为1.0左右的清膏（70℃）。再加乙 醇使醇含量达85%，搅匀，静置，滤取上清液，加入 20%NaOH 溶液调pH至7左右，放置12h，减压回收 至无醇味，加注射用水配成2000mL（原液浓度为1 g生药/mL）。 2.2 丹参注射液的超滤 取药液原液，分别经5、10及50K截留分子量的 超滤膜超滤，待超滤完全后，取样超滤液。并按下式 计算各药液中细菌内毒素的去除率以及有效成分的 回收率。 Q＝（C原－C超）/C原×100% （1） 式中，C超为超滤液中细菌内毒素的含量（EU/ mL）；C原为药液原液中细菌内毒素的含量（EU/mL）。 R=C超/C原×100% （2） 式中，C超为超滤液中丹参注射液有效成分的含 量；C原为药液原液中丹参注射液有效成分的含量。 2.3 细菌内毒素的检测 2.3.1 标准曲线的绘制及其可靠性试验 用细菌内毒素检查用水将细菌内毒素工作标 准品溶解并稀释，配制成内毒素浓度分别为2、0.5、 0.125、0.03125EU/mL的标准溶液系列，各取0.1mL， 分别加到预先加有0.1mL鲎试剂溶液的反应管内， 混合均匀，插入细菌内毒素定量检测仪内进行检测， 其中每一浓度重复3管，并同时作阴性对照3管。以 细菌内毒素浓度c为横坐标，反应时间t的对数为 纵坐标，按最小二乘法进行统计分析，得标准曲线 为：LogT＝3.0226-0.3258LogC，r=-0.9995。结果 表 关于同志近三年现实表现材料材料类招标技术评分表图表与交易pdf视力表打印pdf用图表说话 pdf 明，内毒素浓度在2~0.03125EU/mL时，反应时间在 840~3357s之间，而阴性对照管反应时间大于标准 曲线最低浓度的反应时间，故标准曲线成立。 2.3.2 干扰实验及内毒素定量测定 分别将各样品药液用细菌内毒素检查用水稀 释一定倍数，以此稀释液作为供试液（NPC），同时 分别将此倍数稀释液配制成含内毒素标准品0.5EU/ mL的溶液，作为阳性对照（PPC）。分别取上述溶液 0.1mL加到预先加有0.1mL鲎试剂反应管内，混匀， 插入细菌内毒素定量检测仪内进行检测，其中每一 浓度重复2管。按照下式计算回收率：R＝（CPPC－ CNPC）/λm×100%式中，CPPC为样品阳性对照液 中细菌内毒素的含量，CNPC为样品液中细菌内毒 素的含量，内毒素含量单位为EU/mL。λm为标准 曲线中点或一个靠近中点的内毒素浓度，即0.5 EU/ mL。当细菌内毒素的回收率在50%~200%之间，则 认为在此试验条件下供试品溶液不存在干扰作用。 取平均回收率在50%~200%之间，且更接近于100% 的稀释倍数时所测的内毒素值作为样品中内毒素的 含量。 2.4 含量测定 2.4.1 色谱条件 色 谱 柱：Waters Symmetry C18柱（4.6mm× 150mm，5μm）；流动相：甲醇-0.1%三氟乙酸水；流 速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：280nm；进样 量：10μL，梯度洗脱程序，见表1。 表1 梯度洗脱程序 时间（min） 甲醇（%） 0.1%三氟乙酸（%） 0 15 85 35 55 45 40 70 30 55 100 0 60 100 0 2.4.2 对照品及供试品溶液的制备 精密称取干燥至恒重的丹参素钠、原儿茶醛的 对照品适量，加甲醇稀释至刻度，制成混合标准液。 取每次超滤前原液和超滤后滤液适量作为供试品溶 液待测。 2.4.3 测定法 精密吸取各供试液10μL注入高效液相色谱仪 中分析，计算各供试品中丹参素钠和原儿茶醛的峰 面积。 2.5 实验结果 2.5.1 细菌内毒素的去除 经不同截留分子量超滤膜超滤后，各样品液中 细菌内毒素的含量及内毒素的去除效率，见表2。 表2 超滤法去除细菌内毒素的测定结果 药液 超滤膜截留分子量 内毒素的浓度（EU/mL）内毒素去除 效率（%）原液 超滤液 丹参注射液 5K 901.3 1.96 99.78 10K 914.0 6.8 99.25 50K 966.6 116.1 87.99 由表2可知，药液经不同孔径的超滤膜后，内毒 素含量均大幅度降低，其中10K和5K截留分子超滤 膜的去除率达到99%以上，能很好的去除丹参注射 液中的内毒素。相比而言50K截留分子量超滤膜的 去除效率不理想，在药液被严重污染时（内毒素含量 >900EU/mL），不能有效地将热原污染严重的丹参滴 注液中细菌内毒素控制在低水平。 2.5.2 丹参注射液中有效成分的回收率 经不同截留分子量超滤膜超滤后，丹参注射液 有效成分的回收率，见表3。 表3 丹参注射液有效成分的回收率（%） 丹参注 射液有 效成分 5 K截留分子量 10 K截留分子量 50 K截留分子量 丹参素钠 99.91 100.72 101.50 原儿茶醛 89.30 92.17 94.78 由表3数据分析超滤前后有效成分的回收率可 知，经３种不同截留分子量的超滤膜后，丹参注射液 中的丹参素钠的回收率均在99%以上，说明超滤对 丹参素基本无影响。经5、10、50K截留分子量超滤 膜超滤后丹参注射液中的原儿茶醛回收率分别为 89.30%、92.17%、94.78%，原儿茶醛受超滤膜截留分 66 第 1 3卷 第 2 期 2011 年 2 月 辽 宁 中 医 药 大 学 学 报 JOURNAL OF LIAONING UNIVERSITY OF TCM Vol. 13 No. 2 Feb .，2011 近年来学界对寰枕后膜相关疾病的临床报道 逐渐增多。文献多认为其病理解剖学基础是寰枕 筋膜中的寰枕后膜病变所致。有学者将其定义为 寰枕筋膜挛缩型颈椎病，但多数学者认为是寰枕筋 膜挛缩症。在论述此症时，多数学者认为是长期低 头伏案工作致使寰枕后膜挛缩，刺激、压迫其中的 血管神经在而引起以头昏、头晕、后枕疼痛为主要 表现的一种综合征。现多用针刀或针灸治疗，而在 其他治疗手段如推拿等的方法文献回顾时却鲜有 标准化、规范化的 操作规程 操作规程下载怎么下载操作规程眼科护理技术滚筒筛操作规程中医护理技术操作规程 报道，仅以寥寥数语带 过。为此，本文将在前人对于寰枕后膜挛缩症的基 础与临床研究的基础之上，就该病的彩色超声多普 寰枕后膜推拿松解术对椎动脉阻力指数的影响 于高潞，马桂敏，李茵，莫绍强，史华敬，王琳 （柳州市中医院，广西 柳州 545001） 摘 要：目的：观察寰枕后膜推拿松解术治疗寰枕后膜挛缩症的临床疗效。方法：利用2008年10月—2010年 5月本科收治寰枕后膜挛缩症患者60例，运用SPSS16.0随机分为治疗组和对照组，每组30例。治疗组采用寰枕后膜 松解术，对照组给予地塞米松和氯唑沙宗口服，10天为1个疗程，观察2个疗程。结果：治疗组椎动脉阻力指数改善 情况显著优于对照组（P<0.05）。结论：寰枕后膜推拿松解术可通过松解挛缩的寰枕后膜从而缓解椎动脉痉挛、降 低阻力指数、缓解临床症状。 关键词：推拿；寰枕后膜推拿松解术；寰枕后膜挛缩症 中图分类号：R244.1 文献标识码：B 文章编号：1673-842X (2011) 02- 0066- 02 收稿日期：2010-09-19 基金项目：广西中医药管理局中医药民族医药标准化研究项目（GZBZ0909） 作者简介：于高潞（1976-），男，广西柳州人，副主任医师，学士，研究方向：脊柱相关疾病。 Effects of Massage Lysis of Posterior Atlanto-Occipital Membrane Contracture Syndrom on Vertebral Artery Resistant Index YU Gao-Lu，MA Gui-min，LI Yin，MO Shao-Qiang，SHI Hua-Jing，WANG Lin （Liuzhou Hospital of Traditional Chinese Medicine，Liuzhou 545001，Guangxi，China） Abstract：Objective：To observe the effects of massage lysis of Posterior Atlanto-Occipital Membrane （PAM） syndrome on vertebral artery resistance index. Methods：60 patients in our division from Oct，2008 to May，2010 were randomly divided into two groups，treatment group（30 cases）and control group（30 cases）. The treatment group was treated respectly with massage lysis，the control group was treated with Dexamethasone Tablets and compound Chlorzoxazone tablets. 10 days was a course of treatment，two courses were observed. All the patients were followed up. Results：The index of the treatment group were improved distinctly higher than control group（P<0.05）. Conclusion：PAM massage lysis can relax contracture of PAM，lower resistance index and improve the clinical symptoms. Key words：massage；PAM massage lysis；PAM contracture 子量影响略大些。 3 讨 论 超滤过程中5、10K截留分子量的超滤膜对丹参 注射液中的内毒素去除明显，且对丹参素钠的透过 基本无影响，对原儿茶醛的透过影响较小，能用于实 际工艺中。 实验以自制丹参注射液经不同截留分子量的 超滤膜超滤，并以鲎试验动态浊度法定量检测注射 用药液超滤前后内毒素的含量，以此考察超滤技术 去除中药注射液中细菌内毒素的效果，从而指导超 滤技术在中药注射工艺中应用的实践，提高注射剂 的安全性。 目前临床应用的中药注射液生产工艺落后， 其中含有一些热原性成分，严重影响到用药安 全，中药注射剂的安全性问题已严重影响到注射 剂生产企业的经济效益，甚至对全国制药产业也 形成有力的冲击。一些注射剂老品种需再评价研 究，而超滤技术已成为中药注射剂生产中关键技 术环节，超滤技术能有效去除注射液中的热原， 但该技术对有效成分特别是一些大分子量物质 的影响尚不能完全确定，同时超滤膜的材质对热 原的去除和有效成分的截留亦会产生影响[3]。因 此在实际生产中选择超滤膜不仅要考虑膜的截 留量还要兼顾膜的材质。◆ 参考文献 [ 1 ] 尹楠，李红阳，彭国平，等.超滤法去除中药注射液中的细菌内 毒素[ J ] .中国医药工业杂志，2008，39 ( 12 )：927-929. [ 2 ] 刁丽辉，陈燕丹.丹参注射液细菌内毒素检查方法的建立[ J ] . 中国医院药学杂志，2004，24 ( 4 )：213-214. [ 3 ] 彭国平，郭立玮，徐丽华，等.超滤技术应用对中药成分的影响 [ J ] .南京中医药大学学报，2002，18 ( 6 )：339-341.